A Method for Measuring RNA N⁶-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

改良的 Northern 印迹技术的总体目标是测量 RNA 中的 N6-甲基腺苷、n6A 修饰并检测不同 RNA 中的修饰。这种方法可以帮助回答 RNA 表观遗传学作用的关键问题，例如 N6-甲基腺苷修饰。该技术的主要优点是它提供了 RNA 的有效分离、更好的实验设计标准化以及 RNA 中 n6A 修饰的清晰描述。

该方法可以深入了解 RNA 中的 n6A 修饰，也可以应用于具有不同检测抗体的其他 RNA 修饰。实验开始时，将核糖核酸酶去污溶液喷洒在纸巾上，并擦拭移液器和实验室工作台表面。用不含核酸酶的水润湿纸巾，然后再次擦拭移液器和实验室工作台表面。

获得维持在 4 摄氏度的 RNA 分离溶液，并将 1 毫升溶液添加到约 75 毫克小鼠组织中。使用顶置搅拌器匀浆组织。接下来，每 1 毫升样品匀浆添加 100 微升 1-溴-3-氯丙烷或 BCP。

用力摇动试管 15 秒，然后进行总 RNA 分离。使用分光光度计，通过记录 260 纳米和 280 纳米处的吸光度来确定 RNA 浓度。通过进行 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检查 RNA 样品质量。

用焦碳酸二乙酯或 DEPC 水冲洗所有电泳设备。将 2.5 克琼脂糖，然后 215 毫升 DEPC 水放入锥形瓶中，在微波炉中完全融化混合物。溶液融化后，加入 12.5 mL 10X MOPS 缓冲液。

以及 22.5 毫升 37% 甲醛到烧瓶中。然后用 1.5 毫米厚的梳子将溶液倒入电泳仪中。使用干净的梳子，将气泡推到凝胶的边缘。

让凝胶在室温下凝固。接下来，使用先前制备的 1X MOPS 电泳缓冲液冲洗凝胶孔并预电泳凝胶。将 RNA 样品加载到凝胶孔中，然后运行凝胶。

第二天，在紫外线下检查并拍摄凝胶。要准备转印，请切开凝胶并去除未使用的部分。制备 500 mL 10X 盐水柠檬酸钠或 SSC 缓冲液。

用 10X SSC 缓冲液洗涤凝胶两次。剪一张足够大的滤纸以覆盖凝胶。将四张滤纸剪成与凝胶相同的大小。

接下来，将一张带正电荷的尼龙膜剪成与凝胶相同的大小。在凝胶和膜上标记一个缺口作为标记，以确保正确的方向。将膜浸泡在 2X SSC 缓冲液中。

将 500 mL 10X SSC 缓冲液倒入转印盘中。将大滤纸片铺在玻璃板上，并用转印缓冲液润湿滤纸。然后用移液管擀开任何气泡。

将两张预切滤纸浸泡在转移缓冲液中，然后将它们放在滤纸的中心。去除所有气泡。然后将凝胶顶部朝下放在滤纸上，将膜放在凝胶顶部，确保凝胶的缺口和膜对齐。

接下来，将两张预切的滤纸放在膜的顶部。去除层之间的所有气泡。在凝胶周围贴上保鲜膜，以确保毛巾只吸收通过凝胶和膜的缓冲液。

然后将纸巾叠在滤纸上。在毛巾顶部放置一个超大的玻璃板，并在堆栈顶部放置一个重物，让 RNA 从凝胶转移到膜上过夜。转移后，在 2X SSC 缓冲液中保持膜湿润。

用 10X SSC 缓冲液浸入两张滤纸中，然后将滤纸放入 UV 交联剂中。确保 RNA 吸收面朝上，然后将膜放在滤纸的顶部。选择自动交联模式，然后按开始按钮开始照射。

使用 UV 凝胶图像捕捉器检查膜和凝胶，以确认 RNA 从凝胶转移到膜上。在室温下，将膜封闭在 TBST 缓冲液中的 5% 脱脂牛奶中 1 小时。将膜在 4 摄氏度的 m6A 抗体溶液中孵育过夜。

第二天，用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。接下来，将膜在 HRP 偶联的驴抗兔抗体溶液中在室温下孵育 1 小时。1 小时后，用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。

应用增强的化学发光底物。使用数字成像仪捕获化学发光。最后，进行 m6A 定量并使用图像测量相对 m6A 化学发光强度 J.小鼠肝脏 RNA 每隔 4 小时取样，并使用改良的 Northern 印迹技术进行研究。

清楚地检测到 rRNA 、 mRNAs 和小 RNAs 的甲基化。对来自野生型小鼠肝脏的总 RNA 和不含 rRNA 的代表性 m6A 印迹进行。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四天内完成。

发展后，这项技术为 RNA 表观遗传学领域的研究人员探索与昼夜节律和肥胖相关的对人类生理学的影响铺平了道路。