并行测量人原代细胞培养物中昼夜节律钟基因表达与激素分泌
2016年11月11日
在此，我们描述了并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外 通过连续细胞灌注实现同步化及流出液的收集
本实验的总体目标是并行评估体外培养和同步化的人类原代内分泌细胞的昼夜节律性生物发光及其分泌活性。该方法有助于研究细胞分泌的时间模式，以及细胞自主的昼夜节律钟如何调控这一过程。该技术的主要优势在于，可同时监测作为报告信号的昼夜节律性荧光素酶活性，并连续收集流出液以测定分泌激素和肌细胞因子的水平。为通过慢病毒转导将昼夜节律生物发光报告系统导入原代细胞，首先将含有30%至50%融合度人成肌细胞的3.5 cm培养皿转移至超净工作台。用2 mL生长培养基替换原有人成肌细胞培养基。随后通过移液器将慢病毒溶液加入培养皿中，使感染复数（MOI）达到3。在细胞培养箱中孵育过夜。次日更换培养基。为实现体外同步化，向每3.5 cm培养皿（含先前转染的原代细胞）的2 mL培养基中加入10 µM腺苷酸环化酶激活剂。在37 °C条件下孵育细胞60分钟。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究描述了监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及其分泌活性的方法。该方法包括通过慢病毒载体递送荧光素酶核心生物钟报告基因，随后进行体外同步化处理以及连续细胞灌流以收集培养基。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 时间生物学
背景
- 昼夜节律在细胞功能中起着至关重要的作用。
- 监测生物发光可以揭示细胞活动情况。
- 人胰岛细胞对胰岛素分泌至关重要。
- 原代肌管细胞对于研究肌肉生理学具有重要意义。
研究目的
- 研究昼夜节律与分泌活动之间的关系。
- 建立一种用于实时监测细胞功能的方法。
- 加深对人类细胞代谢过程的理解。
使用的方法
- 利用慢病毒基因递送系统实现荧光素酶报告基因的表达。
- 体外同步化细胞培养。
- 持续灌流以收集培养基。
- 通过生物发光检测评估昼夜节律。
主要结果
- 成功实现了对人胰岛细胞昼夜节律性生物发光的监测。
- 证实了原代肌管细胞的分泌活性。
- 建立了一种研究细胞节律的可靠方法。
- 揭示了昼夜节律生物学与细胞功能之间的相互关系。
结论
- 该研究提供了一种实时监测细胞活动的新方法。
- 研究结果有助于深入理解昼夜节律对代谢的影响。
- 在糖尿病研究和肌肉生理学领域具有潜在应用价值。
常见问题
行业重要性概述
在人类原代细胞培养物中并行测量生物钟基因表达与激素分泌，可直接探究人类内分泌系统和肌肉系统中时间调控机制。该方法通过将分子生物钟振荡器与功能性分泌输出相联系，提高了靶点验证的预测可信度。在发现阶段整合这些测量手段，有助于支持整个产品线中代谢与时间生物学项目的基于风险评估的推进。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过关联原代人源细胞中生物钟基因活性与激素及肌细胞因子的分泌，实现机制层面的风险评估。
- 通过干扰核心生物钟基因并定量下游分泌效应，支持靶点的功能性验证。
- 有助于提高针对代谢和内分泌靶点通路选择的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证且同步的原代细胞系统，用于稳健的检测方法开发。
- 提供基因表达和分泌活性的定量、时间分辨读数。
- 实现对化合物或遗传干扰在昼夜节律调控输出方面影响的可重复评估。
转化与临床前研究
- 利用原代胰岛细胞和肌肉细胞，将体外研究结果与疾病相关的人体生理学特征相一致。
- 通过将分子钟紊乱与功能性分泌表型相关联，支持转化生物标志物的发现。
- 在代谢和时间生物学研究中，实现从发现到临床前验证的连续性。
流程与工作流整合
该方法通过实现对人原代细胞中昼夜节律调控的假设验证，连接了早期发现与临床前研究，支持靶点验证和转化研究的连续性。
- 发现生物学：可直接检测昼夜节律基因功能及其对分泌通路的影响。
- 筛选：提供同步化、可直接用于检测的原代细胞模型，并生成用于化合物评价的定量结果。
- 分析：生成时间分辨的生物发光和分泌数据，以实现不同条件下可靠的统计学比较。
- 转化研究：在人类细胞中将分子钟紊乱与疾病相关的分泌表型相联系。
- 企业级复用：提供一个可重复使用的平台，用于评估多种原代细胞类型和靶点中的昼夜节律调控。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：在原代人源细胞中标准化长期、并行的测量工作流程。
- 战略价值：通过在疾病相关系统中关联分子与功能输出，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：实现对代谢与时间生物学项目的基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备慢病毒转导、原代细胞培养和生物发光检测方面的专业知识。
- 需要具备同步化灌流系统以及高灵敏度激素/肌因子检测方法的使用条件。
- 要求跨团队标准化操作，以确保时间序列数据的可重复性。
- 针对不同类型的原代细胞或分泌终点，可能需要进行方法优化。
- 每种应用均需验证长期培养条件及报告基因的稳定性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
