Name: 利用乙烯释放化合物，2-氯乙基膦酸，作为一种工具来研究细菌乙烯反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 了解利用2-氯乙基膦酸（CEPA）研究细菌乙烯反应的安全方法。该技术无需专用设备，可原位产生乙烯，适用于植物微生物相互作用及细菌纤维素生产研究。

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作者感谢 Dario Bonetta 博士提供了拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子，并在三重反应实验方面提供了技术支持，同时感谢 Simone Quaranta 在傅里叶变换红外光谱（FT-IR）方面的帮助。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（NSERC-DG）对 JLS 的资助，安大略省研究生奖学金（OGS）对 RVA 的资助，以及伊丽莎白二世科学与技术研究生奖学金（QEII-GSST）对 AJV 的资助。

1. 化学试剂
<ol>
	<li>配制500 mM CEPA（144.49 g/mol）溶液，以及含有500 mM NaCl（58.44 g/mol）和500 mM NaH2PO4·H2O（137.99 g/mol）的混合溶液，溶剂为酸化（pH 2.5）超纯水或0.1 N HCl。使用涡旋振荡器混合，直至溶液澄清。</li>
	<li>用相同溶剂对500 mM溶液进行连续10倍稀释，得到5 mM和50 mM的储备液。</li>
	<li>在超纯水中配制10 mM的1-氨基环丙烷羧酸（ACC；101.1 g/mol）溶液。</li>
	<li>将储备液过滤除菌，并分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>将纤维素酶过滤除菌，分装后于4 °C保存。</li>
</ol>
2. 验证2-氯乙基膦酸分解产生乙烯：三重反应检测法
<ol>
	<li>表面灭菌 拟南芥 使用气相法处理生态型哥伦比亚种子： 
	警告：以下步骤会产生有毒氯气。种子灭菌操作应在通风橱中进行。
	<ol>
		<li>取一个可密封的容器，深度足以容纳一个250 ml玻璃烧杯，用于种子灭菌，并将其置于通风橱中。</li>
		<li>添加 A. thaliana 将种子放入微量离心管中，并将管子置于管架上。将装有开口管的管架放入可密封的容器中。 
		注意：单个试管中的填充量不得超过一半，以便氯气能够渗透到底层种子。</li>
		<li>将一个含有100 ml商用漂白液的250 ml烧杯放入可密封容器中。小心地向漂白液中加入3 ml浓盐酸，然后立即用盖子密封容器。 
		警告：次氯酸钠与盐酸反应会产生有毒的氯气，用于种子表面灭菌。</li>
		<li>在通风橱中将种子置于氯气环境下孵育4小时。 
		注意：较长的灭菌时间会降低萌发效率。</li>
		<li>灭菌后，将微离心管置于通风橱中排气至少1小时，然后密封。次氯酸钠与盐酸混合液须在通风橱中放置至少24小时后方可丢弃。 
		注意：灭菌后的种子可在室温下保存，供立即使用。</li>
		<li>保持种子在 4 °C 用于长期保存。打开微量离心管前，先将种子恢复至室温，以防止冷凝。将种子避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4区段培养皿（90 × 15 mm）中制备琼脂平板：
	<ol>
		<li>准备 110 ml 培养基 A. thaliana 幼苗：1×Murashige和Skoog（MS）基本培养基15 (4.33 g/L)，含1% (w/v) 蔗糖和0.8% (w/v) 琼脂。用NaOH将MS培养基调至pH 6。</li>
		<li>制备100 ml用于CEPA降解的细菌培养基：Schramm和Hestrin（SH）培养基16 含1.5%（w/v）琼脂。用NaOH将SH培养基调节至pH 7。</li>
		<li>通过高压灭菌对培养基进行灭菌，并在水浴中平衡温度 55 °C 水浴锅</li>
		<li>MS琼脂冷却至适宜温度后，取40 ml加入无菌烧瓶中。为制备阳性对照培养基， A. thaliana 幼苗，向40 ml MS琼脂溶液中补充 40 µl 10 mM ACC 加入以获得最终浓度 10 µM ACC</li>
		<li>向分区培养皿的相应区域加入 5 ml 培养基（图1）并让琼脂凝固。所有平板均需制备三个重复。 
		注意：CEPA 直到实验方案的后期才添加到生长培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="含CEPA处理下MS和SH培养基条件下植物生长的培养皿示意图与结果。" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 使用CEPA进行三重反应测定所用琼脂平板的设置示意图。 图示为分别用于阴性对照（A）、阳性对照（B）和实验组平板（C）的四个象限布局。本图经Augimeri和Strap9修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>对 A. thaliana 种子进行分层处理以确保同步萌发：
	<ol>
		<li>在每个含有 MS 或 MS+ACC 琼脂的象限上分别放置约五十粒 A. thaliana 种子。确保种子均匀分布，以便于后续幼苗的取出与分析。</li>
		<li>将含有种子的培养皿在黑暗条件下于 4 °C 培养 3–4 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在细菌生长培养基（SH）上分解 CEPA 并进行三重反应测定：
	<ol>
		<li>分层处理后，将种子置于荧光灯下照射 2 小时。</li>
		<li>向实验组培养皿中含 SH 琼脂（pH 7；图 1）的各个象限分别铺加 10 µl 的 500 mM CEPA 储存液，使最终 CEPA 浓度达到 1 mM。</li>
		<li>用实验室封口膜密封培养皿，并用铝箔包裹以创造黑暗环境。</li>
		<li>将培养皿倒置（琼脂面朝下），在黑暗条件下于 23 °C 培养 3 天以促进种子萌发。 
		注意：培养皿可堆叠放置，但由于乙烯比空气轻，阴性对照组应置于最底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析三重反应测定数据：
	<ol>
		<li>使用经火焰灭菌的镊子，从对应各处理组的培养皿中取出单株幼苗，在解剖镜或数字 USB 显微镜下观察。确保幼苗根部对齐后拍照记录。</li>
		<li>从每个象限中取出 30 株幼苗（每生物学重复 60 株，每处理组共 180 株），在黑色背景表面上对齐排列，并与标尺一同拍照。</li>
		<li>使用 ImageJ 软件17测量重复幼苗的下胚轴长度（mm）。通过点击并拖动“直线”工具选择 10 mm 长度，然后在“分析”选项卡下选择“设置标尺”，将已知距离设为 10。使用“分段”工具点击并拖动以选择下胚轴长度，按 M 键测量距离。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验对生物学重复的均值进行比较。当 p &lt; 0.05 时，认为差异具有统计学意义。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细菌生长过程中 pH 的分析
<ol>
	<li>三重培养并定量 Komagataeibacter xylinus 起始菌液：
	<ol>
		<li>将单个 K. xylinus 菌落接种至 5 ml 添加了 0.2% (v/v) 过滤除菌纤维素酶的 SH 培养基（pH 5）中。在 30 °C、150 rpm 振荡条件下培养，直至 OD600 达到 0.3 至 0.4（约 72 小时）。</li>
		<li>通过离心（2,000 x g；4 °C；10 分钟）收集起始菌液。用 5 ml 无菌的 0.85% (w/v) NaCl 溶液洗涤细胞两次，并重悬菌体沉淀。将细胞置于冰上保存。</li>
		<li>使用 Petroff-Hausser 计数室对细胞进行定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种用于 pH 分析的培养物：
	<ol>
		<li>在十二个带铝箔封口的 500 ml 三角瓶中，各加入 150 ml 添加了 0.2% (v/v) 过滤除菌纤维素酶的 SH 液体培养基（pH 7）。以 105 个细胞/ml 的浓度将 K. xylinus 起始菌液接种至各瓶中。利用三个起始菌液，每种处理设置三个生物学重复。</li>
		<li>向培养物中分别添加 300 µl 的 5、50 或 500 mM CEPA 储存液，使最终 CEPA 浓度分别为 0.01、0.1 和 1.0 mM。向未处理的对照组培养物中加入 300 µl 溶解 CEPA 所用的溶剂。</li>
		<li>用胶带将铝箔封口紧密封住三角瓶，并在 30 °C、150 rpm 振荡条件下培养 14 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天从每个三角瓶中无菌取出 5 ml 样品，通过离心（2,000 x g；4 °C；10 分钟）收集菌体沉淀。将上清液转移至洁净离心管中，并使用 pH 计测定每个生物学重复的 pH 值。</li>
	<li>通过绘制生物学重复的平均 pH 值随时间变化曲线来分析时间序列数据。 
	注意：培养液 pH 不应低于 3.5；当培养液 pH 为 5 时，CEPA 释放乙烯的效率显著降低，而 pH 低于 3.5 时则完全抑制乙烯的释放。</li>
	<li>为控制氯离子和磷酸盐浓度的影响，使用 5、50 和 500 mM 的 NaCl-NaH2PO4 储存液分别配制 0.01、0.1 和 1.0 mM 的溶液，进行相同的实验。</li>
</ol>
4. 菌落形态
<ol>
	<li>以三组平行样培养K. xylinus起始菌液：
	<ol>
		<li>将单个K. xylinus菌落接种至5 ml SH培养基（pH 5）中，培养基中添加0.2%（v/v）经滤膜除菌的纤维素酶。在30 °C、150 rpm振荡条件下培养，直至OD600达到0.3至0.4（约72小时）。</li>
		<li>通过离心（2,000 × g；4 °C；10分钟）收集起始菌液，用5 ml无菌生理盐水洗涤菌体，并重悬菌体沉淀。将菌悬液置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备24个琼脂平板，每板含25 ml SH（pH 7）培养基，其中添加1.5%（w/v）琼脂。</li>
	<li>待琼脂凝固后，分别在平板上均匀涂布50 µl的5、50和500 mM CEPA储备液，使CEPA终浓度分别为0.01、0.1和1.0 mM。设置未处理对照组和溶剂对照组，前者不添加任何物质，后者涂布50 µl用于溶解待测化合物的溶剂。</li>
	<li>用接种环蘸取一环（约5 μl）K. xylinus起始菌液，在平板上划线分离单菌落，并用封口膜密封平板。所有处理均设置三组重复。于30 °C培养5天。</li>
	<li>使用数字USB显微镜在20倍放大下拍摄菌落图像，并对固体培养基上菌落的形态特征及纤维素产生情况进行定性评估。 
	注意：纤维素在菌落边缘呈现为模糊状物质。</li>
	<li>为控制氯离子和磷酸盐浓度的影响，使用NaCl-NaH2PO4溶液进行相同实验，分别以5、50和500 mM储备液配制终浓度为0.01、0.1和1.0 mM的处理组。</li>
</ol>
5. 菌膜分析
<ol>
	<li>以三组平行样培养并定量 K. xylinus 起始菌液：
	<ol>
		<li>取单菌落 K. xylinus，分别接种至 5 ml 添加了 0.2% (v/v) 过滤除菌纤维素酶的 SH 培养基（pH 5）中，共设三组平行样。于 30 °C、150 rpm 振荡培养约 72 小时，直至 OD600 达到 0.3 至 0.4。</li>
		<li>将起始菌液以 2,000 × g、4 °C 离心 10 分钟收集菌体。用 5 ml 无菌生理盐水洗涤菌体两次，并重悬菌体沉淀。将菌悬液置于冰上保存。</li>
		<li>使用 Petroff-Hausser 计数板对菌体进行定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备接种用母液并分装至 24 孔板：
	<ol>
		<li>向 60 ml SH 培养基（pH 7）中分别加入 120 µl 的 5、50 和 500 mM CEPA 储液，使最终 CEPA 浓度分别为 0.01、0.1 和 1.0 mM。另取 60 ml SH 培养基（pH 7）加入 120 µl 溶解 CEPA 所用的溶剂作为对照。涡旋混匀。</li>
		<li>将每种含 CEPA 的 60 ml 培养基均分为四份，每份 14 ml。其中三份分别接种起始菌液的三个生物学重复，使菌体终浓度为 105 个细胞/ml。将含菌的试管置于冰上，以抑制纤维素的生成。 
		注：剩余的一份 14 ml 培养基用于设置无菌对照孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种 24 孔板：
	<ol>
		<li>每种处理单独使用一块 24 孔板，每板包含三行生物学重复孔和一行无菌对照孔（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="微生物培养实验示意图；方法：接种细胞、培养、分析菌膜。" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：菌膜检测与分析所用方案的流程图。 将补充了CEPA的pH 7 SH培养基原液（60 ml）分装为三份独立的生物学重复接种样本和一份无菌对照样本（每份14 ml）。随后将这些培养物分装至24孔板中，每份设六个技术重复（每孔2 ml），并用石蜡膜密封。在30 °C下培养7天后，收集菌膜并通过测定湿重、厚度、干重以及傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析结晶度对其进行表征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本</a>
<ol start="2" style="margin-left: 40px;">
	<li>使用14 ml主混合液，向无菌24孔板的每六个孔中各加入2 ml。对三个生物学重复和无菌对照组进行相同操作（图2）。每种处理均需重复此步骤。</li>
	<li>用石蜡膜密封培养板，在30 °C下静置培养7天。</li>
</ol>
<ol start="4">
	<li>收集并测定菌膜湿重、厚度、干重（纤维素产量）及结晶度（图2）：
	<ol>
		<li>按压菌膜一侧，使对侧边缘翘起，用镊子取出单个菌膜。在夹持状态下，将其置于洁净的纸巾上3秒，以去除多余培养基，随后称重以测定湿重。</li>
		<li>将菌膜紧靠直尺摆放，并使用高分辨率数码相机从侧面拍摄照片。</li>
		<li>利用ImageJ软件17，测量每个菌膜左侧肩部、右侧肩部及中心位置的厚度。对每个生物学重复的技术重复测量值取平均。</li>
		<li>将菌膜分别转移至6孔板的孔中，每孔加入12 ml 0.1 N NaOH，于80 °C处理20分钟以裂解细胞。</li>
		<li>移除NaOH溶液，用超纯水振荡洗涤菌膜24小时以中和残留碱液，每6小时更换一次水。 
		注意：洗涤完成后，菌膜应呈白色。</li>
		<li>将菌膜置于硅胶垫上，在50 °C下干燥48小时至恒重。干燥后从垫上取下，用分析天平称重，以确定细菌纤维素产量。</li>
		<li>采用傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）分析菌膜结晶度，扫描32次，分辨率设为4 cm-1，波数范围为4,000至650 cm-1。根据先前描述的方法18，通过A1437/A895计算结晶度指数CI(IR)，即“结晶带”与“非晶带”吸光度比值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为控制氯离子和磷酸盐浓度，分别使用5 mM、50 mM和500 mM的NaCl-NaH2PO4储备液配制0.01、0.1和1.0 mM的工作液，进行相同的实验。</li>
	<li>分析菌膜数据：
	<ol>
		<li>通过计算菌膜湿重与干重之差，确定其含水量。</li>
		<li>对所有技术重复的数值取平均，为每个生物学重复获得单一数值用于统计分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验进行组间比较。当p &lt;0.05时，认为差异具有统计学意义。</li>
		<li>将数据标准化为未处理对照组的百分比，并绘制生物学重复的均值图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法概述了 原位 利用模式生物研究细菌乙烯响应时由CEPA产生乙烯的方法 K. xylinus该方法非常有用，因为只要水相介质的pH值大于3.5，即可通过添加物质产生乙烯。10,11 CEPA 的使用避免了对纯乙烯气体或专用实验室设备的需求。该方法不仅限于研究 CEPA 衍生乙烯对细菌的影响，还可经适当调整用于研究真核生物对乙烯的响应。必须同时开展磷酸盐和氯化物的平行对照实验，因为这些化合物也会在 CEPA 分解过程中产生。 原位另一个必要的对照是确定CEPA本身是否对所研究的微生物培养物产生直接作用。当产生生理学上无关的乙烯浓度时 K. xylinus 培养物在pH 5的SH培养基中培养，因此可作为CEPA效应的对照9然而，该方法仅适用于耐酸生物。
在水性生长培养基中使用CEPA衍生的乙烯进行生物学研究时，需要验证系统内确实产生了乙烯。本文所述方法利用拟南芥（A. thaliana）三重反应检测法，该方法基于暗培养幼苗在乙烯存在下表现出的三...

乙烯（C2H4）作为一种植物激素，最早于1901年被发现。当时观察到，在使用煤气灯照明的实验室中生长的豌豆幼苗表现出异常形态，其茎（下胚轴）比正常豌豆幼苗更短、更粗，并且横向弯曲；这种表型后来被称为“三重反应”1,2。后续研究表明，乙烯是一种重要的植物激素，可调控多种发育过程，如生长、应激反应、果实成熟和衰老3。Arabidopsis thaliana（拟南芥）是植物生物学研究中的模式生物，其对乙烯的响应已被广泛研究。研究人员利用在乙烯存在下暗培养的A. thaliana幼苗所表现出的三重反应表型，分离出了多个乙烯响应突变体1,4,5。植物中乙烯生物合成的前体物质是1-氨基环丙烷羧酸（ACC）6，在三重反应实验中常被用来提高植物内源乙烯的生成，从而诱导出三重反应表型1,4,5。
尽管植物中的乙烯响应已被广泛研究，但外源乙烯对细菌的影响却鲜有报道，尽管细菌与植物关系密切。一项研究报道，某些 假单胞菌 菌株可利用乙烯作为唯一的碳源和能源而存活7然而，仅有两项研究表明细菌会对乙烯产生响应。第一项研究显示，某些菌株 铜绿假单胞菌, P. fluorescens, P. putida，以及 P. syringae 使用琼脂糖凝胶塞实验检测趋化性，其中将熔化的琼脂糖与经纯乙烯气体平衡的趋化缓冲液混合8然而，据我们所知，目前尚无进一步使用纯乙烯气体来表征细菌乙烯响应的报道，这可能是因为在缺乏专用设备的情况下，实验室中处理气体存在困难。第二项关于细菌乙烯响应的研究表明，乙烯能够增加与果实相关的细菌的纤维素产量，并影响其基因表达。 Komagataeibacter （前身为 Gluconacetobacter) xylinus9在此情况下，使用乙烯释放化合物2-氯乙基膦酸（CEPA）来产生乙烯 原位 在细菌培养基中，无需使用纯乙烯气体或专用设备。
CEPA 在 pH 3.5 以上时以 1:1 的摩尔比产生乙烯10,11 通过碱催化的一级反应12-14CEPA的降解与pH值和温度呈正相关。13,14 并产生乙烯、氯化物和磷酸盐。对于研究细菌对乙烯反应的科研人员而言，CEPA 提供了一种便捷的替代气态乙烯的方法。
以下方案的总体目标是提供一种简单高效的方法来研究细菌对乙烯的响应，包括验证在细菌培养基中由CEPA分解产生的生理相关水平的乙烯产量，分析培养物的pH值以确保细菌生长过程中CEPA的分解不受影响，以及评估乙烯对细菌形态和表型的影响。我们以K. xylinus为例演示这些实验方案，但通过使用适当的培养基和表型分析方法，这些方案也可适用于研究其他细菌的乙烯响应。

<table><tbody><tr><td>1-氨基环丙烷羧酸（ACC）</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>植物中乙烯的生物合成前体</td></tr><tr><td>四分区培养皿</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>用于三重反应测试</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>用于固化培养基</td></tr><tr><td>佳能 Rebel T1i 数码单反相机</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>用于拍摄菌膜图像</td></tr><tr><td>来自里氏木霉 ATCC 26921 的纤维素酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>水溶液</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>用于 SH 培养基</td></tr><tr><td>市售漂白剂</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>用于种子灭菌</td></tr><tr><td>浓盐酸</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>用于调节 pH</td></tr><tr><td>数字 USB 显微镜</td><td>Plugable</td><td>N/A</td><td>用于拍摄菌落图像</td></tr><tr><td>乙烯利（&amp;ge;96%；2-氯乙基膦酸）</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>释放乙烯的化合物</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>用于 SH 培养基</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>产细菌纤维素的α-变形菌</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1.7 ml 微量离心管</td></tr><tr><td>Murashige 和 Skoog（MS）基础培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>拟南芥生长培养基</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>七水合磷酸氢二钠，用于 SH 培养基</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>氯化钠，用于生理盐水和对照溶液</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>一水合磷酸二氢钠，用于对照溶液</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>氢氧化钠，用于调节 pH</td></tr><tr><td>石蜡膜</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>用于密封培养皿和烧瓶</td></tr><tr><td>蛋白胨（细菌学用）</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>用于 SH 培养基</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser 计数室</td><td>Hausser Scientific</td><td>3900</td><td>细菌细胞计数室</td></tr><tr><td>聚醚砜灭菌滤膜，0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>用于纤维素酶的灭菌过滤</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>用于 MS 培养基的蔗糖</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>用于 SH 培养基</td></tr></tbody></table>

利用乙烯释放化合物2-氯乙基膦酸作为研究细菌乙烯反应的工具

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

乙烯（C2H4）是一种气态植物激素，参与调控植物发育的多个方面，在衰老和果实成熟过程中起主导作用。在植物早期发育阶段施加外源乙烯会引发“三重反应”表型，表现为下胚轴变短变粗，并伴有明显的顶端弯钩。尽管植物与细菌之间存在密切关系，但外源乙烯对细菌的影响却长期被忽视。部分原因在于实验室中若无专用设备，难以精确控制气态乙烯的浓度。2-氯乙基膦酸（CEPA）是一种可在pH值≥3.5的水溶液中分解为乙烯、氯离子和磷酸盐的化合物，其摩尔比为1:1:1:1。本文介绍了利用CEPA原位生成乙烯的方法，以果生纤维素产生菌Komagataeibacter xylinus为模式生物，研究细菌对乙烯的响应。本文所述实验方案包括：通过拟南芥（Arabidopsis thaliana）三重反应实验验证CEPA释放乙烯的效果，以及外源乙烯对K. xylinus纤维素产量、菌膜特性及菌落形态的影响。这些方案可结合适当的培养基和表型分析方法，推广应用于其他微生物的乙烯效应研究。使用CEPA为研究人员提供了一种简单高效的替代方案，可用于常规检测细菌对乙烯的响应，无需依赖纯乙烯气体。

在SH培养基（pH 7）中通过三重反应测定法验证CEPA释放乙烯的示意图板设置如图所示 图1A-C显示浮膜培养实验流程的流程图如图所示。 图2. 暗处培养的 A. thaliana 幼苗在含有ACC或通过CEPA在SH培养基（pH 7）中分解产生乙烯的条件下表现出三重反应表型（下胚轴更短更粗，顶端弯钩加剧），但在未处理条件下不表现该表型 (图3A)9ACC 和 CEPA 处理产生的乙烯对下胚轴长度的影响 A. thaliana 种子显著地（p &lt; 0.0001）短于未经处理的对照组（图3B)9，证实乙烯在SH培养基（pH 7）上以生理相关浓度从CEPA释放。未处理组与CEPA处理组的pH值 K. xylinus 培养物的值保持在5以上...

本文所述方案通过使用2-氯乙基膦酸（CEPA）便捷地研究细菌对乙烯的响应。乙烯的产生 原位 通过CEPA在水性细菌培养基中的分解，避免了对纯乙烯气体的需求。

乙烯（C2H4）是一种气态植物激素，参与植物发育的多个方面，在衰老和果实成熟过程中起主导作用……

本实验的总体目标是提供一种简单且安全的方法，用于研究细菌对乙烯的响应。该方法将解答有关植物-微生物相互作用的关键问题，例如乙烯在细菌对植物的黏附与定殖过程中的作用。该技术的主要优势在于无需任何专用设备，且比在实验室中操作气态乙烯安全得多。尽管该方法可揭示乙烯对细菌纤维素产生过程的影响，也可应用于其他与植物相关的微生物，用于体外研究乙烯介导的过程在植物定植中的作用。实验准备阶段，配制 100 毫升拟南芥幼苗生长培养基，以及 100 毫升用于 CEPA 分解的细菌生长培养基。待拟南芥培养基冷却至室温后，将其中 40 毫升转移至无菌烧瓶中，并向该等分试样中添加 40 微升 10 毫摩尔的 ACC。现在，向每个平板的四个象限中加入5毫升培养基，静置使琼脂凝固。所有平板的对向象限分别含有细菌生长培养基和拟南芥培养基。采用三种不同的培养基配置方式。CEPA处理将在后续的实验方案中进行。每种培养皿配置均需设置三个重复。待琼脂冷却后，将约50粒种子均匀分布在拟南芥培养基的每个象限中。然后，将培养皿置于黑暗条件下，在4°C孵育3至4天。随后，在种子孵育完成后，将其暴露于荧光灯下照射2小时。接着，将10微升500毫摩尔的CEPA储备溶液均匀涂抹于一个培养皿构型的细菌琼脂表面。琼脂中的最终CEPA浓度将为1毫摩尔。现在，用实验室封口膜密封所有培养皿，并用铝箔包裹。然后，将培养皿置于23摄氏度的黑暗环境中，琼脂面朝下，静置培养三天，以促进种子萌发。种子萌发后，使用经火焰灭菌的镊子移除各处理对应的幼苗。从每个象限中选取30株幼苗，每种处理共选取180株。将幼苗置于黑色背景上，旁边放置标尺以提供比例参照，使用解剖显微镜或高分辨率数码相机拍摄图像。然后，使用 ImageJ 软件测量其下胚轴长度。利用直线工具测量 10 毫米，并在“分析”选项卡下选择“设置标尺”以设定标尺。接着，使用直线工具下的“分段”工具测量每个下胚轴，并按 M 键以计算其长度。菌膜分析是细菌纤维素产量的标准分析工具。pH值和形态学分析详见性别实验方案。实验前，需从起始培养物中三份平行收获细胞，并使用佩特里夫-豪泽计数室对细胞进行定量。然后，配制四种不同CEPA浓度的培养基母液。对于每种母液，量取60毫升pH 7的SH培养基，并分别加入120微升浓度为0、5、50或500毫摩尔的CEPA储备液，以获得终浓度分别为0、0.1、0.1或1.0毫摩尔的CEPA。通过轻轻摇动烧瓶混匀这些培养基。每组三个重复实验各需一套培养基，另需第四套作为无菌对照。因此，将每份60毫升的培养基分为四份，每份14毫升。然后，在接种相应的起始培养物之前，先将14毫升的培养基预冷，使其最终浓度为每毫升10万个细胞。将所有接种后的试管置于冰上，以防止纤维素产生。将剩余的14毫升上清液用于无菌对照孔。现在，从每份14毫升的母液中，取2毫升上清液加入到一个无菌的24孔板的六个孔中，每种起始培养物共需制备四个加样板。用石蜡膜小心密封培养板，并在30摄氏度下静置培养七天。在培养期间，同时平行培养25毫升液体培养物，以定期测量培养基的酸度。如果酸度降至pH 5以下，则该生物体的生长将抑制CEPA分解为乙烯，因此不适合本检测。一周后，收获并测量菌膜的湿重、厚度、干重和结晶度。从培养板上采集菌膜时，按压菌膜一侧以抬高对侧边缘，用镊子夹取菌膜。在保持夹持状态下，将其置于一张新的纸巾上3秒，以去除多余培养基。然后，称量每一块菌膜的重量，并记录为湿重。接着，将菌膜沿直尺对齐，并使用高分辨率数码相机从侧面拍摄照片。通过这些照片分析菌膜的厚度。接下来，将菌膜逐个转移至六孔板的孔中。加入12毫升0.1当量的氢氧化钠，在80摄氏度下处理20分钟以裂解细胞。然后，移除氢氧化钠溶液，并在六孔板中加入12毫升超纯水，振荡条件下充分洗涤24小时，以中和处理后的菌膜。孵育期间，每6小时更换一次水。孵育结束后，菌膜应呈白色。随后将菌膜置于硅胶垫上，在50摄氏度下干燥48小时，以备干重测定。可以使用傅里叶变换红外光谱法分析菌膜的结晶度。在SH培养基中，黑暗培养的拟南芥幼苗在存在ACC以及CEPA分解产生乙烯的条件下，表现出三重反应表型，即下胚轴短而粗，并伴有明显的顶端弯钩；但在未处理条件下则无此表型。显然，经处理种子的下胚轴长度显著短于未处理的对照组。因此，CEPA在SH培养基上以生理相关浓度释放乙烯。所有浓度的CEPA衍生乙烯均显著降低菌膜湿重，但对菌膜厚度无影响；所有浓度的CEPA衍生乙烯均显著增加菌膜干重。此外，各浓度CEPA衍生乙烯均降低了菌膜含水量。在进行该实验操作时，重要的是要测定培养基的pH值，以确保pH不低于5，从而避免CEPA降解为乙烯的过程受到抑制。请牢记，CEPA粉末对黏膜具有极高危害性。在执行本实验方案时，务必始终采取适当的防护措施。该技术将使关注植物与细菌相互作用的研究人员能够安全地在体外探究乙烯介导的响应，有助于阐明植物信号如何调控细菌的定植与黏附。目前，这一领域尚未得到充分研究。

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科研

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生物化学

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