Name: 使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳人的MxA多亚基蛋白复合物的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析技术，直接从A549细胞裂解液中评估MxA蛋白的寡聚状态。该方法无需纯化蛋白复合物，适用于大多数实验室进行细胞生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由瑞士国家科学基金会（资助号：31003A_143834）向 JP 提供的资助支持。

注意：本方案基于先前发表的非变性 PAGE 方案12。在该研究中，通过过表达 MxA 的 Vero 细胞或经 IFN-α 刺激后表达内源性 MxA 的 A549 细胞评估了 MxA 蛋白的寡聚状态。下述方案可用于分析除 MxA 外任何蛋白的寡聚状态，但可能需要进一步优化。
1. 非变性PAGE用细胞裂解液的制备
注意：为了分析Vero或A549细胞中人MxA蛋白的寡聚状态，需收集1.0 × 106个细胞。根据细胞类型或待分析蛋白的丰度，应相应调整细胞数量。此外，在加入对光敏感的碘乙酰胺后，必须注意避免裂解缓冲液暴露于光照下。
<ol>
	<li>将 A549 或 Vero 细胞以每孔 0.3 × 106 个接种至 6 孔板中。每孔加入 2 ml 生长培养基（见表 1）。在细胞培养箱中孵育过夜（37 °C，5% CO2）。</li>
	<li>用 1 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入 0.5 ml 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）1× 溶液，在室温下作用约 5 分钟以使细胞脱落。</li>
	<li>一旦细胞从培养皿上脱落，立即加入 0.5 ml 生长培养基，并通过上下吹打轻轻混匀。</li>
	<li>将每孔的细胞转移至一个 2 ml 离心管中，使用台式离心机离心收集细胞沉淀（5,000 × g，4 °C，5 分钟）。</li>
	<li>用移液器小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>用 1 ml 冰冷的 PBS 洗涤细胞，通过上下吹打轻轻重悬细胞悬液。</li>
	<li>在台式离心机中离心收集细胞（5,000 × g，4 °C，5 分钟）。</li>
	<li>用移液器小心吸除上清液，避免使细胞沉淀脱落。</li>
	<li>用 200 μl 冰冷的裂解缓冲液（见表 1）通过上下吹打重悬细胞，并置于冰上。</li>
	<li>立即用锡箔纸包裹离心管以避光，并在冰上孵育 30 分钟。 
	注意：在冰上孵育 30 分钟后，不再需要对裂解液进行避光保护，因为游离巯基的保护反应已不可逆。</li>
	<li>在预冷的台式离心机中离心去除细胞碎片（13,000 × g，4 °C，20 分钟）。</li>
	<li>在离心过程中，将透析柱于 4 °C 冷室中用透析缓冲液（表 1）平衡 20 分钟。使用截留分子量为 10,000 的透析柱。
	<ol>
		<li>将透析柱固定在浮力支架上，并放入盛有透析缓冲液的烧杯中。为确保轻柔搅拌，使用磁力搅拌器。切勿触碰透析膜。 
		注意：透析柱可直接购买，也可根据 Fiala 及其同事19描述的方法用 1.5 ml 离心管自行制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从透析缓冲液和浮力支架上取下透析柱。用移液器将澄清的裂解液转移至已准备好的透析柱中，避免接触透析膜。将透析柱重新固定在浮力支架上，并放回盛有透析缓冲液的烧杯中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，将裂解液在含有冰冷透析缓冲液（表 1）的烧杯中透析至少 4 小时（或更佳为过夜），同时使用磁力搅拌器轻柔搅拌。每 200 µl 裂解液体积应使用至少 100 ml 透析缓冲液。</li>
	<li>将透析后的样品转移至 1.5 ml 离心管中。在台式离心机中离心去除沉淀（13,000 × g，4 °C，20 分钟）。为防止寡聚蛋白复合物解离，透析后应立即进行后续实验步骤（第 2 节）。切勿冷冻已制备的裂解液。</li>
</ol>
2. 电泳
注意：电泳操作按照先前所述方法进行，但略有修改22。在下述方案中，使用了预制的梯度凝胶（4–15% 梯度）。或者，凝胶也可在实验室中自行制备。必须避免使用任何变性剂（如SDS），以防止寡聚蛋白复合物解离，这一点至关重要。电泳时间已针对人MxA蛋白的不同寡聚状态进行了优化。然而，对于其他蛋白，电泳时间可能有所不同，具体取决于寡聚复合物的大小以及分析复合物所需达到的分离范围。因此，最佳电泳时间应通过实验确定。为了获得待分析寡聚体的最佳分辨率，电流不应超过25 mA。
<ol>
	<li>在凝胶室中组装非变性PAGE凝胶。向内槽和外槽中加入预冷的电泳缓冲液（表1）。</li>
	<li>在4 °C的冷室中，使用预冷的运行缓冲液以每块凝胶25 mA的电流预电泳15分钟。</li>
	<li>取15 µl上述制备的裂解液与5 µl 4x上样缓冲液（表1）混合。样品勿需煮沸。</li>
	<li>每孔上样15 µl样品，并同时加载选定的天然蛋白标准品。在4 °C冷室中以25 mA电流电泳运行4小时。 
	注意：对于半定量分析，可进行蛋白定量实验（例如 Bradford蛋白测定法23），以确保每泳道上样等量的总蛋白。</li>
</ol>
3. 蛋白质印迹
注意：以下描述的是湿转 Western 印迹系统的操作步骤。可使用任何类型的印迹膜。在将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于印迹缓冲液中平衡之前，需先将其在100%甲醇中活化。也可采用半干转 Western 印迹技术，但该方法需要针对较大的寡聚复合物进行优化。
<ol>
	<li>拆卸凝胶，并小心将其转移至 SDS 缓冲液中（表 1）。</li>
	<li>室温下轻轻振荡孵育 10 分钟。</li>
	<li>每块凝胶准备 2 块海绵、4 张纤维素滤纸和 1 张转印膜。将其浸泡于转印缓冲液中（表 1）。</li>
	<li>按以下顺序组装“三明治”结构（从下至上）：1 块海绵、2 张纤维素滤纸、转印膜、凝胶、2 张纤维素滤纸、1 块海绵。</li>
	<li>将“三明治”结构放入转印槽中。确保转印膜朝向正极，凝胶朝向负极。</li>
	<li>用预冷的转印缓冲液充满转印槽。</li>
	<li>在 4 °C 下以 90 mA 恒流转印过夜，以获得最佳的蛋白转移效果。</li>
	<li>拆开“三明治”结构，将膜在 Ponceau S 溶液中孵育 5 分钟（室温），以显影蛋白标准品。</li>
	<li>用去离子水小心漂洗，去除 Ponceau S 染色液，直至清晰可见蛋白标准品的条带。</li>
	<li>使用记号笔标记蛋白标准品的条带。 
	注意：残留的 Ponceau S 可能干扰后续免疫染色。为避免此问题，可将膜在 0.1 M NaOH 中孵育 1 分钟，随后用去离子水充分洗涤，以进一步脱色。</li>
	<li>用封闭缓冲液（见 表 1）在室温下封闭至少 1 小时，或在 4 °C 下封闭过夜。</li>
	<li>使用针对目标蛋白的特异性抗体，通过免疫染色法检测目的蛋白。 
	注意：人 MxA 蛋白的检测使用兔多克隆抗体（抗人 Mx1 抗体），按 1:1,000 比例稀释于封闭缓冲液中（表 1），4 °C 孵育过夜。也可选用单克隆抗 MxA 抗体（克隆 143）（数据未显示）24。</li>
</ol>

<ol><li>Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine+zipper-mediated+homo-oligomerization+regulates+the+Rho-GEF+activity+of+AKAP-Lbc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc.</a> J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).</li>
<li>Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+cell-cell+adhesion+by+classical+cadherins%3A+Critical+role+for+low-affinity+dimerization+through+beta-strand+swapping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).</li>
<li>Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TBP+dimerization+in+preventing+unregulated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression.</a> Mol Cell. 3, 717-727 (1999).</li>
<li>Torshin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+oligomerization+as+intermediate+level+of+signal+transduction%3A+analysis+of+protein-protein+contacts+and+active+sites+in+several+glycolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes.</a> Front Biosci. 4, 557-570 (1999).</li>
<li>Goodsell, D. S., Olson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+symmetry+and+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Structural symmetry and protein function.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).</li>
<li>Flydal, M. I., Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine+hydroxylase%3A+function%2C+structure%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation.</a> IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).</li>
<li>Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MxA+protein%3A+an+interferon-induced+dynamin-like+GTPase+with+broad+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity.</a> J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).</li>
<li>Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mx+GTPases%3A+dynamin-like+antiviral+machines+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity.</a> Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).</li>
<li>Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+backfolding+of+the+carboxyl-terminal+end+of+MxA+protein+is+a+prerequisite+for+its+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization.</a> J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).</li>
<li>Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+GTPase-negative+MxA+mutant+with+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity.</a> J Virol. 74, 8202-8206 (2000).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+myxovirus+resistance+protein+a+reveals+intra-+and+intermolecular+domain+interactions+required+for+the+antiviral+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function.</a> Immunity. 35, 514-525 (2011).</li>
<li>Nigg, P. E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+GTP-binding+Requirements+of+MxA+for+Viral+Target+Recognition+and+Antiviral+Activity+against+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus.</a> J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oligomerization+in+the+stalk+region+of+dynamin-like+MxA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA.</a> Nature. 465, 502-506 (2010).</li>
<li>Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiparallel+leucine+zipper-directed+protein+reassembly%3A+Application+to+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein.</a> J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).</li>
<li>Patching, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+spectroscopy+for+characterisation+of+membrane+protein-ligand+interactions+and+its+potential+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Wyatt, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Scattering+and+the+Absolute+Characterization+of+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules.</a> Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins.</a> Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+antiviral+protein+MxA+interacts+with+the+cellular+RNA+helicases+UAP56+and+URH49%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49.</a> J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).</li>
<li>Stertz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced%2C+antiviral+human+MxA+protein+localizes+to+a+distinct+subcompartment+of+the+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum.</a> J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).</li>
<li>Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+human+MxA+GTPase+into+highly+ordered+dynamin-like+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers.</a> J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+%28Orthomyxoviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).</li>
<li>Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missorting+of+LaCrosse+virus+nucleocapsid+protein+by+the+interferon-induced+MxA+GTPase+involves+smooth+ER+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes.</a> Traffic. 5, 772-784 (2004).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+RNA+helicase+UAP56+is+required+for+prevention+of+double-stranded+RNA+formation+during+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection.</a> J Virol. 85, 8646-8655 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种简单方法，可通过非变性PAGE结合Western印迹分析，快速确定在哺乳动物细胞中表达的蛋白质的寡聚状态。该方法的主要优势在于，无需预先纯化蛋白质，即可直接从全细胞裂解液中确定特定蛋白质的寡聚状态。这对于那些在辅助因子存在下发生寡聚化或发挥功能的蛋白质尤为重要。此外，蛋白质仍保持其天然状态，若进一步从凝胶中回收，还可测定其酶活性或其他蛋白质功能，并将其与寡聚状态相关联。
该方案的一个关键环节是在样品制备过程中选择合适的去垢剂。这对于与细胞膜相关的蛋白质尤为重要。MxA 似乎主要与光面内质网的膜结构相关联。 25对于细胞裂解，非离子型去污剂NP40效果最佳，可防止MxA沉淀。按照先前所述方法，通过透析进行缓冲液置换并去除裂解液中的低分子量杂质 19 在凝胶电泳过程中，需添加0.1%的3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐（CHAPS）以防止MxA沉淀。此外，CHAPS不会干扰MxA的酶活性，这一点已通过在表达纯化的重组MxA蛋白测定证实 E. coli 12去垢剂在裂解过程中不...

蛋白质的四级结构在许多细胞过程中起着关键作用。信号通路、基因表达以及酶的激活/失活均依赖于蛋白质复合物的正确组装1-4。这一过程也称为同源或异源寡聚化，由不可逆的共价键或可逆的静电作用及疏水性蛋白质-蛋白质相互作用所介导。寡聚化不仅能在不增加基因组大小的情况下增加细胞过程的多样性，还为蛋白质提供了一种形成稳定复合物的策略，使其更耐变性和降解5。寡聚化缺陷会影响蛋白质功能，并可能导致疾病的发生。例如，苯丙氨酸羟化酶可形成四聚体复合物，该复合物内部的某些突变可能削弱四聚体的形成，从而导致苯丙酮尿症的发生6。
人MxA蛋白是一种由干扰素（IFN）诱导产生的抗病毒效应蛋白，对多种RNA病毒和DNA病毒均具有广谱抗病毒活性7。它属于动力蛋白样大GTP酶超家族，能够在体外形成大型寡聚结构in vitro8。已有研究提示，寡聚化可能有助于保护MxA免于快速降解9,10。尽管多个研究团队进行了大量努力，MxA的作用分子机制仍不明确，其寡聚状态在抗病毒功能中的作用也尚存争议9,11,12。在此方面，Gao及其同事提出了一种模型，认为MxA以大型环状寡聚结构的形式与病毒核蛋白相互作用，从而发挥抗病毒活性11。然而，最近我们证明MxA二聚体也具有抗病毒活性，并能与甲型流感病毒的核蛋白相互作用12。基于MxA的晶体结构，Gao及其同事鉴定了寡聚化界面区域中多个对体外寡聚化及其抗病毒功能至关重要的氨基酸残基in vitro和抗病毒功能11,13。因此，为了阐明MxA的哪种寡聚状态具有抗病毒活性，我们试图建立一种简便的实验方案，以快速确定在人细胞中表达的MxA界面突变体以及经IFNα刺激后表达的内源性MxA的寡聚状态。
尽管已有多种常用技术可用于研究蛋白质之间的相互作用，例如分裂绿色荧光蛋白（split-GFP）互补分析14、表面等离子共振15以及荧光共振能量转移（FRET）16，但这些方法无法提供有关寡聚蛋白复合物确切化学计量比的信息。针对这一特定方面的研究，多角度光散射（MALS）17和分析型超速离心18等技术则非常有用。通常，使用这些方法分析的蛋白质为纯化的蛋白质。然而，寡聚化过程可能还依赖于其他细胞内因素。如果这些因素未知，则分析将更加困难。此外，某些蛋白质在E. coli中难以表达和纯化。因此，这些方法并非在细胞环境中分析蛋白质寡聚化的最佳选择。另外，这些技术需要昂贵的仪器，而这些仪器并不容易获得。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、尺寸排阻色谱或化学交联后接常规十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE，是用于表征细胞裂解液中寡聚体形成的有用工具2,19,20。这些方法无需特殊设备，可在标准实验室中轻松实施。我们最初评估了多种化学交联方案，但这些方案 invariably 导致 MxA 发生非特异性聚集和沉淀。因此，我们随后测试了非变性 PAGE 方案。由于非变性 PAGE 不使用 SDS，蛋白质的迁移依赖于其天然电荷。蓝非变性 PAGE 利用考马斯亮蓝 G250 使蛋白质携带整体负电荷，作用类似于 SDS，但不会使蛋白质变性21。然而，考马斯亮蓝在含有高盐和二价阳离子（例如 Mg2+）的裂解缓冲液中会发生沉淀，而这些成分常被添加至裂解缓冲液中。根据所用缓冲液的不同，可能难以在不对影响寡聚蛋白复合物的步骤进行进一步优化的情况下分析样品。
本文介绍了一种基于先前发表方法22的简单实验方案，利用非变性PAGE检测来自细胞裂解液的人源MxA蛋白的寡聚化状态。

<table><tbody><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，10K 截留分子量，0.5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>在透析缓冲液中预平衡（如需去除甘油）&lt;br/&gt; 可根据 Fiala 等人 2011 年的方法自制</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶，10 孔</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>用运行缓冲液预电泳以平衡缓冲系统</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11836170001</td><td>每 50 ml 使用 1 片</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4&amp;nbsp; 500 ml 瓶装，Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>丽春红 S 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>&lt;strong&gt;有毒&lt;/strong&gt; 操作时需佩戴手套并保护眼睛</td></tr><tr><td>NativeMark 未标记蛋白标准品&amp;nbsp; 50 &amp;micro;l</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 57030</td><td>每孔上样 5 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>A549 细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL185</td><td>在生长培养基中培养（见 &lt;strong&gt;表 1&lt;/strong&gt;）</td></tr><tr><td>Vero 细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>在生长培养基中培养（见 &lt;strong&gt;表 1&lt;/strong&gt;）</td></tr><tr><td>抗 Mx1 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>使用稀释比例为 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL 抗兔 IgG，辣根过氧化物酶标记的全抗体（驴来源）</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>使用稀释比例为 1:10,000</td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA (1x)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺&amp;nbsp;&amp;nbsp; 5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>储存液&amp;nbsp; 100 mM</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4.5g/l 葡萄糖，+L-谷氨酰胺，+丙酮酸，Life Technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100 x&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 100ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x 储存液，100 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>透析胎牛血清，美国来源，500 ml，Gibco，批号：42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>纤维素滤纸</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 印迹&amp;nbsp;膜</td><td>GE-Healthcare</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷（Tris）</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠（NaF）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20（Tween 20）</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 10% 溶液</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>正钒酸钠（Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-甘油磷酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Migros/瑞士</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Amresco</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对人源mxa多亚基蛋白复合物的表征

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

寡聚复合物的形成是许多蛋白质发挥正常结构与功能的关键前提。干扰素诱导产生的抗病毒效应蛋白MxA对多种病毒具有广谱抗病毒活性。MxA属于一种类似于动力蛋白的GTP酶，能够形成高级别的寡聚结构。然而，MxA是否必须通过寡聚化才能发挥其抗病毒活性，目前仍存在争议。本文介绍了一种简单的方法，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结合Western印迹分析，检测在人源细胞系胞质组分中内源性或外源性表达的MxA蛋白的寡聚状态。该方法的关键步骤之一是选择合适的去垢剂，以防止蛋白质（尤其是与细胞膜相关的MxA蛋白）发生聚集或沉淀，同时不干扰其酶活性。另一个关键环节是使用碘乙酰胺对半胱氨酸残基的游离巯基进行不可逆保护，以避免蛋白产生人为的相互作用。本方法适用于对MxA蛋白寡聚状态进行简便评估，并可进一步实现MxA界面突变体的抗病毒活性与其各自寡聚状态之间的直接关联分析。

采用非变性 PAGE 分析了人野生型 MxA、二聚体界面突变体 MxA(R640A) 和 MxA(L617D)，以及单体界面突变体 MxA(M527D) 在细胞裂解液中的寡聚状态12。细胞在含有 1% 辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（NP-40）和碘乙酰胺的缓冲液中裂解，以确保蛋白质溶解并保护游离巯基（见图 1）。如前所述，通过透析去除盐和小分子代谢物19。使用非变性 PAGE 进行蛋白质分离。为促进高效的 Western 印迹，转膜前将凝胶在 SDS 缓冲液中孵育。采用兔抗 MxA 多克隆抗体通过免疫印迹检测 MxA 蛋白。实验流程见图 2。
为了比较来自IFN-α刺激的A549细胞的内源性人MxA蛋白的寡聚状态，我们将缺乏内源性MxA的Vero细胞转染了重组型野生型、单体和二聚体MxA变体。与未染色的天然蛋白标记物相比（图3A），这些重组型野生型、单体和二聚体MxA变体分别形成...

本文介绍了一种简单快速的实验方案，通过非变性PAGE结合Western印迹分析，检测人细胞裂解液中动力蛋白样GTP酶MxA蛋白的寡聚状态。

利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对人源MxA多亚基蛋白复合物的表征

寡聚复合物的形成是许多蛋白质发挥正常结构与功能的关键前提。干扰素诱导的抗病毒……

本实验的总体目标是利用非变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（non-denaturing sodium dodecosulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）测定细胞裂解液中同源寡聚蛋白复合物的亚基数目。该方法有助于回答细胞生物学领域中的关键问题，例如参与基本细胞过程的蛋白质的寡聚状态。该技术的主要优势在于无需纯化同源寡聚蛋白复合物，也不需要特殊且昂贵的仪器设备。因此，该实验可在大多数实验室中进行。本实验使用两种类型的细胞：表达内源性黏病毒抗性蛋白A（Myxovirus resistance A protein，简称MxA）的A549细胞，以及过表达MxA的病毒细胞（virocells）。将A549细胞和病毒感染细胞接种至六孔板中，每孔加入2毫升生长培养基。在细胞培养箱中孵育过夜。次日，收集细胞。用一毫升 PBS 清洗每个孔，并加入 0.5 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在室温下作用约五分钟以消化细胞。一旦细胞从培养皿上脱落，立即加入 0.5 毫升完全培养基，通过上下吹打轻轻混匀。将每孔中的细胞转移至一个 2 毫升离心管中，使用台式离心机离心收集细胞沉淀。用移液器小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。加入一毫升冰浴的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻吹打细胞悬液使其混匀。在台式离心机中离心收集细胞沉淀。用移液器小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。加入200 µL预冷的裂解缓冲液，通过反复吹打重悬细胞，然后置于冰上。由于裂解缓冲液中的碘乙酰胺对光敏感，应立即用锡箔纸包裹管子以避光保护裂解物。在冰上孵育30分钟。使用碘乙酰胺至关重要，因为碘乙酰胺可通过形成硫醚键不可逆地保护游离半胱氨酸的巯基，防止蛋白质发生非特异性聚集。接下来，在预冷的台式离心机中通过离心去除细胞碎片。离心过程中，准备截留分子量为10,000的透析柱。将透析柱固定在浮子上，并放入盛有预冷透析缓冲液的烧杯中以平衡透析柱。切勿触碰膜。将磁力搅拌器放入烧杯中，并将烧杯转移至冷室。使用磁力搅拌器确保轻柔搅拌，在4摄氏度下平衡20分钟。20分钟后，从透析缓冲液和浮筒中取出层析柱。用移液器将澄清的裂解液转移至已准备好的透析柱中，注意不要触碰膜。将透析柱固定在浮力浮子上，放回盛有透析缓冲液的烧杯中，然后将烧杯转移至冷室。将裂解液在4°C条件下透析至少四小时，同时使用磁力搅拌器轻轻搅拌，以去除可能干扰非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的小分子代谢物和盐类。透析完成后，将每份透析后的样品转移至1.5毫升离心管中。通过台式离心机离心去除沉淀物。透析裂解物后必须立即进行电泳，以防止寡聚蛋白复合物解离。将内槽和外槽加入预冷的电泳缓冲液。在4摄氏度条件下，用预冷的电泳缓冲液以每凝胶25毫安的电流对非变性聚丙烯酰胺凝胶预电泳15分钟。取15微升制备好的裂解液与5微升4倍浓度上样缓冲液混合。将适量的天然蛋白质标准品和15微升样品加入凝胶中。在4摄氏度条件下，以25毫安电流电泳运行4小时。当非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后，拆卸凝胶并小心转移至SDS缓冲液中。在室温下轻轻振荡孵育10分钟。为每块凝胶准备两块海绵、四张纤维素滤纸和一张转印膜，并将其浸入转印缓冲液中。从下至上依次组装“三明治”结构：一片海绵、两张纤维素滤纸、一张转印膜、凝胶、两张纤维素滤纸，再加一片海绵。将组装好的“三明治”放入转印槽中，确保转印膜朝向正极，凝胶朝向负极。将预冷的转膜缓冲液加入转膜槽中。为获得最佳的蛋白质转膜效果，建议在4°C条件下以90毫安的电流过夜转膜。次日，拆卸转膜“三明治”结构。将膜在室温下置于丽春红 S 溶液中孵育 5 分钟，以显示蛋白质标准品。将膜放入去离子水中进行脱色并清洗。将膜转移至托盘后，使用记号笔标记蛋白质标准品的条带。用封闭缓冲液在室温下封闭膜至少一小时，或在4°C下过夜。随后，按照文本方案中所述，使用针对MxA的兔多克隆抗体通过免疫染色可视化目标蛋白。缺乏内源性MxA的病毒细胞被转染了重组野生型MxA以及单体和二聚体MxA变体。重组MxA变异体在其预期的分子量处迁移，证实了其寡聚状态。外源表达的野生型MxA以四聚体形式迁移。随后利用这些重组蛋白评估了来自干扰素-α刺激的A549细胞的内源性人MxA蛋白的寡聚状态。结果显示，经干扰素-α刺激的A549细胞裂解液中MxA蛋白的大小对应四聚体。只要掌握该技术，若操作得当，可在一天半内完成。在进行该实验过程中，需特别注意在整个操作过程中避免对样品进行反复冻融，因为这可能会破坏蛋白质相互作用或导致蛋白质聚集。此外，在处理对光敏感的试剂（如碘乙酰胺）时，重要的是在裂解步骤中保护样品免受光照。在完成非变性 SDS-PAGE 后，可进一步进行蛋白质凝胶切取、酶活性分析或第二维 PAGE 等其他方法，以回答更多问题，例如酶活性以及潜在异源寡聚复合物的表征。该技术建立后，为细胞生物学领域的研究人员探索培养细胞中寡聚蛋白复合物的组成提供了重要途径。观看本视频后，您应能充分掌握如何从细胞培养物中制备细胞裂解液，以在非变性PAGE分析中研究寡聚蛋白。请务必注意，碘乙酰胺具有极高的危险性，操作时应始终采取预防措施，例如佩戴手套和护目用具。

characterization-multi-subunit-protein-complexes-human-mxa-using-non

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳人的MxA多亚基蛋白复合物的表征

在本视频中，我们介绍了通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）对多蛋白复合物（MPCs）进行表征的方法。在第一维中，将透析后的细胞裂解液通过BN-PAGE分离，以鉴定各个MPCs。在第二维SDS-PAGE中，对感兴趣的MPCs进一步分离，以便通过免疫印迹分析其组成成分。...

用于分析细胞裂解液中多蛋白复合物的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）

本视频展示了一种基于变性聚丙烯酰胺的蛋白质分离技术。该技术可根据蛋白质的分子量对其进行初步鉴定。...

基于分子量分离与可视化蛋白质的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术：用于蛋白质分析

本视频介绍了用于从组织匀浆中分离天然蛋白质复合物的多聚体PAGE技术。该技术是蓝色天然PAGE与SDS-PAGE技术的结合。分离得到的复合物可用于表征并研究其在细胞功能中的作用。...

用于分离天然蛋白质复合物的多聚体PAGE：一种结合蓝非变性PAGE与SDS-PAGE的混合分离技术，用于从组织裂解液中分离完整的多聚体蛋白质

在本视频中，我们演示了一种二维凝胶电泳方法，该方法可从人无功能性垂体腺瘤（NFPA）的肿瘤组织中获得的复杂蛋白质混合物中分离出单个蛋白质。蛋白质首先在第一维中根据其电荷进行分离，然后在第二维中根据其分子量进一步分离。...

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种基于电荷和分子量分离复杂蛋白质混合物中蛋白质的分析技术

黏蛋白是一类高分子量的糖缀合物，其大小范围为 0.2 至 200...

黏蛋白琼脂糖凝胶电泳：高分子量糖蛋白的蛋白质印迹法

雷诺丁受体的寡聚化，一种介导Ca²⁺释放的同源四聚体离子通道2+ 来自细胞内储存的释放，对骨骼肌和心肌收缩至关重要。本文中，我们介绍互补的 体内 和 体外...

遗传学与生物化学方法 体内 和 体外 蛋白质寡聚化的评估：以兰尼碱受体为例

本文介绍了一种利用胺反应性蛋白质交联剂结合新型二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）系统，从未经修饰的组织裂解液中稳定并分离天然蛋白质复合物的方法。...

多聚体-PAGE：一种用于捕获和解析生物样品中蛋白质复合物的方法

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本方案描述了利用天然电泳分离功能性线粒体电子传递链复合物（Cx...

利用天然电泳、凝胶内活性检测和电洗脱分析线粒体电子传递链的超复合物

一种利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和二维SDS-PAGE解析植物类囊体蛋白复合物结构与组成的实验方案被详细描述。该方案已针对 拟南芥,...

通过蓝色天然凝胶电泳分析类囊体膜蛋白复合物

本方案描述了尺寸排阻色谱与多角度光散射联用技术（SEC-MALS），用于溶液中蛋白质及其复合物的绝对表征。SEC-MALS...

通过尺寸排阻色谱-多角度光散射联用技术（SEC-MALS）对蛋白质进行表征

学习使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析技术，直接从A549细胞裂解液中评估MxA蛋白的寡聚状态。该方法无需纯化蛋白复合物，适用于大多数实验室进行细胞生物学研究。

利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对人源MxA多亚基蛋白复合物的表征

探索更多视频