使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳人的MxA多亚基蛋白复合物的表征
October 28th, 2016
本文描述了一种简单快速的方案，该方案使用非变性 PAGE 与蛋白质印迹分析的组合来评估来自人类细胞裂解物的动力蛋白样 GTP 酶 MxA 蛋白的寡聚状态。
本实验的总体目标是使用非变性十二硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定细胞裂解物中同源寡聚蛋白复合物中的亚基数量。这种方法可以帮助回答细胞生物学领域的关键问题，例如参与基本细胞过程的蛋白质的寡聚状态。该技术的主要优点是它不需要纯化同源寡聚蛋白复合物或专用的昂贵设备。
因此，它可以在大多数实验室进行。该实验利用两种类型的细胞。表达内源性粘液病毒抗性 A 蛋白或 MxA 的 A549 细胞;和过表达 MxA 的病毒细胞。
将 A549 细胞和病毒细胞接种到 6 个孔培养皿中，每孔 2 毫升生长培养基。将细胞在细胞培养箱中孵育过夜。第二天，收获细胞。
用 1 mL PBS 洗涤每个孔，并在室温下加入 0.5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，贴壁细胞约 5 分钟。一旦细胞从培养皿中分离，立即加入 0.5 mL 生长培养基，并通过上下移液小心混合。将每个孔的细胞转移到 2 毫升管中，并使用台式离心机沉淀。
通过移液小心地去除上清液，不要干扰细胞沉淀。通过加入 1 毫升冰冷的 PBS 并小心地上下吹打细胞悬液来洗涤细胞。在台式离心机中沉淀细胞。
通过移液小心地去除上清液，不要分离细胞沉淀。加入 200 μL 冰冷的裂解缓冲液，上下移液重悬细胞，然后置于冰上。立即用锡纸覆盖试管，以保护裂解液避光，因为裂解缓冲液中的碘乙酰胺对光敏感。
在冰上孵育 30 分钟。碘乙酰胺的使用至关重要，因为碘乙酰胺通过形成硫醚键不可逆地保护游离半色氨酸的巯基，并防止人工蛋白质聚集。接下来，通过在预冷的台式离心机中离心去除细胞碎片。
在离心过程中，制备截留分子量为 10， 000 的透析柱。将透析柱连接到浮标上，并将它们放入装满预冷透析缓冲液的烧杯中以平衡色谱柱。请勿触摸膜。
将磁力搅拌器放入烧杯中，然后将烧杯转移到冷藏室中。使用磁力搅拌器确保轻柔搅拌，在 4 摄氏度下平衡 20 分钟。20 分钟后，从透析缓冲液和浮标中取出色谱柱。
通过移液将澄清的裂解物转移到准备好的透析柱中，无需接触膜。将柱子连接到浮标上。将它们放回装满透析缓冲液的烧杯中，然后将烧杯转移到冷藏室中。
在4 摄氏度下透析裂解物至少 4 小时，同时用磁力搅拌器小心搅拌，以去除可能干扰非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的小代谢物和盐。透析完成后，将每个透析样品转移到 1.5 mL 试管中。通过在台式离心机中离心去除沉淀物。
裂解物透析后必须立即进行电泳，以防止寡聚蛋白复合物解离。用预冷的电泳缓冲液填充内外凝胶室。使用预冷的电泳缓冲液以每块凝胶 25 毫安的浓度预泳非变性聚丙烯酰胺凝胶，在 4 °C 下预泳 15 分钟。
将 15 μL 制备好的裂解物与 5 μL 4X 样品缓冲液混合。在凝胶上加载所选的天然蛋白质标准品和 15 μL 样品。在 4 摄氏度下以 25 毫安的浓度运行凝胶 4 小时。
当非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后，拆卸凝胶并小心地转移到 SDS 缓冲液中。在室温下轻轻摇动孵育 10 分钟。每个凝胶准备两块海绵、四张纤维素滤纸和一张印迹膜，并将它们浸泡在印迹缓冲液中。
按照如下方式从下到上组装三明治。一块海绵、两张纤维素滤纸、一张印迹膜、凝胶、两张纤维素滤纸和一块海绵。将三明治放入印迹槽中，确保膜朝向正极，而凝胶朝向负极。
用预冷的印迹缓冲液填充印迹槽。为获得最佳蛋白质转印结果，应在 4 摄氏度下以 90 毫安的浓度转印过夜。第二天，拆开三明治。
在室温下将膜在 Ponceau S 溶液中孵育 5 分钟，以观察蛋白质标准品。将膜放入去离子水中清洗，使其脱色。将膜转移到托盘后，用笔标记蛋白质标准品的条带。
用封闭缓冲液在室温下封闭膜至少 1 小时或在 4 摄氏度下过夜。随后，如文本方案中所述，使用针对 MxA 的兔多克隆抗体通过免疫染色来观察感兴趣的蛋白质。用重组野生型 MxA 以及单体和二聚体 MxA 方差转染缺乏内源性 MxA 的病毒细胞。
重组 MxA 方差在其预期分子量下的迁移证实了它们的寡聚状态。异位表达的野生型 MxA 以四聚体的形式迁移。然后使用这些重组蛋白来评估源自干扰素-α 刺激的 A549 细胞的内源性人 MxA 蛋白的寡聚状态。
结果显示，干扰素-α 刺激的 A549 细胞裂解物中 MxA 的大小对应于四聚体。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一天半内完成。在尝试此程序时，请务必记住在整个过程中不要冷冻和解冻样品，因为这可能会破坏蛋白质相互作用或导致蛋白质聚集。
此外，当使用光敏试剂（如碘乙酰胺）时，在裂解步骤中保护样品避光也很重要。在非变性 SDS-PAGE 之后，可以执行其他方法，如蛋白质凝胶提取和酶活性 AsiS 或第二维 PAGE，以回答其他问题，如酶活性和潜在异源寡聚复合物的表征。该技术开发后，为细胞生物学领域的研究人员探索培养细胞中寡聚蛋白复合物的组成铺平了道路。
观看本视频后，您应该对如何从细胞培养物中制备细胞裂解物以研究非变性 PAGE 分析中的寡聚蛋白有很好的了解。不要忘记，使用碘乙酰胺可能非常危险，应始终采取预防措施，例如戴手套和护目镜。
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概述
本文描述了一种使用非变性PAGE和蛋白质印迹分析评估MxA蛋白寡聚态状态的快速协议。该方法适用于人类细胞的细胞裂解液。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 蛋白质分析
- 生物化学
背景
- 理解蛋白质的寡聚态状态在细胞生物学中至关重要。
- 同源寡聚蛋白复合物在细胞过程中扮演重要角色。
- 传统方法通常需要蛋白质纯化，这可能很麻烦。
- 该协议允许直接从细胞裂解液进行分析。
研究目的
- 确定同源寡聚蛋白复合物中的亚基数量。
- 评估不同细胞类型中MxA蛋白的寡聚状态。
- 提供一种大多数实验室都能访问的简单方法。
使用的方法
- 非变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
- 用于蛋白质检测的蛋白质印迹分析。
- 使用A549细胞和病毒细胞进行MxA表达分析。
- 无需纯化即可分析细胞裂解液。
主要结果
- 成功评估了细胞裂解液中MxA的寡聚态状态。
- 展示了该方法在标准实验室环境中的可行性。
- 提供了有关蛋白质在细胞过程中作用的见解。
- 强调了非纯化技术的优点。
结论
- 该协议有效用于分析蛋白质寡聚化。
- 它可以在细胞生物学的各种研究背景中使用。
- 该方法增强了研究蛋白质复合物的研究人员的可访问性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assessing the oligomeric state of antiviral proteins like MxA directly from cell lysates enables mechanistic de-risking of target hypotheses in early discovery. This non-denaturing PAGE approach supports target validation by linking functional oligomeric forms to antiviral activity without requiring protein purification. The method provides a scalable, reproducible readout for evaluating mutant phenotypes in a disease-relevant system, informing lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating MxA oligomeric states with antiviral function.
- Operational Value: Enables functional target validation using endogenous or ectopic expression in human cell lines.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing active oligomeric complexes from inactive monomers or aggregates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized lysates for downstream screening of MxA modulators or interface mutants.
- Quantitative Output: Generates resolvable oligomeric bands (monomer, dimer, tetramer) for comparative analysis across conditions.
- Reproducibility: Uses dialysis and light-protected lysis to minimize artifactual aggregation, ensuring consistent complex detection.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Evaluates MxA oligomerization in interferon-stimulated A549 cells, a physiologically relevant model of antiviral response.
- Translational Continuity: Links oligomeric state to antiviral phenotype, supporting biomarker-aligned target assessment.
- Preclinical De-risking: Enables structure-function analysis of MxA mutants to guide therapeutic candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling oligomerization assessment after target engagement but before lead optimization, particularly for GTPase-mediated antiviral targets.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about oligomerization-dependent activity without perturbing native complexes.
- Screening: Delivers quantitative electrophoretic readouts to compare wild-type and mutant protein assemblies.
- Analytics: Provides subunit resolution via native PAGE, enabling densitometric comparison of oligomeric populations.
- Translational Research: Connects biochemical state to antiviral function in human cells, supporting target confidence.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other dynamin-like GTPases or oligomeric signaling proteins in antiviral or innate immunity pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the active oligomeric state of MxA.
- Operational Value: Employs standard lab equipment (centrifuge, gel apparatus, blotter) avoiding specialized infrastructure.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by validating whether observed antiviral effects correlate with defined oligomeric species.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of MxA-targeted strategies based on oligomerization competence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE, dialysis, and western blotting to preserve labile complexes.
- Needs pre-chilled buffers, magnetic stirrer, dialysis columns (10 kDa cutoff), and light-protected handling of iodoacetamide.
- Demands standardized lysis and dialysis protocols across teams to prevent variability in oligomer detection.
- Must avoid freeze-thaw cycles and protease activity to maintain complex integrity during sample prep.
- Limited to detecting stable oligomers; transient or weak interactions may require crosslinking or orthogonal validation.
