肠易激综合征的循环miRNA的扰动检测使用复用高通量基因表达平台
November 30th, 2016
我们描述了多重高通量基因表达平台的使用，该平台通过对生物底物中的分子进行条形码编码和计数来定量基因表达，而无需扩增。我们使用该平台定量了患有和不患有肠易激综合征的受试者全血中的 microRNA （miRNA） 表达。
该多重核酸定量方案的总体目标是以数字方式定量全血中的 microRNA 表达。这种方法可以帮助回答消化系统疾病研究中的关键问题。它有助于识别失调的分子机制和生物标志物特征，如 microRNA。
该技术的主要优点是 microRNA 定量不依赖于扩增。这项技术对分子靶标进行数字计数，并且在很大程度上是自动化的。为了纯化总 RNA，解冻并孵育先前收集和冷冻的全血样品 2 小时。
使用水平吊篮转子在室温下以 5， 000 x g 离心试管 10 分钟。然后，小心地将其倒入或移液到废液管中，去除上清液，注意不要干扰沉淀。向沉淀中加入 4 毫升不含 RNase 的水。
牢固地盖上盖子，涡旋，直到沉淀明显溶解。然后，再次离心试管，并去除上清液。接下来，向沉淀中加入 350 微升 BM1 缓冲液并涡旋，直到沉淀明显溶解。
然后，将样品转移到 2 mL 处理管中，用于自动提取总 RNA。使用市售的 RNA 提取试剂盒，通过将 RNA 纯化试剂盒中提供的预装移液器吸头、离心管、缓冲液和试剂加载到机器人 RNA 提取系统中，对细胞内 RNA（包括全血样品中的 microRNA）进行自动纯化。从实验方案选择菜单中，选择 Blood miRNA PartA 实验方案，然后开始运行。
完成 RNA 提取，并根据文本方案储存样品。首先使用不含 RNase 的水将 12 个 RNA 样品标准化为 33 ng/μL，以制备 microRNA 样品。用不含核酸酶的水，制备检测试剂盒中提供的 microRNA 对照品的 1：500 稀释液，并保持在冰上。
接下来，通过混合 13 μL 退火缓冲液、26 μL micro R-tag 试剂和 6.5 μL microRNA 对照来制备退火预混液。向 12 个 0.2 mL 试管中，每管加入 3.5 μL 退火预混液，然后加入 3 μL RNA 样品。轻弹试管进行混合，用台式微型微量离心机以 2000 倍 g 的速度旋转，然后使用以下程序在热循环仪中运行试管。
接下来，通过将 3 μL 连接缓冲液和 19.5 μL PEG 混合来制备连接预混液。然后，向每个反应中加入 2.5 μL 连接预混液。混合并旋转试管后，将它们放回热循环仪中，在 48 摄氏度下放置 5 分钟。
然后，当仍在热循环仪模块中时，将 1 微升连接酶直接添加到每个样品中，并使用以下程序孵育试管。轻轻混合并旋转试管，并向每个样品中加入 1 微升连接纯化酶。然后，如图所示在热循环仪中孵育试管。
孵育后，向样品中加入 40 μL 不含 RNase 的水，然后混合并离心。为了进行 microRNA 杂交，解冻在冰上提供的报告基因和捕获探针组，然后将它们旋转下来。向报告基因代码集 2 中加入 130 μL 杂交缓冲液，并混合以制备杂交预混液。
在 12 个新的 0.2 mL 联排管中，加入 20 μL 杂交预混液。将刚刚制备的 microRNA 样品在 85 摄氏度下变性 5 分钟，然后在冰上冷却。然后，将 5 微升 microRNA 样品添加到每个含有杂交预混液的试管中。
将热循环仪编程至 65 摄氏度，体积计算温度为 30 微升，并将加热盖设置为永久时间设置，使其在运行结束时不会下降到 4 摄氏度。向每个试管中加入 5 微升捕获探针组，然后混合。然后，在将它们旋转后，立即将试管放入 65 摄氏度的热循环仪中。
样品孵育时间不少于 12 小时，不超过 30 小时。首先将小柱和板加热至室温，设置制备站。然后旋转板子。
要加载制备站，请打开工作站门，将试剂板、卡套、移液器吸头、制备好的样品装在 0.2 mL联排管中，以及两个空的 0.2 mL（12 管）联排管装入机器人中的适当位置。取下联管盖和试剂板盖。然后，关闭制备站门，并从控制面板运行适当的分析。
要可视化和计数固定和定向三方复合物的条形码，请从制备站中取出小柱，使用提供的盖子密封，然后将其放入数字分析仪中任何可用的插槽中。使用触摸屏创建墨盒定义文件 （CDF）。确保为 CDF 中的每个样品分配适当的报告基因库文件。
扫描完成后，使用 USB 驱动器或通过电子邮件从数字分析仪下载数据文件，然后根据相关的 QC 和分析方案处理和分析数据。基因表达平台检测系统通过其高度自动化的特性降低了技术噪音，并且它使用的独特化学成分可产生高精度的基因表达数据。此处显示的技术重复表明，内源性和病毒性 microRNA 表达定量均具有高度可重复性。
使用这种方法，可以确定与健康研究参与者定义的预期表达存在偏差的病毒编码和内源性人 microRNA 为 IBS 的目标靶标。该方法的精度和灵敏度允许检测低表达靶标之间的扰动，并且还可以可靠地观察到细微的扰动。这些图显示了与健康对照相比，IBS 和 IBS 亚型中循环 microRNA 的一些扰动。
这里介绍了 IBS 参与者中两种最显著的差异升高的 microRNA。此小提琴图中的曲线表示 miR-150 的计数频率。竖条表示第一和第三四分位数，红色方块表示中位数。
按照此程序，可以基于相同技术进行更具针对性的定制检测，以验证更大队列中的生物标志物特征并探索基本的 RNA 和蛋白质关联。开发后，这项技术为生物医学研究领域的研究人员快速、精确和准确地开发疾病的诊断生物标志物面板铺平了道路。
概述
本文介绍了一个多重高通量基因表达平台，旨在定量测定全血样本中的microRNA表达。该方法允许在不需要扩增的情况下进行准确测量，使其适用于研究诸如肠易激综合征等疾病。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因表达分析
- microRNA定量
- 消化系统疾病研究
背景
- microRNA在基因调控中发挥着关键作用。
- 理解它们的表达可以提供对各种疾病的洞察。
- 当前的方法通常依赖于扩增，这可能会引入变异性。
- 本研究旨在通过新方法克服这些限制。
研究目的
- 开发一种用于血液中microRNA数字化定量的方法。
- 识别肠易激综合征中失调的分子机制。
- 建立消化系统疾病的生物标志物特征。
所用方法
- 从全血样本中自动提取RNA。
- 使用特定试剂制备microRNA样本。
- 用于microRNA检测的杂交和连接过程。
- 使用专门平台对基因表达数据进行数字分析。
主要结果
- 该方法在定量microRNA水平方面表现出高精度。
- 技术重复显示结果具有可重复性。
- 识别出偏离健康表达谱的microRNA。
- 能可靠地检测低表达目标的细微扰动。
结论
- 该多重平台为研究血液中的microRNA提供了一个强大的工具。
- 它可以帮助理解消化系统疾病的分子基础。
- 这种方法可能会导致肠易激综合征新生物标志物的发现。
常见问题
Executive Industry Relevance
This multiplexed high-throughput gene expression platform enables robust, amplification-free quantification of circulating miRNAs, supporting biomarker discovery in digestive disorders such as irritable bowel syndrome. By providing high sensitivity and reproducibility in detecting low-expression miRNA perturbations, the method enhances target validation confidence and reduces mechanistic ambiguity in early discovery. Its automated workflow and digital counting approach improve assay standardization and scalability for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying dysregulated circulating miRNAs as potential biomarkers in IBS.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise, amplification-free quantification that minimizes technical variability.
- Predictive Value: Facilitates detection of subtle miRNA perturbations, improving confidence in target relevance and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates highly reproducible, quantitative miRNA expression data suitable for assay standardization and biomarker panel development.
- Operational Value: Reduces investigator effects via largely automated sample preparation and robotic processing, enhancing throughput and consistency.
- Scalability: Permits multiplexed analysis of up to 800 transcripts per reaction, enabling efficient screening of miRNA signatures across cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports validation of circulating miRNA biomarkers discovered in human samples for further preclinical investigation.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of miRNA expression changes with disease subtypes, aiding in pathophysiological understanding.
- Predictive Confidence: Enables reliable detection of low-abundance miRNAs, improving biomarker sensitivity and reducing false-negative risk in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven biomarker screening to assay validation, supporting progression from early discovery to lead identification in digestive disorder research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying miRNA expression changes in whole blood, clarifying dysregulated molecular pathways in IBS.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs with high linearity and sensitivity, supporting reliable compound or biomarker evaluation.
- Analytics: Provides digital barcode counts and normalized expression data that facilitate statistical comparison across conditions and cohorts.
- Translational Research: Connects circulating miRNA findings to disease relevance, supporting biomarker continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for miRNA profiling applicable across multiple therapeutic areas beyond gastrointestinal disorders.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing technical noise and enabling detection of low-expression miRNA changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automation, minimizing batch effects and user variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust biomarker data, reducing late-stage failure risk due to poorly validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of miRNA biomarkers based on reproducible, quantifiable expression changes in clinically relevant samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, automated liquid handling systems, and digital image analysis for accurate miRNA quantification.
- Dependent on access to robotic prep stations, digital analyzers, and proprietary fluorescent probe sets with color-coded barcodes.
- Necessitates cross-team standardization of sample collection, RNA normalization, and hybridization protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to different biofluids or tissue types beyond whole blood.
- Limited by the need for specialized reagents and equipment, which may constrain adoption in low-resource settings despite high reproducibility.
