Name: 肠易激综合征的循环miRNA的扰动检测使用复用高通量基因表达平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 了解使用复用高通量基因表达平台在全血中数字化定量微RNA表达的方法。该技术无需扩增即可检测肠易激综合征中循环微RNA的扰动，为消化系统疾病研究提供高灵敏度的生物标志物发现工具。

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作者感谢美国卫生与公共服务部、美国国立卫生研究院、美国国家护理研究所及院内研究部为Wendy A. Henderson提供的资助（项目编号：1ZIANR000018-01-06）；感谢为Nicolaas H. Fourie、Ralph M. Peace、Sarah K. Abey和Leeanne B. Sherwin提供的院内研究培训奖；以及感谢Burroughs Wellcome基金为霍华德·休斯-美国国立卫生研究院研究学者Ralph M. Peace提供的特别支持。
本文表达的观点以及对这些数据的解释和报告由作者负责，不应被视为美国国立卫生研究院或美国政府的官方建议、解释或政策。

本研究所述研究已获得美国国立卫生研究院机构审查委员会的批准（Clinicaltrial.gov 编号：NCT00824941）。
1. 全血样本的采集
<ol>
	<li>通过静脉穿刺从研究参与者采集全血样本（2.5 ml），使用含有RNA稳定溶液的采血管（可实现长期储存），并在RNA纯化前将样本储存在-80 °C。</li>
</ol>
2. 总RNA纯化
<ol>
	<li>解冻血样管并孵育2小时，然后使用摆动转子离心机在5,000 × g条件下离心10分钟。小心倾倒或用移液器将上清液移入废液管中，注意不要扰动沉淀物。</li>
	<li>将4 ml无RNase的水加入沉淀中，盖紧管盖，涡旋振荡直至沉淀完全溶解。使用摆桶转子在5,000 × g离心10分钟，弃去上清液，操作同步骤2.1所述。</li>
	<li>向沉淀中加入350 µl BM1缓冲液（试剂盒提供）。充分涡旋振荡，直至沉淀完全溶解，然后转移至2 ml处理管中，用于自动化总RNA提取。</li>
	<li>使用市售RNA提取试剂盒，通过自动化RNA提取系统，从全血中自动纯化细胞内RNA，包括miRNA。 
	注意：我们使用的自动化机器人系统可同时处理十二个样本，RNA纯化流程需要3小时才能完成。
	<ol>
		<li>将RNA纯化试剂盒中预先装好的移液器吸头、离心管、缓冲液和试剂载入机器人RNA提取系统中。</li>
		<li>选择 &#34;血液miRNA 第A部分&#34; 从协议选择菜单中选择协议并开始运行。 
		注：自动化操作程序的说明详见补充材料。</li>
		<li>机器人完成自动化miRNA纯化方案的A部分后，清空废液容器，并从机器人系统中移除使用过的塑料耗材和试剂容器。</li>
		<li>关闭所有含有洗脱RNA的微量离心管管盖，并将其放入振荡适配器中。选择 &#34;血液miRNA 第B部分&#34; 从方案选择菜单中选择在 65 ℃ 孵育样品 o5 分钟，温度为 C</li>
		<li>机器人完成miRNA纯化方案B部分后，立即取出样品并置于冰上冷却。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分光光度计定量并评估纯化后RNA的质量。 
	注意：根据miRNA检测方案的建议，样品最低浓度需达到33 ng/µl，且所有样品的A280/A260比值应达到或超过1.9，A260/A230比值最低为1.8，以确保无显著的有机污染，避免影响检测性能（参见参考文献17）。</li>
	<li>将样品在 -80 保存 oC.</li>
</ol>
3. miRNA 样本制备
<ol>
	<li>使用无核酸酶水将12个RNA样本归一化至33 ng/µl。</li>
	<li>使用无核酸酶水将检测试剂盒中提供的miRNA对照品稀释至1:500。置于冰上保存。</li>
	<li>配制退火主混合液：使用10 µl和20 µl移液器，将13 µl退火缓冲液（提供）、26 µl miRtag试剂（提供）和6.5 µl miRNA对照（步骤3.2中制备）混合。</li>
	<li>使用10 µl移液器，加入3.5 µl退火主混合液和3 µl RNA样品即，将100 ng）分别加入十二个0.2 ml条状管中。轻弹混匀，使用台式小型微量离心机（2,000 × g）离心，然后放入PCR仪（94 oC，1 分钟，65 oC，2 分钟，以及 45 o48℃ 保温 10 分钟；然后保持在 48℃ oC）。</li>
	<li>将3 µl连接缓冲液（提供）和19.5 µl聚乙二醇（PEG；提供）使用20 µl移液器混合，配制连接主混合液。使用10 µl移液器，将2.5 µl连接主混合液分别加入步骤3.4中的各排管中。
	<ol>
		<li>轻轻混匀，使用台式小型微量离心机（2,000 × g）离心，然后放回48℃的PCR仪中 oC 5分钟。5分钟后，使用10 µl移液器向每个在热循环仪中的反应管直接加入1 µl连接酶，并在48 ℃下孵育 oC，3 分钟，47 o3 分钟，46 ℃ o3 分钟，45 ℃ oC，5 分钟，以及 65 oC 10 分钟；4℃ 保持 oC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从热循环仪中取出试管，轻轻混匀，使用台式小型微量离心机（2,000 × g）离心，加入1 µl连接纯化酶（试剂盒提供）。将试管放入热循环仪中孵育（37 ℃ oC孵育1小时和70 o4℃ 保存10分钟；随后置于4℃ oC). 使用10-µl移液器。</li>
	<li>取出离心管，使用100 µl移液器加入40 µl无核酸酶水，混匀后用台式小型微量离心机离心（2,000 × g）。</li>
</ol>
4. miRNA 杂交
<ol>
	<li>将提供的报告探针和捕获探针组在冰上解冻，并使用台式小型微量离心机（2,000 × g）离心沉淀。</li>
	<li>使用200 µl移液器，向报告探针编码组管中加入130 µl杂交缓冲液（130 µl），配制杂交主混合液。混匀后，使用台式小型微量离心机（2,000 × g）离心沉淀。 
	注意：报告探针和捕获探针对面板中包含的每种miRNA具有特异性和标准性。可设计定制面板以及用户自定义的捕获探针和探针组。</li>
	<li>在12个新的0.2 ml条形管中，使用20 µl移液器各加入20 µl杂交主混合液。</li>
	<li>将步骤3.7中的miRNA样品在85 oC下变性5分钟，然后在冰上冷却。使用10 µl移液器向步骤4.3中的每个管中加入5 µl样品。</li>
	<li>将PCR仪程序设定为65 oC，反应体积按30 µl计算，热盖温度设为持续加热模式（不要设置程序在运行结束后降至4 oC）。</li>
	<li>使用10 µl移液器，向每个管中加入5 µl捕获探针组，混匀后使用台式小型微量离心机（2,000 × g）离心沉淀，并立即放入设定为65 oC的PCR仪中。孵育时间不少于12小时，且不超过30小时。</li>
</ol>
5. 准备工作站和数字分析仪
<ol>
	<li>加载预处理工作站。
	<ol>
		<li>打开工作站门，装入试剂板（提供）、芯片（提供）、移液器吸头（提供）、已准备好的样本（置于12个0.2 ml条状管中）以及12个空的0.2 ml条状管（提供）。取下条状管盖和试剂板盖。关闭预处理工作站门，从控制面板运行相应的检测程序。 
		注意：无论运行何种检测，杂交后的处理步骤均相同。所有试剂和塑料耗材均为预包装，除将其恢复至室温，并在2,000 × g下离心含试剂的96孔板2分钟外，无需其他准备。所有组件均需装载至预处理工作站中明确指定的位置。有关自动化程序的说明，请参见补充材料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对固定并定向的三元复合物上的条形码进行成像与计数。
	<ol>
		<li>从预处理工作站中取出芯片，用提供的盖玻片密封，然后将其放入数字分析仪中位于相机光学部件上方的插槽内。</li>
		<li>在检测套件上标明的相应检测（miRNA panel检测）及检测版本中进行选择，并运行程序。 
		注意：数字分析仪随后将在四个激发波长下对每个样本位置采集视野图像，从而实现荧光条形码的读取与解码。对应于特定miRNA的条形码将被计数。</li>
		<li>将数据文件导出至U盘，或通过互联网连接直接导出至服务器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据处理与分析
<ol>
	<li>点击 &#34;原始数据&#34; 标签并选择 &#34;导入 RCC 文件&#34;. 从 USB 中选择包含 RCC 文件（原始数据文件）的文件夹。</li>
	<li>点击 &#34;下一步&#34;，选中所有质控复选框，然后单击 &#34;导入&#34;.</li>
	<li>点击 &#34;新研究&#34; 步骤。输入研究名称并进行描述，然后保存。</li>
	<li>在新研究中，选择 &#34;新实验&#34; 点击标签并命名及描述新实验。 &#34;下一步&#34; 从左侧窗格中选择包含已上传相关原始数据文件的 RLF 文件夹。选择后，单击 &#34;保留选定内容&#34;，然后单击 &#34;下一步&#34;.</li>
	<li>如需添加注释，请点击 &#34;下一步&#34;.</li>
	<li>选择背景扣除方法；可选择阴性对照、空白泳道扣除或用户自定义扣除。选择后，单击 &#34;下一步&#34;. 
	注意：根据研究的技术参数和生物学背景，确定最合适的背景校正方法。 
	注意：对于丰度较低的靶标，计数的精确性较差。在本研究所描述的分析中，数据首先在未进行背景校正的情况下进行处理，以检查质控参数，并考察不同丰度miRNA在技术重复样本间的计数变异情况；随后，数据使用25计数的背景阈值重新进行处理。</li>
	<li>选择 &#34;前100名&#34; 标准化，然后单击 &#34;下一步&#34;.</li>
	<li>为获得比值数据，选择比值参数，然后单击 &#34;下一步&#34;.</li>
	<li>点击 &#34;完成&#34;.</li>
	<li>单击左侧窗格中的实验名称，以展开包含以下内容的下拉菜单 &#34;原始&#34;, &#34;标准化&#34;, &#34;分组&#34;, &#34;比率数据&#34;，以及 &#34;分析数据&#34;.</li>
	<li>点击 &#34;原始数据&#34; 在右侧面板中查看质控报告，观察未通过默认质控参数的样本旁的标记。创建新的 &#34;研究&#34; 不包含被标记的样本，并按所述重新处理，或在数据分析步骤中通过选择直接排除被标记的质控样本 &#34;根据质控/标准化标志排除样本&#34;.
	<ol>
		<li>导出 &#34;原始&#34;, &#34;标准化&#34;，或 &#34;分组&#34; 以CVS或其他兼容文件格式存储用于其他统计或微阵列软件分析的数据文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择 &#34;标准化数据&#34; 从左侧窗格中选择，并在右侧窗格中选取要包含在分析中的样本。</li>
	<li>点击 &#34;分析&#34; 并选择所需的分析类型（例如， &#34;热图&#34;, &#34;小提琴图&#34;, &#34;箱线图&#34;, &#34;散点图&#34;，或 &#34;直方图&#34;）。选择所需的排除标准复选框（例如， 排除异常样本或基因、根据质控标志排除样本、排除对照基因和/或从数据分析中排除标准化探针。</li>
	<li>根据需要选择要从分析中排除的个别样本。</li>
	<li>根据需要选择要从分析中排除或包含的特定基因。</li>
	<li>选择所选统计或数据可视化操作的参数，然后单击 &#34;完成&#34;.</li>
</ol>

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</ol>

W.A.H.、S.K.A.、N.H.F. 和 R.M.P. 拥有美国专利（专利号：PCT/US14/38638），该专利涉及源自本文所述研究的肠易激综合征（IBS）循环miRNA特征。

方案中的关键步骤
对于miRNA检测而言，尤其关键的是不能使用未经纯化的裂解液（尽管这些裂解液可用于mRNA和蛋白质检测），因为相关试剂并未针对裂解液的直接使用进行优化，且样品制备反应很可能会受到抑制。此外，从细胞裂解和RNA纯化步骤中残留的污染物（例如， 胍类化合物、乙醇和酚类物质可能抑制连接反应和样品纯化反应，因此高质量的RNA对于miRNA检测的灵敏度和准确性至关重要。
使用带有加热盖的热循环仪对于确保适当的温度控制至关重要，以优化所有反应步骤的性能。在执行步骤 3.5.1 时，为在添加连接酶期间维持温度，切勿将条带从热循环仪中取出；取出条带添加连接酶会影响反应效果。进行杂交步骤时，必须避免剧烈振荡、移液或甩动试管中的试剂，以免剪切报告探针。为确保最佳性能和一致性，应通过轻柔甩动充分混匀管中的试剂。每次混合后务必离心反应液，并在每次分装试剂时更换新的移液吸头，以确保移液准确并避免意外交叉污染。
修改与故障排除
代码集可根据研究需求进行定制，仅包含目标检测物，从而在进一步研究或验证生物标志物时，平衡成本并实现大规模样本集的检测。对于现有产品线中未包含的基因或靶标，可设计定制化探针。 按需定制 菜单。通过延长杂交时间和/或使用更高分辨率的数字计数，可提高对丰度较低的目标分子或低浓度RNA的检测灵敏度。
在本研究中，我们使用了预定义的800种靶向miRNA面板，并以全血总RNA为样本；然而，若需要更特异性的检测方法，也可对检测进行定制，以包含较少数量的miRNA。每天最多可处理24个样本，分两批进行，每批12个样本，因为自动化前处理工作站可在杂交后处理两个芯片，并于次日在数字分析仪上成像。将样本以每批12个的方式分批错时处理，对于标准化杂交时间至关重要。已完成成像的芯片可保存并置于4 oC储存，以便在数据分析提示更高分辨率扫描可能有助于稀有miRNA检测时重新扫描。延长样本杂交时间也可能提高稀有分子的检出率；然而，过长的杂交时间可能导致信号过饱和，且仅在起始RNA浓度较低时（如来源于细胞外囊泡的RNA）才可能改善检测结果。该平台具有较高的灵敏度和精确性，能够对相对低丰度的miRNA进行可靠计数。
技术的局限性
所述基因表达检测平台每张芯片最多可容纳800个检测目标，因此不适用于全miRNA转录组或全转录组研究。该平台仅能检测已知、已有描述且已明确指定的目标，故不适合用于发现新的分子种类。对于全转录组的探索性研究，RNA测序（RNASeq）或其他传统微阵列方法更为适用。
该技术相对于现有/替代方法的重要性
肠易激综合征（IBS）的特征是一组症状的组合，主要包括腹痛、内脏高敏感性以及排便习惯的改变，例如频繁腹泻、便秘或二者兼有9,10。IBS症状无已知的器质性病因，患者不存在临床显著的炎症、胃肠道组织的组织病理学改变或系统性标志物异常9-12。研究表明，IBS中的生物学失调较为轻微、处于亚临床状态且具有异质性，其中与炎症和免疫功能相关的机制逐渐成为共同关注的主题10。因此，我们需要控制由实验操作者引入的变异，并采用一种能够可靠检测基因表达中细微变化的技术平台。该检测方法及系统的独特属性可实现样本处理的标准化，并通过自动化减少人为操作，从而降低技术性变异，获得高度可重复的数据。这些特性支持针对性的研究，并产生高度精确且可重复的结果。这使得能够检测到细微的表达变化，以及在低表达靶标中可能被高丰度靶标信号掩盖或淹没的变化，而这些变化在使用基于信号强度或扩增的方法时容易被忽略。基于PCR的微阵列和RNA测序方法是所描述平台的可行替代方案，在需要更高通量、或旨在全面表征转录组或发现新分子时可能更具吸引力。然而，这些替代方法在准确、灵敏地检测和定量稀有靶标及细微变化方面可能表现较差。
掌握该技术后的未来应用或发展方向
肠易激综合征（IBS）患者中循环miRNA表达显示出多种紊乱，这些紊乱在各类别中均具有显著性和一致性。所鉴定出的miRNA与多种相关通路及病理状态相关，包括功能性疼痛状况（miR-342-3p：慢性膀胱疼痛）8 和炎症（miR-150）13示例研究基于一个探索性队列，用于确定感兴趣的目标和系统。随后构建了一个更集中、规模更小的miRNA芯片，降低了每个样本的检测成本，从而能够以具有成本效益的方式分析更大规模的队列，以验证并优化分子特征和生物标志物。基因表达检测平台在传统微阵列的探索性与更集中、基于假设的数据采集之间实现了平衡，有助于进一步优化和验证分子特征及生物标志物。14-16该方法将用于检测分子和蛋白质水平的扰动 体内 和 体外 在描述的目标miRNA被实验性过表达或抑制的模型中，新型检测方法能够直接从细胞和组织裂解液中同时定量mRNAs和蛋白质。此外，通过优化外周血及排泄物特定组分的纯化方法（例如， 尿液）并通过定制和优化特定检测参数，对低分子浓度组分的分子谱型和特征进行分析例如， 外泌体组分将被检测。

肠易激综合征（IBS）是胃肠病学门诊中最常见的诊断，影响着普通人群的10%至15%，对医疗卫生服务造成显著负担。目前，尚无普遍接受的用于诊断肠易激综合征的生物标志物。 即， 诊断基于临床症状，并需排除其他器质性疾病，例如胃肠道恶性肿瘤、炎症性肠病和胃肠道（GI）感染。在研究伴有亚临床组织病理学改变的常见疾病（如肠易激综合征，IBS）的基因表达谱时，需要具备高灵敏度和高准确性（可重复性），因为基因表达谱的改变通常较为细微1-3微小RNA（miRNAs）已被确定为肠易激综合征（IBS）的诊断和功能靶点4,5，并且我们特别关注评估它们作为肠易激综合征相关生物学紊乱的循环生物标志物的用途3,4,6,7循环生物标志物的临床应用目前备受关注，因其来源的采集简便且具有微创性例如， 外周血）来自患者。
基因表达检测平台由于其独特的化学原理以及简化且大部分自动化的操作流程，提供了一种微阵列平台，可对转录组进行广泛且可定制的靶向检测（单次反应可检测800个靶标）。该平台在转录组靶标定量方面，能够在广泛的表达水平范围内实现高精度和良好的线性响应。该检测无需进行RNA的逆转录、cDNA的扩增或其他任何酶促反应。因此，通过数字计数的方式，可减少因对低丰度RNA或罕见剪接变体进行高循环数扩增所引入的潜在误差。这意味着多种类型的样本均可适用于该检测，包括纯化的总RNA（即 mRNA + miRNA）、来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本的RNA，以及粗制的组织和细胞裂解液。
使用一对探针（捕获探针和报告探针）检测目标RNA，每种探针均包含一段靶标特异性序列，可识别目标RNA上的相应区域。为确保短RNA的检测（即， microRNAs（miRNAs）的成熟序列通过将一种独特的寡核苷酸标签（miRtag）退火至分子的3'端而被延长。使用一种桥接寡核苷酸，该寡核苷酸与成熟靶标miRNA的一部分以及miRNA特异性的miRtag部分互补，以确保序列特异性。捕获探针和报告探针分别连接至成熟miRNA-miRtag复合物的3'端和5'端。捕获探针在3'端带有生物素标记，使其能够结合到链霉亲和素包被的玻片表面，从而将捕获探针-miRNA-miRtag-报告探针复合物固定在玻片上。随后施加电流使复合物在玻片表面定向排列，以便通过显微镜和电荷耦合器件（CCD）相机检测报告探针5'端携带的荧光条形码。对条形码进行计数和解码，从而获得特定靶标miRNAs的数量。荧光条形码由六个位置组成，每个位置可被四种荧光颜色之一占据，可构建超过4,000种颜色条形码组合，每种组合对应一种特定RNA。
样品制备（即， RNA纯化或细胞/组织裂解液制备，以及捕获探针与报告探针的杂交均在实验台完成。单张载玻片可同时检测12个样本。经过 overnight 杂交后，所有后续样本处理均由自动化前处理工作站完成。加载的载玻片随后转移至数字分析仪进行成像、计数、解码和数据处理。所得数据导入配套软件，在高度用户可控的条件下进一步分析。该检测方法凭借其独特的化学体系、简便的前处理流程、自动化操作、简单的数据类型（计数）以及整体优化的实验流程，实现了高精度的基因表达定量，因而在研究功能性肠病（如IBS）等状态下循环miRNA的表达谱和表达特征方面具有重要应用价值。

<table><tbody><tr><td>nCounter Prep-Station</td><td>Nanostring</td><td>N/A</td><td>必需</td></tr><tr><td>nCounter 数字分析仪</td><td>Nanostring</td><td>N/A</td><td>必需</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>可使用合适的替代设备</td></tr><tr><td>离心机</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>可使用合适的替代设备</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>可使用合适的替代设备</td></tr><tr><td>移液器（1,000、100、20、10 &amp;#181;l）</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>可使用合适的替代设备</td></tr><tr><td>Qiacube</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>可使用合适的替代设备</td></tr><tr><td>PAXgene 血液miRNA提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>763134</td><td>可使用合适的替代设备</td></tr><tr><td>PAXgene 血液采集管</td><td>VWR</td><td>77776-026</td><td>可使用合适的替代设备</td></tr><tr><td>nCounter 人源miRNA检测试剂盒</td><td>Nanostring</td><td>150625</td><td>必需</td></tr><tr><td>nCounter 主试剂盒</td><td>Nanostring</td><td>100050</td><td>必需</td></tr><tr><td>nSolver</td><td>Nanostring</td><td>N/A</td><td>必需</td></tr></tbody></table>

利用多重高通量基因表达平台检测肠易激综合征患者循环mirna的异常变化

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

基因表达检测平台可在单次反应中对多达800个转录本（mRNA或miRNA）进行稳健且高度可重复的定量分析。miRNA检测通过直接成像并数字计数带有彩色荧光条形码探针组（报告探针和捕获探针）标记的miRNA分子来实现转录本计数。条形码直接与成熟的miRNA杂交，这些miRNA的3'端已通过连接一个独特的寡核苷酸标签（miRtag）而被延长。该方法无需进行逆转录和转录本扩增。报告探针包含六个颜色位置，使用四种荧光颜色的不同组合进行编码。利用四种颜色在六个位置上的组合构建基因特异性的彩色条形码序列。杂交后的处理过程在自动化机器人前处理工作站上完成。杂交后，未结合的探针被洗去，三元复合结构（捕获探针-miRNA-报告探针）通过生物素标记的捕获探针固定在链霉亲和素包被的载玻片上。随后使用数字分析仪进行成像和条形码计数。固定在载片上的条形码miRNA通过显微镜和相机进行可视化和成像，独特的条形码被解码并计数。数据质量控制（QC）、标准化和分析由配套检测软件定制开发的数据处理与分析软件完成。该检测在广泛的表达范围内表现出高度线性以及高灵敏度。样本和检测制备过程不涉及酶促反应、逆转录或扩增步骤，操作步骤少，且大部分流程自动化，减少了操作人员带来的变异，从而实现高一致性和良好的技术可重复性。本文中，我们描述了该技术在识别肠易激综合征中循环miRNA异常变化中的应用。

功能性疾病中的转录组扰动可能较为微弱，为了可靠地检测这些微小的表达变化，基因表达的定量必须精确。基因表达平台检测系统通过其高度自动化的特性，以及所采用的独特化学反应，有效降低了技术噪音，从而产生高精度的基因表达数据。如图1所示的技术重复实验，展示了该方法在内源性miRNA（蓝色点）和病毒miRNA（橙色点；管家基因以黄色点表示）表达定量方面均具有高度可重复性。利用该方法，可识别出与健康研究参与者预期表达水平存在偏离的病毒性（图2a）和内源性（图2b）miRNA，作为肠易激综合征（IBS）中的潜在研究靶点。需要注意的是，目前尚不清楚此处检测到的病毒miRNA是来源于整合到人类基因组中的病毒基因，还是来源于病毒载量。由于该检测方法仅对具有单核苷酸特异性的成熟miRNA进行计数，因此与相似的内源性人类miRNA发生交叉杂交的可能性较低。尽管如此，这些分子在稳态水平上的差异仍具有作为生物标志物的研究价值。该方法的高精度使得即使在低表达水平的靶标中出现的扰动也能被检测到，因为这些低丰度转录本的准确检测不会被高丰度转录本所掩盖。微小的扰动亦可被可靠地观察到。图3和图4展示了与健康对照组相比，IBS患者及IBS亚型患者循环miRNA中部分此类扰动；图5和图6（均改编自3）展示了IBS参与者中表达差异最显著的两种上调miRNA（图5：miRNA 342-3p，图6：miRNA 150）。图6为相关软件生成结果图形化输出的一个示例。
<img alt="散点图，miRNA表达分析，Log2计数，人类病毒miRNA比较，线性回归" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 两个技术重复样本的标准化计数。 在两个独立芯片上运行的技术重复样本在标准化miRNA计数（x轴和y轴为log2计数，已对表达量最高的100个miRNA进行标准化）范围内表现出高度线性相关性（r2 = 0.90，y = 1.03x - 0.4）。该散点图包含蓝色表示的内源性人类miRNA数据（654个miRNA）、橙色表示的内源性病毒miRNA数据（80个miRNA）以及黄色表示的看家基因数据（8个基因）。内源性病毒miRNA曾包含在早期版本的检测方法中（本研究使用版本1.4），但目前标准检测中已不再包含，尽管仍可作为定制选项添加。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IBS-C 患者与健康对照组中病毒和人类 miRNA 相关性的散点图比较" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2： IBS-便秘（IBS-C）患者中病毒性和内源性人类miRNA的标准化计数C) 与 健康对照组 扰动在 (a) 病毒（橙色）和 (b) 在此示例中，内源性人源miRNA（蓝色）清晰可见，其中便秘型肠易激综合征（IBS-C）受试者的miRNA表达量（经log2转换，y轴）相对于健康对照组的miRNA表达量（经log2转换，x轴）进行回归分析。大多数miRNA在两组人群中的表达水平非常相似，但部分miRNA显著偏离相关性。这些偏离现象在低丰度和高丰度表达的靶标中均明显存在。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="microRNA 的 LDA 评分图；HC 与 IBS 中 hsamiR 比较，数据分析，对数尺度。" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3： 与健康对照相比，IBS 患者中 microRNA 的表达存在显著且一致的差异。 采用线性判别分析效应量（LDA effect size）方法揭示 IBS 中差异表达的 miRNA，该方法结合了统计学显著性检验与类别内一致性的验证。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IBS-D、IBS-C 中 miR-663b、miR-342-3p 的 LDA 评分比较柱状图及基因表达分析。" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：与健康对照组相比，IBS 亚型中 miRNA 的表达存在显著且一致的差异。 采用线性判别分析效应量（LDA）方法，发现 IBS 亚型（-D：腹泻型，-C：便秘型）与健康对照组相比，miRNA 的表达存在显著差异，该方法结合了统计学显著性检验与类别内一致性的验证。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示miR-342-3p计数的箱线图；IBS亚型与健康对照组比较；包含离群值和极端值。" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
图5： miRNA-342-3p的差异表达。 病因未明的慢性腹痛是肠易激综合征（IBS）的主要症状。该箱线图显示，在所有IBS亚型中，一种与病因未明的慢性膀胱疼痛相关的miRNA——miR-342-3p（y轴为标准化后的计数），其在循环中的表达水平均高于健康对照组。图中横线表示非离群值范围，方框表示四分位距，蓝色方块表示中位数计数。改编自3。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小提琴图比较miR-150表达水平；健康对照与肠易激综合征患者；log2计数；数据可视化分析" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6： miRNA-150 的差异表达 小提琴图显示，与健康对照组相比，IBS 参与者的循环 miR-150 水平显著更高（y 轴为 log2 转换后的计数）。曲线表示该类别中计数的频率，垂直条线代表第 1 四分位数st 和 3rd 四分位数，红色方块表示中位数计数。改编自 3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

我们介绍了一种多重高通量基因表达检测平台的使用方法，该平台通过在生物样本中对分子进行条形码标记和计数来定量基因表达，无需扩增步骤。我们利用该平台对肠易激综合征患者和健康对照者全血中的微小RNA（miRNA）表达水平进行了定量分析。

利用多重高通量基因表达平台检测肠易激综合征患者循环miRNA的异常变化

基因表达平台检测可对多达800种转录本（mRNA或miRNA）的表达水平进行稳健且高度可重复的定量分析……

本多重核酸定量方案的总体目标是对全血中的微小RNA（microRNA）表达进行数字量化。该方法有助于解答消化系统疾病研究中的关键问题，帮助识别失调的分子机制以及包括微小RNA在内的生物标志物特征。该技术的主要优势在于microRNA的定量不依赖于扩增过程。该技术可对分子靶标进行数字计数，且大部分流程实现了自动化。为纯化总RNA，将先前采集并冷冻保存的全血样本解冻，并在室温下孵育两小时。使用水平转子，在室温下以5,000 × g离心10分钟。然后，小心倾倒或用移液器将上清液转移至废液管中，注意不要扰动沉淀。向沉淀中加入4毫升无RN酶的水。牢固盖上盖子，涡旋振荡直至沉淀物明显溶解。然后再次离心管体，弃去上清液。接着向沉淀物中加入 350 微升 BM1 缓冲液，涡旋振荡直至沉淀物明显溶解。然后，将样本转移至一个2毫升的处理管中，用于自动化的总RNA提取。使用市售的RNA提取试剂盒，通过将试剂盒中提供的预装枪头、离心管、缓冲液和试剂加载到自动化RNA提取系统中，对全血样本中的细胞内RNA（包括microRNA）进行自动化纯化。在程序选择菜单中选择Blood miRNA PartA程序，然后启动运行。完成RNA提取，并根据文本方案储存样品。通过使用无RNase水将12个RNA样品归一化至每微升33纳克来制备microRNA样品。使用无核酸酶水对检测试剂盒中提供的microRNA对照品进行1:500稀释，并置于冰上保存。接下来，通过混合13 µL退火缓冲液、26 µL micro R-tag试剂和6.5 µL microRNA对照品，制备退火主混合液。向12个0.2 mL的条状管中各加入3.5 µL退火主混合液，然后向每管中加入3 µL RNA样品。轻弹管壁混匀，使用台式小型微量离心机在2000 × g离心，随后将各管放入热循环仪中，按照以下程序运行。 接下来，通过混合3微升连接缓冲液和19.5微升PEG来配制连接反应主混合液。然后，向每个反应体系中加入2.5微升的连接主混合液。混匀并离心后，将反应管放回48摄氏度的PCR仪中孵育5分钟。然后，在热循环仪模块中直接向每个样品加入 1 µL 连接酶，并按照以下程序孵育反应管。轻轻混匀后离心收集，再向每个样品加入 1 µL 连接产物纯化酶。随后，将反应管放入热循环仪中按如下所示条件进行孵育。孵育后，在样品中加入40微升无RN酶水，混匀并离心。为进行microRNA杂交，将提供的报告探针和捕获探针组在冰上解冻后离心。向报告探针编码集2中加入130微升杂交缓冲液，混匀以制备杂交主混合液。在12个新的0.2毫升条形管中，各加入20微升杂交主混合液。将刚刚制备的microRNA样品在85摄氏度下变性5分钟，然后置于冰上冷却。随后，取5微升microRNA样品加入含有杂交主混合液的各条形管中。将PCR仪程序设置为65摄氏度，反应体系体积为30微升，并将加热盖设为“永久”加热模式，以防止程序结束时降温至4摄氏度。向每支试管中加入5微升捕获探针混合液，并充分混匀。离心后，立即将试管放入设定为65摄氏度的PCR仪中。孵育样品时间不少于12小时，且不超过30小时。设置前处理工作站时，首先将捕获柱和板置于室温下回温，然后对板进行离心。装载预处理工作站时，打开工作站门，将试剂板、芯片、移液吸头、已准备好的样本（置于0.2毫升条状管中）以及两个空的0.2毫升12联管条状管按指定位置放入机器人相应区域。取下条状管管盖和试剂板盖。然后关闭预处理工作站门，从控制面板运行相应的检测程序。为了可视化并计数固定化且定向排列的三元复合物的条形码，需将试剂盒从预处理工作站中取出，使用提供的盖子将其密封，并放入数字分析仪的任意可用插槽中。通过触摸屏创建试剂盒定义文件（CDF），并确保在 CDF 中为每个样本分配适当的报告基因文库文件。扫描完成后，根据相关的质量控制和分析方案，使用U盘或通过电子邮件从数字分析仪下载数据文件，然后进行数据处理与分析。该基因表达平台检测系统因其高度自动化特性可降低技术噪音，其独特的化学反应体系能够产生高精度的基因表达数据。此处展示的技术重复样本表明，该系统在内源性和病毒性miRNA表达定量中均具有高度可重复性。利用该方法，可鉴定出在肠易激综合征（IBS）中相对于健康研究参与者所定义的预期表达水平出现偏离的病毒编码及内源性人类微小RNA，作为感兴趣的目标。该方法具有高精度和高灵敏度，能够检测到低表达目标中的变化，也可可靠地观察到细微的扰动。这些图示展示了与健康对照组相比，IBS患者及IBS亚型中循环微小RNA的部分变化情况。本文展示了肠易激综合征（IBS）参与者中两种显著差异性升高的微小RNA（microRNA）。该小提琴图中的曲线表示miR-150的计数频率。垂直条形代表第一和第三四分位数，红色方块表示中位数计数。采用此方法后，可基于相同技术开展更具针对性的定制化检测，以在更大样本队列中验证生物标志物特征，并探索关键的RNA与蛋白质关联。该技术一经建立，便为生物医学领域的研究人员提供了快速、精准且准确地开发疾病诊断生物标志物组合的途径。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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