利用多重高通量基因表达平台检测肠易激综合征患者循环miRNA的异常变化

本多重核酸定量方案的总体目标是对全血中的微小RNA（microRNA）表达进行数字量化。该方法有助于解答消化系统疾病研究中的关键问题，帮助识别失调的分子机制以及包括微小RNA在内的生物标志物特征。

该技术的主要优势在于microRNA的定量不依赖于扩增过程。该技术可对分子靶标进行数字计数，且大部分流程实现了自动化。为纯化总RNA，将先前采集并冷冻保存的全血样本解冻，并在室温下孵育两小时。

使用水平转子，在室温下以5,000 × g离心10分钟。然后，小心倾倒或用移液器将上清液转移至废液管中，注意不要扰动沉淀。向沉淀中加入4毫升无RN酶的水。

牢固盖上盖子，涡旋振荡直至沉淀物明显溶解。然后再次离心管体，弃去上清液。接着向沉淀物中加入 350 微升 BM1 缓冲液，涡旋振荡直至沉淀物明显溶解。

然后，将样本转移至一个2毫升的处理管中，用于自动化的总RNA提取。使用市售的RNA提取试剂盒，通过将试剂盒中提供的预装枪头、离心管、缓冲液和试剂加载到自动化RNA提取系统中，对全血样本中的细胞内RNA（包括microRNA）进行自动化纯化。在程序选择菜单中选择Blood miRNA PartA程序，然后启动运行。

完成RNA提取，并根据文本方案储存样品。通过使用无RNase水将12个RNA样品归一化至每微升33纳克来制备microRNA样品。使用无核酸酶水对检测试剂盒中提供的microRNA对照品进行1:500稀释，并置于冰上保存。

接下来，通过混合13 µL退火缓冲液、26 µL micro R-tag试剂和6.5 µL microRNA对照品，制备退火主混合液。向12个0.2 mL的条状管中各加入3.5 µL退火主混合液，然后向每管中加入3 µL RNA样品。轻弹管壁混匀，使用台式小型微量离心机在2000 × g离心，随后将各管放入热循环仪中，按照以下程序运行。

接下来，通过混合3微升连接缓冲液和19.5微升PEG来配制连接反应主混合液。然后，向每个反应体系中加入2.5微升的连接主混合液。混匀并离心后，将反应管放回48摄氏度的PCR仪中孵育5分钟。

然后，在热循环仪模块中直接向每个样品加入 1 µL 连接酶，并按照以下程序孵育反应管。轻轻混匀后离心收集，再向每个样品加入 1 µL 连接产物纯化酶。随后，将反应管放入热循环仪中按如下所示条件进行孵育。

孵育后，在样品中加入40微升无RN酶水，混匀并离心。为进行microRNA杂交，将提供的报告探针和捕获探针组在冰上解冻后离心。向报告探针编码集2中加入130微升杂交缓冲液，混匀以制备杂交主混合液。

在12个新的0.2毫升条形管中，各加入20微升杂交主混合液。将刚刚制备的microRNA样品在85摄氏度下变性5分钟，然后置于冰上冷却。随后，取5微升microRNA样品加入含有杂交主混合液的各条形管中。

将PCR仪程序设置为65摄氏度，反应体系体积为30微升，并将加热盖设为“永久”加热模式，以防止程序结束时降温至4摄氏度。向每支试管中加入5微升捕获探针混合液，并充分混匀。离心后，立即将试管放入设定为65摄氏度的PCR仪中。

孵育样品时间不少于12小时，且不超过30小时。设置前处理工作站时，首先将捕获柱和板置于室温下回温，然后对板进行离心。

装载预处理工作站时，打开工作站门，将试剂板、芯片、移液吸头、已准备好的样本（置于0.2毫升条状管中）以及两个空的0.2毫升12联管条状管按指定位置放入机器人相应区域。取下条状管管盖和试剂板盖。然后关闭预处理工作站门，从控制面板运行相应的检测程序。

为了可视化并计数固定化且定向排列的三元复合物的条形码，需将试剂盒从预处理工作站中取出，使用提供的盖子将其密封，并放入数字分析仪的任意可用插槽中。通过触摸屏创建试剂盒定义文件（CDF），并确保在 CDF 中为每个样本分配适当的报告基因文库文件。

扫描完成后，根据相关的质量控制和分析方案，使用U盘或通过电子邮件从数字分析仪下载数据文件，然后进行数据处理与分析。该基因表达平台检测系统因其高度自动化特性可降低技术噪音，其独特的化学反应体系能够产生高精度的基因表达数据。此处展示的技术重复样本表明，该系统在内源性和病毒性miRNA表达定量中均具有高度可重复性。

利用该方法，可鉴定出在肠易激综合征（IBS）中相对于健康研究参与者所定义的预期表达水平出现偏离的病毒编码及内源性人类微小RNA，作为感兴趣的目标。该方法具有高精度和高灵敏度，能够检测到低表达目标中的变化，也可可靠地观察到细微的扰动。这些图示展示了与健康对照组相比，IBS患者及IBS亚型中循环微小RNA的部分变化情况。

本文展示了肠易激综合征（IBS）参与者中两种显著差异性升高的微小RNA（microRNA）。该小提琴图中的曲线表示miR-150的计数频率。垂直条形代表第一和第三四分位数，红色方块表示中位数计数。

采用此方法后，可基于相同技术开展更具针对性的定制化检测，以在更大样本队列中验证生物标志物特征，并探索关键的RNA与蛋白质关联。该技术一经建立，便为生物医学领域的研究人员提供了快速、精准且准确地开发疾病诊断生物标志物组合的途径。