Name: 发电德诺抗原特异性人T细胞受体通过中心的Hemichain的逆转录病毒转导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解通过逆转录病毒转导生成抗原特异性人T细胞受体的新方法。该技术仅需分离单个α或β半链，即可产生具有抗原特异性且亲和力各异的新型TCR，为基因工程免疫治疗中的TCR分离提供简化途径。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 CA148673（NH）；安大略癌症研究所临床研究员奖IA-039（NH）；BioCanRX催化剂资助（NH）；玛格丽特公主癌症基金会（MOB, NH）；加拿大卫生研究院加拿大研究生奖学金（TG）；加拿大自然科学与工程研究理事会研究生奖学金（TG）；安大略省政府（TG, MA）；以及Guglietti研究员奖（TO）支持。HLA和CD1d单体由NIH四聚体核心实验室慷慨提供。

1. 准备受体病毒构建体以编码目标TCR半链
<ol>
	<li>线性化pMX载体，以便在后续步骤中插入TCR基因。使用EcoRI和NotI限制性内切酶在37 °C下消化质粒DNA，反应3小时。表1)8.</li>
	<li>在1.2%琼脂糖凝胶上对消化后的质粒进行电泳。切下约4,500个碱基对（bps）的条带，使用市售凝胶回收试剂盒将其洗脱于30 μl无菌水中9.</li>
	<li>设计针对目标TCR基因的5'和3'引物，使其分别包含15-20个碱基与pMX载体的EcoRI和NotI酶切位点重叠8.</li>
	<li>使用引物扩增TCR基因。对PCR产物进行电泳，并按照步骤1.2所述，回收约1,000 bp的条带。</li>
	<li>将每个线性片段与市售质粒组装预混试剂混合，于50 °C孵育1小时，将TCR基因克隆至经消化的载体中。 
	注意：各组分的相对体积请参考生产商提供的说明书。该组装方法基于 Gibson 最初描述的技术。 等10.</li>
	<li>（可选）通过人神经生长因子受体截短形式（ΔNGFR，氨基酸1-277）标记TCR基因，以标记转导细胞11 由弗林蛋白酶切割位点、丝氨酸-甘氨酸连接子和2A序列分隔12,13设计引物以编码与片段末端重叠的序列，并按照步骤1.3-1.5所述方法组装质粒。 
	注意：这些序列可在参考文献中找到11-13.</li>
	<li>转化感受态细胞 E. coli 按照制造商的说明，使用已构建的质粒14将转化后的细菌接种于琼脂平板（含20 mg/ml 胶体培养基（LB）、15 mg/ml 琼脂和1 μg/ml 氨苄青霉素）上，37 °C 培养18小时。</li>
	<li>在37 °C、200转/分钟的摇床培养箱中，将单个细菌菌落接种于50 ml LB培养基（含20 mg/ml LB和1 μg/ml氨苄青霉素）中培养16小时。</li>
	<li>使用市售的中量质粒提取试剂盒，按照制造商提供的方案纯化质粒。将质粒稀释至浓度约为 1 μg/μl。 
	注意：质粒纯化方案基于碱裂解法15.</li>
</ol>
2. 生成稳定包装细胞系
注意：293GPG 和 PG13 细胞均为贴壁细胞。使用添加 10% 胎牛血清（FCS）和 50 μg/ml 庆大霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养细胞。转染前，将 293GPG 细胞在含 1 μg/ml 四环素的培养基中培养。所有操作步骤间，将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
<ol>
	<li>转染293GPG包装细胞16 在T75培养瓶中培养，使用商品化转染试剂，按照生产商说明书，将第1.9步获得的编码半链的载体导入细胞17注意：在293GPG细胞融合度为50-60%时进行转染。</li>
	<li>吸除293GPG细胞的培养基，转染后1天加入10 ml新鲜DMEM培养基。</li>
	<li>在步骤2.2后的第2天，将转染的293GPG细胞的培养基转移至注射器中，通过0.45 μm滤器过滤，收集瞬时产生的病毒。 
	注意：病毒可立即使用，或于 -80 °C 保存以备后续使用。</li>
	<li>培养 1 × 105 T25 培养瓶中的 PG13 细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。24 小时后，吸除培养基，加入 1.5 ml 来自步骤 2.3 的 293GPG 来源病毒和 1.5 ml DMEM 培养基，并加入终浓度为 8 μg/ml 的 polybrene。</li>
	<li>按照步骤2.4所述，每天更换一次培养基，持续4天，以建立稳定表达编码目标TCR半链的逆转录病毒的PG13包装细胞系。</li>
	<li>吸弃培养基，于末次感染后24小时为PG13细胞系更换新鲜DMEM培养基以继续培养。 
	注意：使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞后进行冻存或传代培养。</li>
	<li>为从转导的PG13细胞系中产生病毒，培养2 x 10⁶6 T75 培养瓶中加入 10 ml DMEM 培养基培养细胞，接种后第三天按步骤 2.3 所述方法收集病毒。 
	注意：病毒最好立即使用，但可在 -80 °C 保存长达两个月。</li>
</ol>
3. 人T细胞的激活与转导
注意：人体样本的获取和使用均遵循经机构伦理委员会批准的方案。使用添加了10%人血清（替代FCS）和50 μg/ml庆大霉素的罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）培养基培养原代人源细胞。所有步骤之间，将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育。
<ol>
	<li>按照制造商的说明书，通过密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）18。</li>
	<li>激活T细胞以诱导逆转录病毒感染所需的增殖。在6孔板中，每孔接种2 × 107个新鲜或解冻的PBMC，加入5 ml RPMI培养基，并添加100 IU/ml重组人白细胞介素-2（rhIL-2）和50 ng/ml抗CD3单克隆抗体（克隆号OKT3），进行培养。</li>
	<li>刺激后第3天，用移液器收集T细胞，以350 × g离心4分钟。弃去上清液，将0.5–1 × 106个T细胞接种至24孔板中，每孔加入1 ml来自步骤2.7的PG13病毒和1 ml补充有200 IU/ml rhIL-2的RPMI培养基。将培养板在1,000 × g、32 °C条件下离心1小时。</li>
	<li>24小时后，用移液器收集T细胞，以350 × g离心4分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 ml来自步骤2.7的PG13病毒和1 ml补充有200 IU/ml rhIL-2的RPMI培养基中。重复此步骤，共进行6次感染。 
	注意：感染次数应根据包装细胞系产生的病毒滴度进行优化。如有必要，可通过每天移除20–30%的细胞来传代培养T细胞，以防止过度生长。</li>
	<li>最后一次感染后24小时，用移液器收集T细胞，以350 × g离心4分钟。弃去上清液，将细胞重悬于含100 IU/ml rhIL-2的RPMI培养基中继续培养。</li>
	<li>在步骤3.5后的2–3天，于4 °C下用HLA多聚体染色T细胞30分钟，随后在4 °C下用抗人CD3及共受体单克隆抗体（mAbs）染色15分钟。通过流式细胞术进行分析。使用无关多聚体和/或未转导的细胞作为阴性对照（图1–3）19。</li>
	<li>若导入的中心半链为TCRα链，可使用市售的Vβ特异性抗体组合，通过流式细胞术分析从头产生的多聚体阳性细胞的Vβ使用情况20。</li>
</ol>
4. 克隆 从头合成 TCR 反向半链
<ol>
	<li>排序 从头合成 通过流式辅助细胞分选法检测第3.6步中的多聚体阳性细胞群。</li>
	<li>使用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法从分选的T细胞中分离RNA21,22. 
	注意：RNA 可在 -80 °C 保存，但应尽快用于合成 cDNA。</li>
	<li>使用市售逆转录-PCR试剂盒，按照制造商说明书从提取的RNA合成cDNA文库23,24.</li>
	<li>若克隆TCRβ反向链，根据步骤3.7设计Vβ基因与TCRβ恒定区特异性引物，并按照步骤1.3–1.9所述方法克隆全长TCRβ基因。若反向链为TCRα，请参见步骤4.5；否则继续至步骤5.1。</li>
	<li>市售的Vα特异性抗体有限，因此无法通过流式细胞术确定Vα基因的使用情况。通过5'-cDNA末端快速扩增（RACE）克隆TCRα反向链25，使用市售的5' RACE试剂盒6.
	<ol>
		<li>按照制造商说明书，从第4.2步提取的RNA中合成适用于5' RACE的cDNA。</li>
		<li>执行 1st 如所述进行PCR扩增 表 2.</li>
		<li>对PCR产物进行电泳，并切下约1,100 bp的条带，具体操作如步骤1.2所述。</li>
		<li>执行 2nd 如所述进行PCR扩增 表3，使用1st 以扩增产物为模板进行下一轮PCR。 
		注意：下方显示的引物序列 表3 设计用于克隆至经 EcoRI 和 NotI 消化处理的 pMX 载体中。</li>
		<li>对PCR产物进行电泳，并按照步骤1.2所述，回收约1,000 bp的条带。</li>
		<li>将TCRα基因克隆至经EcoRI和NotI酶切的pMX载体中，并按照步骤1.5-1.9所述方法纯化质粒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 重建新型抗原特异性TCR克隆
注意：在添加了10% FCS和50 μg/ml庆大霉素的RPMI培养基中培养Jurkat 76细胞及后续细胞系。所有步骤之间，将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育。
<ol>
	<li>使用第2.3步制备的293GPG病毒，将中心TCR半链转导至Jurkat 76细胞26（或等效的TCR-/-人T细胞系）。对于Jurkat 76细胞，每孔接种5 × 104个细胞至24孔板中，加入1 ml病毒液和1 ml RPMI培养基。在1,000 × g、32 °C条件下离心1小时。</li>
	<li>感染24小时后，用移液器收集转导了半链的Jurkat 76细胞，在350 × g条件下离心4分钟。弃去上清液，将细胞重悬于新鲜RPMI培养基中继续培养。</li>
	<li>若半链带有分子标签，则在第5.2步后2-3天通过荧光标记的抗-NGFR单克隆抗体染色，随后进行流式辅助或磁珠辅助细胞分选，以纯化转导细胞（可选）27。</li>
	<li>按照步骤2.1至2.3，制备编码TCR对侧链的293GPG病毒，该对侧链克隆自步骤4.4或4.5。</li>
	<li>为完全重建TCR，使用第5.4步所得病毒，对在步骤5.1–5.3中稳定表达中心TCR半链的T细胞系进行转导。转导操作参照步骤5.1–5.2所述进行。</li>
	<li>在第5.5步后2-3天，按照制造商说明书，使用抗-CD3磁珠辅助细胞分选法纯化CD3+转染细胞27。</li>
	<li>为验证抗原特异性，在CD3纯化后3-5天，对表达由中心TCR半链与不同对侧链配对组成的克隆型TCR的转染细胞进行染色，包括抗-CD3和/或共受体单克隆抗体以及HLA多聚体，随后通过流式细胞术分析细胞（图4–5）19。</li>
</ol>

<ol><li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer+or+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer or viruses.</a> Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYokosuka%2C+T+%22J.Exp.Med%22">J.Exp.Med</a>. , 195, 991-1001 (2002).</li>
<li>Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+TCRs+bind+MHCs%2C+peptides%2C+and+coreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors.</a> Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).</li>
<li>Shimizu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+TCR+and+antigen+complexes+at+an+immunodominant+CTL+epitope+in+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection.</a> Sci. Rep. 3, 3097(2013).</li>
<li>Nakatsugawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+roles+of+each+TCR+hemichain+in+generating+functional+chain-centric+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR.</a> J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).</li>
<li>Ochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+T-cell+Reactivity+by+Exploiting+TCR+Chain+Centricity+for+the+Purpose+of+Safe+and+Effective+Antitumor+TCR+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).</li>
<li>Chamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDR3beta+sequence+motifs+regulate+autoreactivity+of+human+invariant+NKT+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors.</a> J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).</li>
<li>Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+plasmid+vectors+expressing+FLAG-tagged+proteins+under+the+regulation+of+human+Elongation+Factor-1%CE%B1+promoter+using+Gibson+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly.</a> J. Vis. Exp. (96), e52235(2015).</li>
<li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+using+ChIP+to+identify+isoform-specific+gene+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets.</a> J. Vis. Exp. (41), e2101(2010).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Johnson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+structure+of+the+human+NGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression and structure of the human NGF receptor.</a> Cell. 47 (4), 545-554 (1986).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6, e18556(2011).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+optimal+bicistronic+lentiviral+vectors+facilitates+high-level+TCR+gene+expression+and+robust+tumor+cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition.</a> Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+human-derived+packaging+cell+line+for+production+of+high+titer+retrovirus%2Fvesicular+stomatitis+virus+G+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).</li>
<li>Imataki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+can+supplement+suboptimal+Lck-independent+MAPK+activation+in+a+STAT-3-dependent+manner+in+human+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells.</a> J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).</li>
<li>Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alloantigen-specific+anergy+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+by+alloantigen+stimulation+with+co-stimulatory+signal+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade.</a> J. Vis. Exp. (49), e2673(2011).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J. Vis. Exp. (53), e2848(2011).</li>
<li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+antitumor+memory+in+humans+using+in+vitro-educated+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells.</a> Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34(2011).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).</li>
<li>Peterson, S. M., Freeman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+isolation+from+embryonic+zebrafish+and+cDNA+synthesis+for+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis.</a> J. Vis. Exp. (30), e1470(2009).</li>
<li>Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYing%2C+SY+%22Generation+of+cDNA+Libraries%3A+Methods+and+Protocols%22">Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols</a>. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).</li>
<li>Hirano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+CD83+ligand+induces+prolonged+expansion+of+CD8%2B+T+cells+and+preferential+enrichment+for+antigen+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity.</a> Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).</li>
<li>Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27+end+cDNA+amplification+using+classic+RACE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">5' end cDNA amplification using classic RACE.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).</li>
<li>Heemskerk, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirection+of+antileukemic+reactivity+of+peripheral+T+lymphocytes+using+gene+transfer+of+minor+histocompatibility+antigen+HA-2-specific+T-cell+receptor+complexes+expressing+a+conserved+alpha+joining+region%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region.</a> Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+cell+sorting+and+flow+cytometry+sorting+methods+for+the+isolation+and+function+analysis+of+mouse+CD4%2B+CD25%2B+Treg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zhejiang+Univ.+Sci.+B%22%5BJournal%5D)">Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells.</a> J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).</li>
<li>Padovan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+two+T+cell+receptor+alpha+chains%3A+dual+receptor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells.</a> Science. 262 (5132), 422-424 (1993).</li>
<li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transfer+of+tumor-reactive+TCR+confers+both+high+avidity+and+tumor+reactivity+to+nonreactive+peripheral+blood+mononuclear+cells+and+tumor-infiltrating+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes.</a> J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).</li>
<li>Chinnasamy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TCR+targeting+the+HLA-A%2A0201-restricted+epitope+of+MAGE-A3+recognizes+multiple+epitopes+of+the+MAGE-A+antigen+superfamily+in+several+types+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer.</a> J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).</li>
</ol>

大学健康网络已就该方法提交了专利申请，N.H.、M.N. 和 T.O. 被列为发明人。其他作者不存在经济利益冲突。

成功应用该方法的首要条件是实现目的半链在原代T细胞中足够的转导效率。根据我们的经验，使用PG13作为包装细胞系，并以pMX作为逆转录病毒载体，可在人原代T细胞中实现导入基因的稳定且高效的表达。PG13包装细胞可通过单细胞克隆筛选出高滴度的包装细胞，以提高转导效率。此外，T细胞的增殖也是实现逆转录病毒高效转导所必需的。在本方案中，使用可溶性抗CD3单克隆抗体OKT3刺激，并联合高浓度重组人IL-2（rhIL-2），可提供诱导细胞分裂所需的活化信号。可溶性OKT3的刺激能力依赖于单核细胞，可能通过其Fc受体结合实现。因此，该特定刺激方案需要使用未分离纯化的外周血单个核细胞（PBMC），而非纯化的T细胞。为获得最佳实验结果，T细胞应培养于添加人血清的RPMI培养基中。本文所述其他所有细胞均可在含胎牛血清的培养基中培养。
第二， 从头合成 表达抗原特异性TCR的细胞必须可被检测。对于某些TCR半链，如TAK1β， 从头合成 表达TCR的细胞仅在经抗原脉冲的抗原呈递细胞（APCs）刺激后方可被检测到。因此，若在转导中心半链后未立即检测到抗原特异性TCR，则...

T细胞受体（TCRs）是由T淋巴细胞表达的异源二聚体适应性免疫受体，由TCRα和TCRβ链组成。它们通过V(D)J基因片段的体细胞重排生成，从而产生高度多样化的受体库，能够识别几乎无限种类的HLA/肽复合物。在临床上，经基因工程改造以表达针对肿瘤相关抗原的克隆型TCR的T细胞，已在多种癌症治疗中显示出疗效1。然而，许多为此目的而克隆的TCR对目标抗原的亲和力不足，限制了其治疗应用。
本文介绍了一种通过利用链中心性（chain-centricity）来克服现有TCR局限性的方法。已有研究报道，一个TCR半分子链在识别靶抗原过程中可能起主导作用2，此处称之为“中心链”（centricity）。晶体结构分析表明，TCR中的一个中心半分子链可构成其在MHC/肽复合物上结合界面的大部分区域3,4。基于这一概念，我们先前已证明，SIG35α TCRα链能够与多种不同的TCRβ链配对，并保持对HLA-A2呈递的MART127-35肽段的反应活性5。在TAK1 TCR中也获得了类似结果，其中具有中心作用的TCRβ链与多种TCRα链配对后，仍能维持对HLA-A24呈递的WT1235-243肽段的反应性6。MART1和WT1均为肿瘤相关抗原。链中心性原理还被应用于研究CD1d限制性不变的自然杀伤T（iNKT）细胞TCR的抗原识别，方法是将人iNKT TCR中不变的Vα24-Jα18（Vα24i）TCRα链与不同的Vβ11 TCRβ链进行配对7。
在所有情况下，我们均能够生成一个 从头合成 通过将中心TCR半链转导至外周血T细胞，使其与内源性TCRα或TCRβ互补链配对，从而构建TCR多样性库。本质上，该中心半链作为“诱饵”，可用于筛选能够与之配对并形成具有目标抗原特异性的TCR的互补链，所形成的TCR在保持特异性的同时具有不同的亲和力。基于这些新型TCR库，我们成功分离出相较于已知TCR对目标抗原具有更强相互作用强度的克隆型TCR。因此，我们认为该方法将加速临床应用中最优TCR的筛选进程。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>293GPG 细胞</td><td>Ory &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;（参考文献 8）构建</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-010-CG</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-015-CG</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>400-110-IG</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>BioShop</td><td>CCL402</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸</td><td>Life Technologies</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>EZ-10 旋转柱 DNA 凝胶回收试剂盒</td><td>BS353</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>滤膜</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>0.45 mm 孔径 SFCA 膜</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗人 CD271（NGFR）单克隆抗体</td><td>Biolegend</td><td>345104</td><td>克隆号 ME20.4</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗人 CD3 单克隆抗体</td><td>Biolegend</td><td>300440</td><td>克隆号 UCHT1</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Gibson 组装主混合液</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611L</td><td>用于多片段 DNA 组装</td></tr><tr><td>HLA-A2 五聚体</td><td>Proimmune</td><td>取决于抗原肽</td><td>本实验所用 HLA-A2/MART1 多聚体购自 Proimmune</td></tr><tr><td>HLA/CD1d 单体</td><td>NIH 四聚体核心设施</td><td></td><td>根据 NIH 四聚体核心设施提供的方案将单体多聚化</td></tr><tr><td>人 AB 血清</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>人 CD3 磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-101</td><td></td></tr><tr><td>IOTest Beta Mark TCR Vβ 抗体库检测试剂盒</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3497</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 76 细胞</td><td>Heemskerk &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;（参考文献 10）构建</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-060-LG</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha 感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td>用于 EcoRI 和 NotI 消化</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi 试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td>用于质粒纯化</td></tr><tr><td>PC5 标记的抗人 CD8 单克隆抗体</td><td>Beckman Coulter</td><td>B21205</td><td>克隆号 B9.11</td></tr><tr><td>PG13 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-10686</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF 缓冲液套装</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&amp;nbsp;高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>pMX 逆转录病毒载体</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-010</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-9268</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin（重组人白细胞介素-2）</td><td>Novartis</td><td>凭处方销售</td><td>可从 Sigma-Aldrich 购买等效产品</td></tr><tr><td>纯化的抗人 CD3 抗体</td><td>Biolegend</td><td>317301</td><td>克隆号 OKT3，用于 T 细胞刺激</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Life Technologies</td><td>S866</td><td>用于将 NIH 四聚体核心设施提供的单体多聚化</td></tr><tr><td>SMARTer RACE 5'/3&#039;&amp;nbsp; 试剂盒</td><td>Clontech</td><td>634858</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-LL</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 第一链合成系统</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>301604</td><td>10 ml，滑动接头</td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>用于转染 293GPG 细胞</td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

生成中 从头合成 通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人t细胞受体

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T细胞受体（TCRs）在临床上被用于引导T细胞特异性靶向肿瘤，是一种具有前景的免疫治疗方式。因此，克隆针对多种肿瘤相关抗原的TCR已成为众多研究的目标。为了引发有效的T细胞应答，TCR必须以适当的亲和力识别靶抗原。然而，克隆具有此类特性的TCR一直存在挑战，许多现有的TCR对其同源抗原的亲和力未达最佳。在本方案中，我们描述了一种克隆方法 从头合成 利用现有TCR通过半链中心性策略获得高亲和力抗原特异性TCR。已知在某些TCR中，TCRα或TCRβ半链在抗原识别中的贡献并不均等，其中起主导作用的半链被称为中心半链。我们已证实，将中心半链与不同于原始配对链的反向链进行组合，可在保持抗原特异性的同时，调节其与同源抗原相互作用的强度。因此，通过优化中心半链与反向半链之间的配对，可提升特定TCR的治疗潜力。

在不了解哪条半链为链中心性的情况下，应将TCRα和TCRβ链分别克隆并转导至外周血T细胞，HLA-A24/WT1反应性TAK1 TCR即采用此方法图1）。TAK1β的转导显著提高了抗原特异性T细胞的频率。相反，非中心半链的转导则不会产生 从头合成 多聚体阳性T细胞，如TAK1α链所示（图1）。分析时，对NGFR设门+ 如果TCR基因被标记以特异性分析转导细胞（图1-2）。另一方面，如果已知单个中心半链具有显性作用，则可对其进行转导，例如 SIG35α 以及恒定的 Vα24 TCRα 链（图2 和 3). 转导中心型 TCRα 半链后，针对相应同源抗原的 T 细胞频率增加。图2-3这些数据共同表明，将中心型TCRα或TCRβ半链引入外周血T细胞可产生 从头合成...

本文介绍一种通过将具有目标抗原特异性的现有T细胞受体（TCR）的TCRα或TCRβ链，与外周T细胞受体库中的互补半链配对，从而生成抗原特异性T细胞受体（TCR）的新方法。de novo生成的TCR保留了抗原特异性，但亲和力有所不同。

生成中 从头合成 通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人T细胞受体

T细胞受体（TCRs）在临床上被用于引导T细胞特异性地靶向肿瘤，是一种具有前景的免疫治疗策略。因此，……

本实验方案的总体目标是生成识别特定目标抗原的新生T细胞受体（TCR）。该方法有助于在基因工程免疫治疗领域中分离出最优的T细胞受体。该技术的主要优势在于，仅需分离单一的α或β半链，即可生成针对新表位特异性的T细胞受体。洗脱TCR后，通过将每个线性片段与市售的组装主混合剂结合，并在50摄氏度下孵育一小时，对基因进行PCR产物克隆。孵育结束后，按照生产商的说明书，将连接产物转化入化学感受态大肠杆菌（E. coli），并将转化后的细菌接种至琼脂平板，在37摄氏度下培养18小时。次日，挑取单个细菌菌落，接种于50毫升LB（Lysogeny Broth）培养基中，在37摄氏度、200转/分钟的振荡培养箱中培养16小时。然后，使用商品化的中量质粒提取试剂盒，按照生产商提供的说明书纯化质粒，并将DNA稀释至浓度约为1微克/微升，用于293GPG细胞的转染。转染后一天，将293GPG细胞培养物中的转染培养基更换为新鲜的DMEM培养基。更换培养基两天后，用注射器收集培养液，随后通过0.45微米滤器过滤，以收集病毒。接下来，将一乘以十的五次方个PG-13细胞接种于T-25培养瓶中，过夜培养。次日，吸除培养基，加入1.5毫升由293GPG产生的病毒、1.5毫升DMEM培养基以及8微克/毫升的Polybrene。连续四天每天更换一次培养基，以建立稳定的PG-13包装细胞系，用于生产编码目标TCR半链的逆转录病毒。最后一次感染后24小时，将培养基更换为新鲜的DMEM培养基。为从转导细胞系中收获病毒，在T-75培养瓶中用10毫升新鲜DMEM培养基培养6×10⁶个PG-13包装细胞，并在接种后第三天收集病毒，方法如前所述。进行T细胞活化时，在六孔板中每孔加入2×10⁷个PBMCs，加入5 mL RPMI培养基，培养基中需添加重组人IL-2和抗CD3单克隆抗体。刺激后第3天，收集活化的T细胞，离心后将0.5×10⁶至1×10⁶个细胞重悬于1 mL PG-13病毒液和1 mL RPMI培养基中。每孔补充重组人IL-2，后续操作在24孔板中进行。当所有细胞接种完毕后，离心培养板，并将培养板转移至细胞培养箱中。24小时后收集细胞进行离心。随后，用一毫升PG-13病毒和一毫升添加了IL-2的RPMI培养基重悬T细胞沉淀，并按上述方法再次离心培养板。最后一次感染后24小时，收集细胞进行离心，并将T细胞重悬于仅补充IL-2的RPMI培养基中。将细胞放回培养箱继续培养两至三天。随后在4摄氏度条件下，用HLA多聚体染色细胞30分钟。随后在4°C下用抗人CD3和克隆受体单克隆抗体孵育15分钟。使用适当的对照，通过流式细胞术分选多聚体阳性细胞。在24孔板中，每孔接种5×10⁴个Jurkat细胞，每孔加入1毫升RPMI培养基和1毫升293GPG病毒，用于转染含目的中心型TCR半链的Jurkat细胞。离心培养板，然

generating-de-novo-antigen-specific-human-t-cell-receptors-retroviral

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

发电<em&gt;德诺</em&gt;抗原特异性人T细胞受体通过中心的Hemichain的逆转录病毒转导

我们介绍了一种利用逆转录病毒转导技术制备抗原特异性小鼠T细胞的实验方案...

小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

一种快速、简便且经济高效的方案，用于制备供体来源的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（rCTL），以输注给存在CMV、Adv或EBV感染风险的异基因造血干细胞移植（HSCT）受者。该制备工艺符合GMP标准，有助于推动T细胞免疫治疗在专科中心以外的更广泛应用。...

多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

本视频展示了一种制备嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术 离体...

一种用于制备嵌合抗原受体T细胞的离体技术

本视频演示了一种通过逆转录病毒转导生成抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将活化的小鼠CD8+...

一种生成抗原特异性CAR T细胞的技术

利用表达柯萨奇腺病毒受体的转基因技术，通过腺病毒介导的基因转移将外源基因导入初始CD4 T细胞，可实现对调节性T细胞分化的分子机制分析 体外.

腺病毒转导初始CD4 T细胞以研究调节性T细胞分化

本文介绍了一种用于产生和扩增特异性针对特定同种异体抗原的人T细胞克隆的方法。该方案可经调整后用于克隆针对多种肽-MHC复合物配体的特异性人T细胞。...

从外周血中生成人同种异体抗原特异性T细胞

我们提出了一种基于逆转录病毒的单个T细胞受体（TCR）快速且灵活的实验方案 体内 表达系统。逆转录病毒载体用于转导骨髓前体细胞，以研究单个TCR的T细胞发育与功能 体内...

逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成T细胞受体逆转录转基因小鼠

当前方案结合了单细胞配对的人类 T 细胞受体 α 和 β 链测序与简化流程的逆转录病毒载体构建，该载体具有兼容性 体外 和 体内 TCR...

简化单细胞TCR分离及逆转录病毒载体构建 体外 和 在体 内 人类TCR的表达

该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。...

高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

提供了一种详细的方案，用于利用CRISPR/Cas9技术在原代人T细胞中实现大片段、多顺反子结构的高效靶向敲入。 通过...

非病毒法改造人原代T细胞 通过 同源介导的末端连接靶向整合大型DNA模板

了解通过逆转录病毒转导生成抗原特异性人T细胞受体的新方法。该技术仅需分离单个α或β半链，即可产生具有抗原特异性且亲和力各异的新型TCR，为基因工程免疫治疗中的TCR分离提供简化途径。

生成中从头合成通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人T细胞受体

探索更多视频

生成中 从头合成 通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人T细胞受体

探索更多视频

生成中从头合成通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人T细胞受体