辅助性T细胞作为一种遗传方法来研究逆转录病毒转导机制控制其分化和功能

该方案的总体目标是分离原代小鼠辅助性 T 细胞，并用目标基因的逆转录病毒表达构建体转导它们。许多实验系统已被用于了解免疫反应中调节 T 细胞发育和功能的机制。在这里，我们描述了一种使用逆转录病毒转导的遗传方法，该方法经济、高效且在识别调节途径方面信息量很大。

我们使用这项技术来分析 microRNA 的功能，microRNA 是基因表达的重要调节因子。使用逆转录病毒转导，我们已经能够测试单个 microRNA 的功能和辅助性 T 细胞分化。我的合作者 Oliver Garden 将演示原代 T 细胞分离，我将演示逆转录病毒转导。

转染前 24 小时，将融合的细胞板以 1：10 的比例分装在 10 cm 板中，以便第二天细胞达到约 50% 的汇合度。转染前约 1 小时，从细胞中取出培养基，并小心加入 9 毫升新鲜 HEK293 T 培养基，以防止细胞从板中分离。在 6 毫升圆底或 15 毫升锥形管中，加入 5 微克逆转录病毒 DNA、5 微克辅助病毒 DNA 和水，体积为 420 微升。

然后，加入 80 微升 2.5 摩尔氯化钙，使最终体积达到 500 微升。之后，向 DNA 混合物中逐滴缓慢加入 500 微升 2x HBS，同时轻轻涡旋，使溶液连续混合，磷酸钙沉淀在大小均匀的晶体中。随后，将磷酸钙 DNA 混合物转移到组织培养罩中。

将混合物缓慢加入细胞中，同时不断轻轻旋转板，然后将细胞放回培养箱中。为了在第二天收集病毒，去除培养基并用 10 mL 新鲜的 HEK293 T 培养基喂养细胞，注意不要将细胞从板中脱落。晚上，用 3.5 mL 新鲜 HEK293 T 培养基喂养细胞，并在 4 摄氏度下孵育细胞 12 小时。

大约 12 小时后，收集培养基并再次用 3.5 mL 新鲜 HEK293 T 培养基补料细胞。再重复培养基收集 2 次，间隔大约 12 小时，这样可以收集到大约 10 毫升的病毒储液。在此过程中，将脾脏和淋巴结添加到细胞过滤器中，并使用 5 毫升注射器柱塞的末端浸渍。

之后，用 1 到 2 毫升 R10 培养基冲洗它们。然后将细胞转移到 15 毫升锥形管中，并使用 R10 将体积增加到 14 毫升。将细胞在 4 摄氏度下以 600 倍 G 离心 5 分钟。

之后，用一个干净的动作将其倒出，丢弃上清液，以防止干扰细胞上颚。接下来，向细胞中加入 2 mL 冷红细胞裂解缓冲液。混合，然后将细胞置于冰上 3.5 分钟，并在整个过程中轻轻混合。

然后，加入 12 毫升 R10 培养基，并立即在 4 摄氏度下以 600 倍 G 离心 5 分钟。用 R10 培养基再执行洗涤步骤两次，以去除细胞中残留的红细胞裂解缓冲液，避免淋巴细胞死亡。在此步骤中，将每个锥形管的 8 到 10 个细胞分装到 10 个细胞到第 7 个细胞，并在 4 摄氏度下以 600 倍 G 离心 5 分钟。

用一个干净的动作倒出上清液，以防止干扰细胞上颚。然后，重新悬浮细胞和 100 微升热灭活 FBS。接下来，向细胞中加入 100 μL 抗体混合物，在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，在滚筒上轻轻混合。

之后，将微珠重新悬浮在小瓶中，涡旋 30 秒以上。然后将磁珠转移到 15 毫升锥形管中，每毫升磁珠添加 2 毫升 R10 培养基。将试管放入磁铁中 1 分钟。

然后弃去上清液，将珠子重悬于 4 ml R10 培养基中。抗体孵育结束时，每管加入 10 mL R10 培养基洗涤细胞，并在 4 摄氏度下以 600 倍 G 离心 5 分钟。用一个干净的动作倒出上清液，以防止干扰细胞上颚，然后将细胞重新悬浮在 1 毫升 R10 培养基中。

随后，将 2 毫升洗涤过的微珠加入抗体处理细胞管中，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，同时在滚筒上轻轻混合。然后，轻轻地 pi 抚摸 5 次，然后将试管放入磁珠中 2 分钟，重新悬浮细胞珠混合物。将含有阴性选择细胞的上清液转移到新试管中，并再次重复阴性选择。

在该程序中，将 CD4 阳性 T 细胞以 600 倍 G 的离心力在 4 摄氏度下离心 5 分钟，然后每 10 个细胞中重悬于 150 至 200 微升 R10 培养基中，直至第 8 个细胞。接下来，向细胞中加入 2 微升生物素化的 CD25 单线圈抗体储备液，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，并在滚筒上轻轻混合。然后，加入 10 mL 细胞分离柱缓冲液洗涤细胞，并在 4 摄氏度下以 600 倍 G 离心 5 分钟。

然后，去除尽可能多的上清液，并将细胞重悬至每 10 个细胞约 90 微升的最终体积，以达到第七个细胞。随后，每 10 个细胞向第七个细胞中加入 20 微升链霉亲和素珠子，轻轻弹动混合。然后，将它们在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。

在孵育细胞时，准备 MS 柱。孵育结束时，加入 10 mL 细胞分离柱缓冲液洗涤细胞，并在 4 摄氏度下以 600 倍 G 离心 5 分钟。将细胞重悬于 500 μL 细胞分离柱缓冲液中，每 10 至第 8 个细胞。

然后，将 500 μL 细胞悬液涂到柱上并收集流出物。将其再次传递到色谱柱上，然后再次收集流过。然后，用 500 μL 细胞分离柱缓冲液冲洗柱 3 次，并将每个流出点添加到收集的 CD25 阴性细胞中。

如前所述进行洗涤、链霉亲和素珠结合和细胞分离柱制备，但改用 LS 柱。这一次，丢弃流出液，并使用提供的柱塞冲洗色谱柱中的细胞。在分离初始 T 细胞的同时，用 DPBS 稀释的抗 CD3 和抗 CD28 抗体包被 24 个野生组织培养板，并在 37 摄氏度下孵育 2 小时。

在培养细胞之前，用每孔 250 μL DPBS 洗涤板，以去除未结合的抗体。然后，去除 DPBS 并在 R10 培养基中加入 1 毫升幼稚 CD4 阳性 T 细胞过夜。第二天，将细胞在 30 摄氏度下以 900 倍 G 离心 10 分钟。

然后收集培养基，并加入 1 毫升病毒培养上清液，由病毒生产方案制备。随后，加入 1 微升每毫升 8 毫克聚凝胺和 10 微升一磨牙 hepes，以帮助病毒摄取，然后在 30 摄氏度下以 900 倍 G 离心细胞 90 分钟。为了区分细胞，小心去除病毒培养上清液并加入 1 毫升先前收集的培养基，因为它含有 IL2 和其他 T 细胞生长因子。

然后添加随附手稿表 2 中指示的试剂，并将细胞培养 3 至 4 天，以将细胞分化为特定的亚群。该图显示了初始辅助性 T 细胞分离方案每个阶段所选前和后所选群体的典型纯度。CD4、CD8A、MHC II、CD25、CD62L 和 CD44 的表达谱表明 MHC 2 类细胞以及细胞毒性、调节性和记忆性 T 细胞的丢失。

这导致 CD4 阳性 T 细胞的群体大于 95%，其中大约 85%-90% 为幼稚细胞，其余 10%-15% 为效应细胞。在该图中，GFP 表达在未转染或转染的 HEC293 T 细胞中显示 N，并在收集病毒培养上清液后进行分析。对 FSE 和 SSE 图上门的活细胞进行 GFP 分析。

典型的转染效率范围在 30% 至 90% 之间，在 Th0、Th1、Th2、Th9、Th17 和 T reg 极化条件下分化 3 天后，逆转录病毒转导的辅助性 T 细胞中显示 GFP 表达。转导效率在 10% 到 75% 之间变化，具体取决于构建体和极化条件。以下是不同极化条件下辅助性 T 细胞分化的代表性细胞因子谱。

一旦掌握，这些技术就可以成为分析基因功能和辅助性 T 细胞发育和功能的有效方法。请记住，信息丰富的结果取决于细胞和试剂的质量。因此，优化转导方案以及辅助性 T 细胞的分离和分化非常重要。