Name: 模块化 DNA 设备的自动机器人液体处理组件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 了解如何使用液体处理机器人实现模块化DNA设备的高通量自动化组装。本方法通过专用软件工具生成移液指令，显著减少人工操作时间并提高实验可重复性，适用于合成生物学研究。

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感谢Swapnil Bhatia、Alejandro Pelaez和Johnson Lam对Puppeteer项目所做的工作，同时感谢Swati Carr、Rachael Smith和Thomas Costa在本手稿撰写过程中提供的帮助。本研究由美国国家科学基金会（NSF）CAREER奖#1253856资助，同时也由NSF计算探索奖#1522074资助。

1. 指定用于 DNA 装置文库的元件并生成用户/液体处理仪指令 [15 分钟]
<ol>
	<li>使用任意网络浏览器，访问 mocloassembly.com，并上传将用于组合式 DNA 装置设计的所有 DNA 部件的 Genbank 文件。</li>
	<li>所有文件上传完成后，选择所需的 DNA 部件，并将其拖放到空白画布上，按照 DNA 部件预期的最终顺序排列。 
	注意：可选择部件集合或单个部件并放置在画布上。同时，请确保 DNA 部件的排列顺序使得每个部件经 BsaI 酶消化后产生的 5' 和 3' 突出端相互匹配。</li>
	<li>点击页面右下角的“组装”按钮。 
	注意：该工具仅根据每个部件两侧由 BsaI 酶消化产生的四碱基突出端生成有效且可构建的组装方案。如果基于科研人员上传的部件不存在可构建的 DNA 装置，工具将提示未找到任何组装方案。</li>
	<li>转至“计划”标签页，下载工具生成的文件。这些文件包括：
	<ol>
		<li>便于科研人员准备 DNA 样品以及反应所需试剂的、可读性强的板图</li>
		<li>用于液体处理仪的“移液清单”</li>
		<li>所有待组装 DNA 装置的完整注释 Genbank 文件 
		注意：每当液体处理臂访问新的实验耗材时，必须测试其定位。请参考制造商手册，获取有关如何根据需要调整移液臂在 X、Y 和 Z 轴方向位置的详细说明。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备质粒 DNA 和组装用试剂 [3 天]
<ol>
	<li>[第1天] 使用无菌接种环，并在明火附近或超净工作台内操作，将含有适当抗生素的LB-琼脂平板接种所需的细菌甘油菌种。对所有必需的DNA元件均进行此操作，每次接种不同样品之间务必对接种环进行灭菌。将平板置于37 °C培养过夜。 
	注意：冷冻的细菌甘油菌种应尽可能保持在冰上。反复冻融会降低菌种活性，应避免。</li>
	<li>[第2天] 使用无菌移液枪头、牙签或接种环，并在明火附近或超净工作台内操作，从步骤2.1制备的LB-琼脂平板上挑取单菌落，接种至3 mL含有适当抗生素的LB液体培养基中。将培养物于37 °C、300 RPM振荡条件下培养过夜。</li>
	<li>[第3天] 使用任意 commercially available 的质粒小提试剂盒，从细菌培养物中纯化质粒DNA。</li>
	<li>使用所提供的 MoClo_Setup.xlsx 文件，将每种质粒DNA样品用无菌水或TE缓冲液稀释至浓度为20 fmol/µL。</li>
	<li>根据组装工具生成的PDF文件中的板图，将每种稀释后的DNA元件按指定体积加入全裙边96孔PCR板的相应孔中。此SetupPlate在使用前需置于冰上，或用铝箔密封膜封板后于-20 °C保存。</li>
	<li>在冰上配制反应主混合液，组分如下：每20 µL反应体系加入2 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液、0.5 µL T4 DNA连接酶（高浓度，HC）和1 µL BsaI酶。MoClo_Setup.xlsx文件中包含一个计算器表格，可用于辅助计算。
	<ol>
		<li>根据生成的PDF文件中ReagentPlate的板图，将酶主混合液分配至新的全裙边96孔PCR板的相应孔中。此ReagentPlate应始终保持在冰上或置于96孔制冷模块上。 
		注意：ReagentPlate仅在准备在液体处理机器人上运行组装反应时才进行配制。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在液体处理仪上执行组装程序 [变量]
<ol>
	<li>将 SetupPlate(s)、ReagentPlate(s)（置于96孔冰块上）以及所需数量的空全裙边96孔PCR板放置在液体处理仪的工作台上。这些空板将作为 OutputPlate(s)，用于组装反应体系。</li>
	<li>在液体处理仪控制软件中创建已准备好的每块样本板和试剂板的实例，确保其命名与 mocloassembly.com 生成的板图上显示的名称完全一致，包括标记为“Reservoir”的洁净去离子水储液槽。</li>
	<li>在控制软件中使用“Worklist”命令，加载由我们的软件工具生成的.gwl文件，然后执行另一个“Worklist”命令，以运行前一步加载的.gwl文件。</li>
	<li>使用控制器软件的“Run”命令执行脚本。 
	注意：在尝试访问工作台区域之前，务必等待机器人液体处理仪完成当前脚本的全部执行。</li>
	<li>从液体处理仪工作台上取下所有板。未用完的DNA可通过铝密封膜密封 SetupPlate(s) 后于 -20 °C 保存。用粘性密封膜密封 OutputPlate(s)，放入PCR仪或加热块中，并按照以下循环参数运行： 
	37 °C 2小时，50 °C 5分钟，80 °C 10分钟，4 °C 保存 
	注意：反应热循环完成后，OutputPlate(s) 可在 -20 °C 保存，直至准备进行转化。</li>
</ol>
4. 转化反应 [1 天]
<ol>
	<li>将所需数量的感受态 E. coli 细胞分装液（每反应 10 µL）置于冰上融化。 
	注意：为保持无菌，以下步骤应在火焰附近或超净工作台内进行。
	<ol>
		<li>在细胞融化的同时，准备含适当抗生素的 LB-琼脂平板，通过移液将 50 µL 的 0.1 M IPTG 和 50 µL 的 20 mg/mL X-GAL 加至平板表面。若需涂布大量反应，可预先配制母液混合物。使用无菌玻璃棒或玻璃珠将液体均匀涂布，涂布后将平板置于 37 °C 至少静置 15 分钟，再进行细菌涂布。 
		注意：也可在倒平板前将 IPTG 和 X-Gal 加入液态琼脂中，终浓度分别为 2 mM IPTG 和 40 µg/mL X-Gal。由于 X-Gal 对光敏感，应将这些平板避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰上，将每反应 10 µL 感受态细胞分装至新的 96 孔 PCR 板中。此板将作为转化板。</li>
	<li>从输出板（OutputPlate）中取每反应 1–3 µL 加入转化板的对应孔中，冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>用压敏封膜密封转化板，在热循环仪中 42 °C 热激 30 秒，随后立即放回冰上静置 2 分钟。</li>
	<li>向转化板的同一孔中加入 150 µL SOC 培养基，用铝制压敏封膜密封，于 37 °C、900 RPM 振荡条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>使用无菌玻璃棒或玻璃珠，将转化板中每孔的全部内容物涂布于步骤 4.1.1 中制备的 LB-琼脂平板上，确保液体均匀覆盖平板表面。将平板于 37 °C 过夜培养。</li>
</ol>
5. 克隆验证 [2 天]
<ol>
	<li>准备一个或多个含有1.5 mL LB液体培养基（含适当抗生素）的96孔深孔培养板。
	<ol>
		<li>与步骤2.2类似，从转化反应的每个LB琼脂平板上挑取单个白色菌落，接种至深孔培养板中。</li>
		<li>用透气密封膜封板，并在37 °C、900 RPM条件下振荡培养过夜。 
		注：模块化克隆技术采用蓝白斑筛选，因此阳性克隆在LB琼脂平板上呈白色，而空载体则呈蓝色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从细菌培养物中提取质粒DNA（如步骤2.3所述），并送测Sanger测序以验证克隆。</li>
</ol>

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</ol>

Densmore 是 Lattice Automation, Inc. 的总裁兼联合创始人。Timmons 和 McCarthy 是 Lattice 的员工。Lattice 提供用于自动化本文所述诸多流程的软件与服务。

总之，利用现有技术，实现从in-silico设计到液体处理的完整DNA器件构建过程的自动化，是一个切实可行的目标。软件与现代机器人技术能够建立具有成本效益、时间效率高且可扩展的工作流程，同时相比人工方法产生更一致、更可重复的结果。尽管自动化在执行某些实验方案时未必总是最具成本效益的选择，但它确实提高了实验的可重复性，并释放了研究人员宝贵的时间。此外，根据所使用的硬件不同，自动化有时可显著降低实验成本和操作时间，远超传统人工方法所能达到的水平。更重要的是，自动化以形式化的方式明确记录实验方案，避免了依赖临时性、手工式或经验性“最佳实践”的实验模式。本文展示了模块化DNA器件的自动化组装，并提供了读者自行开展此类或类似实验所需的实验方案、电子文件及实物DNA资源。我们希望本工具的公开以及本实验方案的发表，能够作为一项资源，推动DNA组装技术和液体处理机器人领域迈向更加透明和共享的未来。
自动化硬件的实用性在很大程度上取决于其配置 &amp;#38; 所用硬件的功能。例如，我们的液体处理仪使用系统流体置换来驱动吸液和分液指令。驱动系统流体的活塞为相对较大的1 mL注射器，虽然适用于多种体积操作，但会带来2 &#181;L 可准确分配试剂的下限。因此，我们将液体处理仪上设置的克隆反应总体积放大至 20 &#181;L，因为每个分配指令都必须 ≥2 &#181;L. 这使得液体处理仪制备反应的成本每反应翻倍，但执行这些反应所需的人工操作时间显著减少。为解决这一问题，我们使用声波液体分配仪重复了全部96个反应的设置。该设备利用声能将液体直接从一个孔板转移至另一个孔板，可实现远低于标准空气置换手动移液器（低至2.5 nL）的分配体积。使用该设备后，我们成功将反应总体积缩小至250 nL，相比人工制备的10 μL反应，体积减少了40倍。 &#181;L. 由于 dispensing 体积小，且在移液步骤之间无需更换吸头，声波液体处理器能够在更短的时间内完成相同的 96 个反应（&#60;5 分钟）。由于我们通常仅转化 1–3 μL，较小的反应体积还可节省试剂，减少浪费。 &#181;反应体系中的液体量。需要指出的是，自动化硬件与直观软件的结合，可使大量DNA组装反应的生成技术惠及更广泛的学术群体。
本文展示了该软件工具的实用性，但仍有一些功能可进一步拓展其应用范围。首先，每次使用该工具生成组合式组装时，都必须生成新的DNA元件板，这要求科研人员为每次组装实验手动准备这些板。如果能够允许科研人员直接指定DNA板中各元件所在位置，则将更为便捷。这一改进将支持高通量质粒DNA纯化试剂盒的使用，因为研究人员可从类似CIDAR MoClo文库的试剂盒中接种培养物，并在保持每个元件在板上位置不变的前提下，对所有样本进行批量纯化。其次，该工具目前仅支持96孔板。对于需要构建数百个DNA装置的大型项目，所需的DNA板、试剂板和目标板数量可能超出液体处理设备的工作台承载能力。这一问题至少可通过支持更高密度的板型（如384孔或1536孔板）部分缓解。最后，该工具目前仅支持一种类型的液体处理设备和DNA组装策略。尽管使用电子表格软件将工具生成的液体处理指令转换为声波移液格式相对容易，但我们希望未来能原生支持多种不同型号的液体处理设备，并兼容其他常见的DNA组装技术（如Gibson组装31），从而显著提升其适用性。
该自动化组装生态系统的一个关键部分是一套软件工具，可将高级别的组装方案转化为适合自动化的协议，并明确安排在液体处理机器人上运行。尽管已有多种软件工具可供研究人员设计组装方案 在硅基 包括 Benchling、MoClo Planner 和 Raven32，但很少有工具能够将这些设计转化为可在液体处理设备上执行的指令。为此，诸如 PR-PR Automation 和 Puppeteer 等工作33,34,35 已开始提供这些工具。此外，该领域的商业机构正在探索引入的方法 &#34;云实验室&#34; 为大量终端用户提供自动化实验服务。本文所述方案可作为任何以服务形式提供的此类工作的组成部分。
尽管DNA元件的自动化组装对合成生物学具有直接而显著的价值，但我们的方案对更广泛的分子生物学研究群体也同样适用。自动化DNA组装能够并行构建大量已知但相似的遗传元件，从而加快表达文库的合成，用于药物开发研究中的筛选和测试。我们希望开发的软件工具能够使基于组合策略的大规模DNA组装工作更易于实现，并为合成生物学领域以及更广泛的学术界提供有价值的资源。

最早的合成生物学遗传装置，如 Collins toggle 开关1 和 Elowitz repressilator2，证明了生物系统可以通过正向工程设计实现特定的、确定性的功能。自此以来，合成生物学家一直致力于设计生命系统，以逐步实现更复杂的功能，服务于生物材料3、生物治疗药物4,5,6、生物燃料7,8以及生物传感应用9,10,11。通过将模块化 DNA “元件”组合成具有特定功能的“装置”，以实现上述应用，已成为合成生物学的主要目标之一。为了使该过程能够规模化，必须具备一种技术，能够以高效、低成本且最重要的是可重复的方式，从大量元件库中构建出复杂的装置。
如此大规模的组装过程是必要的，因为目前该领域尚缺乏对指导成功生物系统设计与构建规律的完整理解。这一问题因DNA元件表征不足12、元件之间缺乏兼容性与可组合性13，以及合成装置中遗传元件之间存在意外且不良的相互作用而进一步加剧14,15。在缺乏可靠预测模型的情况下，功能性合成遗传装置只能通过试错法获得，这就要求对数十个甚至数百个目标装置的输入-输出信号强度变体进行筛选，并从中选出“最优”变体用于与下游元件组合16。尽管现代标准化DNA组装方法（如Golden Gate17和模块化克隆技术18,19,20）使该过程更为简便，但仍需实验专家逐一执行每个实验方案。随着合成装置在尺寸和复杂性上的增加，可探索的总体设计空间将变得过于庞大，无法通过人工方式进行构建和测试21，且该过程将过于依赖手工操作，难以在该领域实现可重复的重大进展。
在合成生物学和生物元件库（如 iGEM 元件库（http://partsregistry.org））以及 JBEI 可组合元件库出现之前22，以及 SynBioHub23，基因元件并未以任何标准化的组装格式储存。每个项目仅需克隆少量元件，因此克隆工作量较小，相较于实际的研究目标，获得组装完成的元件构建体是可实现且微不足道的。分子克隆通常 临时的 并且基于限制性酶切位点和内切酶的可获得性进行操作，而非遵循任何标准化流程。由于缺乏标准化，使得任何克隆方案的自动化都难以实现，因为下一次克隆反应几乎不可能遵循完全相同的流程。此外，DNA组装的自动化需要在设备（液体处理机器人及其配套软件和耗材基础设施）方面投入大量资金，同时也需要投入大量时间来生成操作指令，以准确设定处理各类液体的参数以及运行这些协议所需的精确操作序列。对于小规模的克隆工作而言，这些投入难以证明其合理性。而更大、更复杂的遗传装置设计与标准化组装协议的结合24,25 创造了一个使这些过程的自动化变得非常实用的环境。诸如 Opentrons OT-One 之类的低成本机器人26 也正在不断涌现，使得资金有限的实验室也能获得这项技术。此外， &#34;云&#34; 实验室27 包括 Transcriptic 和 Emerald Cloud Lab 以及学术机构 &#34;生物铸造厂&#34; 例如爱丁堡基因组制造中心、伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校iBioFab以及麻省理工-布罗德制造中心，这些机构利用机器人技术，快速且重复地为各类客户组装多种设计，同时维护一个包含基础DNA元件和组装技术的通用资源库，以支持未来的订单需求。
在实现DNA组装过程自动化时，最大的挑战之一是为液体处理设备生成移液指令。尽管这些设备的软件界面通常易于使用，但组合式DNA组装所需的复杂移液操作仍要求科研人员手动明确指定每一次的吸取和分配命令。这在工作流程中形成了主要瓶颈，并使脚本生成过程与手动操作一样容易出现移液错误。因此，迫切需要一种能够自动化整个流程的软件工具，涵盖从装置文库的设计、移液指令的生成，到为研究人员提供所需的微孔板/试剂配置方案。在本研究中，我们利用开发的软件工具，自动化设计了一个小型的组合式DNA装置文库，并将试剂（缓冲液、水、酶）和DNA元件（图1b）混合至96个单管模块化DNA组装反应中。该工具的使用无需任何编程基础，具有可扩展性、高通量特性，并默认支持组合式设计。我们证明，在两种不同的自动化液体处理平台上制备的克隆反应，其获得经序列验证的正确克隆的频率与手动制备的反应相当（95%），且所需人工操作时间显著减少。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;硬件 / 软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO 150液体处理机器人</td><td>Tecan</td><td></td><td>配备8通道移液臂的定制液体处理仪&lt;br/&gt; http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo</td></tr><tr><td>Freedom EVOware Standard（版本 2.4 Service Pack 2）</td><td>Tecan</td><td></td><td>用于控制 Freedom EVO 150 液体处理系统的软件&lt;br/&gt; http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware</td></tr><tr><td>Echo 550</td><td>Labcyte</td><td></td><td>声学液体分配仪&lt;br/&gt; http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT</td><td>Sorvall</td><td></td><td>大型台式摆桶离心机</td></tr><tr><td>MasterCycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950040015</td><td>96孔加热块热循环仪&lt;br/&gt; https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html</td></tr><tr><td>ECHOTHERM 制冷/加热干浴器</td><td>Torrey Pines Scientific</td><td></td><td>EVO 150 工作台用加热/冷却模块&lt;br/&gt; https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr</td></tr><tr><td>台式微量离心机 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418000017</td><td>标准18孔微量离心管架&lt;br/&gt; https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;资源&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mocloassembly.com</td><td>Lattice Automation</td><td></td><td>用于组合式DNA组装的网络工具&lt;br/&gt; mocloassembly.com</td></tr><tr><td>CIDAR MoClo 部件试剂盒</td><td>AddGene</td><td>1000000059</td><td>本研究中使用的所有DNA元件的细菌甘油菌种试剂盒&lt;br/&gt; https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/</td></tr><tr><td>CIDAR ICE 信息库</td><td>CIDAR 实验室</td><td></td><td>质粒DNA图谱注册库&lt;br/&gt; https://ice.cidarlab.org/folders/8&lt;br/&gt; https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;L 导电吸头</td><td>Tecan</td><td>30 057 818</td><td>无菌 50 &amp;mu;Tecan液体处理仪用L型导电吸头&lt;br/&gt; http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips</td></tr><tr><td>2 mL 深孔96孔培养板</td><td>美国 Scinetific</td><td>5678-0285</td><td>用于培养大量样品的细菌培养平板&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>美国 Scineticific</td><td>1615-5599</td><td>一次性微量离心管&lt;br/&gt; http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx</td></tr><tr><td>呼吸更轻松密封膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763624-100EA</td><td>用于细菌培养板的透气密封膜&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en&amp;&region=US</td></tr><tr><td>全裙边、低矮型 96 孔 PCR 板</td><td>GeneMate</td><td>T-3183-2</td><td>所有步骤中使用的 PCR 板&lt;br/&gt; https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R</td></tr><tr><td>PCR板用铝密封膜</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>用于PCR板保存的铝封膜&lt;br/&gt; https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1</td></tr><tr><td>用于PCR板的聚烯烃密封膜</td><td>GeneMate</td><td>T-2450-1</td><td>PCR扩增过程中用于PCR板的塑料密封膜&lt;br/&gt; https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1</td></tr><tr><td>PCR冷却器</td><td>Eppendorf</td><td>22510525</td><td>96孔冷块&lt;br/&gt; https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenCatch 质粒 DNA 小提试剂盒</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>2160250</td><td>质粒DNA纯化试剂盒&lt;br/&gt; http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶（HC）</td><td>Promega</td><td>M1794</td><td>高浓度T4 DNA连接酶&lt;br/&gt; https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794</td></tr><tr><td>BbsI 限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539L</td><td>BbsI 酶，10,000 单位/毫升&lt;br/&gt; https://www.neb.com/products/r0539-bbsi</td></tr><tr><td>BsaI 限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R0535L</td><td>BsaI 酶，10,000 单位/毫升&lt;br/&gt; https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶缓冲液套装</td><td>普洛麦格</td><td>C1263</td><td>10x T4 DNA连接酶缓冲液&lt;br/&gt; https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;szlig;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>Zymo Research</td><td>I1001-25</td><td>0.5 M IPTG 溶液&lt;br/&gt; http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg</td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚基 &amp;szlig;-D-半乳吡喃糖苷（X-GAL）</td><td>Zymo Research</td><td>X1001-25</td><td>20 mg/ml X-GAL 溶液&lt;br/&gt; http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Zymo Research</td><td>A1003-25</td><td>35 mg/ml 卡那霉素溶液&lt;br/&gt; http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate</td></tr><tr><td>羧苄青霉素（二钠盐）</td><td>Fisher</td><td>BP26481</td><td>1 g 羧苄青霉素（氨苄青霉素类似物）&lt;br/&gt; https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin</td></tr><tr><td>SOC液体培养基</td><td>Teknova</td><td>S0225</td><td>用于制备SOC肉汤的粉末培养基&lt;br/&gt; http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm</td></tr><tr><td>LB肉汤（Lennox）培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td>用于制备LB肉汤的粉末培养基&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>LB 肉汤琼脂培养基（Lennox）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897-1KG</td><td>用于制备固体培养基平板的含琼脂LB培养基&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en&amp;&region=US</td></tr><tr><td>Alpha-Select Gold高效感受态细胞</td><td>Bioline</td><td>BIO-85027</td><td>高效化学感受态 E. coli 细胞&lt;br/&gt; http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>引物 VF</td><td></td><td></td><td>5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3'&#039;&lt;br/&gt; 用于Sanger测序和菌落PCR的引物</td></tr><tr><td>引物VR</td><td></td><td></td><td>5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; 用于Sanger测序和菌落PCR的引物</td></tr></tbody></table>

模块化dna器件的自动化机器人液体处理组装

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

模块化DNA组装技术的最新进展使合成生物学家能够测试由单个遗传元件组合而成的“器件”所代表的可用“设计空间”中的更大范围。然而，手动组装如此大量的器件耗时较长、容易出错且成本较高。合成生物学研究日益增长的复杂性和规模要求一种高效、可重复的方法，以支持大规模、复杂且高通量的器件构建。
本文在两种液体处理机器人平台上自动化了基于II型限制性内切酶的模块化克隆（MoClo）技术的DNA组装流程。自动化液体处理机器人需要针对不同黏度的液体（例如酶、DNA、水、缓冲液）仔细且往往繁琐地优化移液参数，同时还需要明确编程以确保DNA元件和试剂的正确吸取与分配。这使得复杂组装的手动脚本编写与手动DNA组装同样容易出错且耗时，因而亟需一种能够自动生成功率脚本的软件工具。为此，我们开发了一款基于网页的软件工具 http://mocloassembly.com，用于从以Genbank文件格式上传的基本DNA元件生成组合式DNA装置文库。我们提供对该工具的访问权限，以及来自液体处理设备软件的导出文件，其中包含优化后的液体类别、耗材参数和工作台布局。所有使用的DNA元件均可通过Addgene获取，其数字图谱可通过波士顿大学BDC ICE数据库访问。上述各项要素共同为其他机构实现模块化克隆实验及相关流程的自动化奠定了基础。
本文介绍的自动化DNA组装工作流程可实现DNA元件的可重复、自动化、高通量生产，并降低了因重复性手动移液操作而产生的人为错误风险。测序数据显示，通过该工作流程生成的自动化DNA组装反应正确率约为95%，与手动反应制备相比，所需人工操作时间仅为后者的4%。

本文展示了利用两种自动化机器人液体处理平台，从多种基本DNA元件自动模块化组装96个DNA装置的过程（图1b）。每个转录单元（TU）由启动子、核糖体结合位点、基因和转录终止子线性排列组成，并克隆至特定的目的载体中。转录单元是许多层级式遗传电路设计中的关键组成部分28,29,30，因此是本方法的理想概念验证对象。从实验开始到获得经序列验证的克隆，整个过程约需5天，本文所述工作流程的概览见图1a。
利用所述工具和方案，我们获取了多项指标，可用于在给定科学家需构建的克隆反应数量的情况下，确定最佳的组装平台。图2a展示了三种模式下反应组装时间的比较。执行时间是指完成组装96个反应所需的所有移液步骤的总时间，包括所有DNA片段和试剂的分配。手动操作时间是指实验人员在准备克隆反应或设置液体处理仪运行软件过程中所需参与的总时间。图2b比较了不同方法之间的成本。所示成本为每种方法制备单个反应的成本，包含酶和一次性移液吸头的价格，基于各方法的最低典型反应体积（液体处理仪为20 µL，手动操作为10 µL，声波移液器为250 nL）。对手动操作和液体处理仪制备的两组共96个反应的单克隆均进行了测序，声波移液器制备的反应则选取了其中12个进行测序（图2c）。手动操作组和液体处理仪组96个克隆中，95%获得了正确序列。声波移液器样本子集中83%的序列正确，但最后两个反应未能产生任何白色菌落，可能是由于在DNA和试剂分配完成后液滴混合不充分所致。图2d展示了克隆反应效率，以白色菌落数与总菌落数的比值衡量，手动操作（94%）与液体处理仪组装反应（84%）之间的效率相近。有趣的是，当使用声波移液器缩小最终反应体积时，我们注意到当反应体积小于1 µL时，反应效率显著下降（补充图1 &amp; 补充表2）。这可能是由于反应热循环过程中发生蒸发，导致反应体系中盐浓度升高所致。
<img alt="DNA组装的合成生物学工作流程图，展示组合表达文库。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54703/54703fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 自动化DNA装置文库构建工作流程。 
(a) 本研究所展示的实验工作流程概览。（1）研究人员首先上传所有拟使用的DNA元件及载体的Genbank文件。（2）随后选择拟用于组装的DNA元件。（3）该工具将生成自动化液体处理系统的加样列表，以及用于辅助手动添加DNA元件和酶预混液的孔板图谱。（4）利用DNA和试剂板以及生成的加样列表，研究人员在液体处理系统上执行克隆反应的组装。（5）反应完成后，进行转化并涂板，以用于后续分析。(b) 本研究所使用的DNA元件列表。共使用了3个启动子、3个核糖体结合位点、4个编码序列和1个转录终止子，以构建包含96个转录单元（TUs）的组合文库。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/54703fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验室自动化方法的比较：执行时间、成本、错误率和转化效率。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54703/54703fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图2. 三种不同反应组装方式的比较。 
(a) 手动操作、液体处理仪和声波移液器分别完成96个反应的组装所需的时间。手动组装耗时2小时10分钟，全部为实际操作时间。液体处理仪执行移液指令所需时间相近（2小时6分钟），但其中仅一小部分时间（5分钟）为实际操作时间。声波移液器执行液体转移所需时间显著更短（5分钟），且实际操作时间极少（5分钟）。 (b) 每种组装方法单个克隆反应的成本。该价格包括所用酶和移液枪头的费用。 (c) 来自全部96个组装转录单元（TUs）的单菌落测序结果。正确克隆的比例在所有组装方法之间具有可比性。需注意，仅有一部分（12个）来自声波移液器制备样品的96个组装产物进行了转化。有两个反应未能产生任何白色菌落，可能是由于在输出板（OutputPlate）中DNA与酶主混合液液滴混合不充分所致。(d) 手动组装与液体处理仪制备反应之间克隆反应效率的比较。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/54703fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1. 反应效率随反应体积减小而降低。 
当反应体积缩小至1 µL以下时，反应效率显著下降。该趋势在两种不同的终浓度DNA条件下均可见；然而，若可接受较低的反应效率，科研人员可选择使用更小的反应体积以节省试剂成本。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/Supplemental_Figure_1.pdf">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1。 
不同移液体积下 DNA 和酶液体类别的参数表。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/Supplemental_Table_1_V2.xlsx">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2。 
反应效率计算。提供了通过手动操作和液体处理仪制备的 96 个转化反应中 12 个的原始 CFU 数值。同时提供了在声波移液器上测试较小终反应体积的 CFU 数值。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/Supplemental_Table_2.xlsx">请点击此处下载该文件</a>。

本文介绍了一种在液体处理机器人上使用模块化克隆DNA组装方法实现模块化DNA“元件”组装的自动化工作流程。该方案采用一种直观的软件工具，用于生成组合式DNA元件文库的液体处理工作站移液清单，并通过两个液体处理平台进行了演示。

模块化DNA器件的自动化机器人液体处理组装

模块化DNA组装技术的最新进展使合成生物学家能够显著测试更多可用的“设计空间”，即由单个遗传元件组合而成的“装置”。然而，手动组装如此大量的装置耗时、易出错且成本高昂。合成生物学研究日益复杂和规模化，迫切需要一种高效、可重复的方法来实现大规模、复杂且高通量的装置构建。本文介绍了一种基于II型切口限制性内切酶的模块化克隆（MoClo）技术的DNA组装流程，并在两种液体处理机器人平台上实现了自动化。自动化液体处理机器人需要对不同黏度液体（如酶、DNA、水、缓冲液）的移液参数进行细致且通常繁琐的优化，同时需要明确编程以确保DNA片段和试剂的正确吸取与分配。这使得复杂组装的手动脚本编写与手动DNA组装同样具有挑战性，因而需要一种能够自动生成功能脚本的软件工具。为此，我们开发了一款基于网络的软件工具（http://mocloassembly.com），用于从以Genbank文件形式上传的基础DNA片段生成组合式DNA装置文库。我们提供了该工具的访问权限，以及来自液体处理设备软件的导出文件，其中包含优化后的液体类别、耗材参数和工作台布局。所使用的所有DNA片段均可通过Addgene获得，其数字图谱可通过波士顿大学BDC ICE注册库获取。这些要素共同为其他机构实现模块化克隆实验及类似协议的自动化奠定了基础。本文所展示的自动化DNA组装工作流程能够可重复地、自动化地、高通量地生产DNA装置，显著降低了因重复性手动移液而产生的人为错误风险。测序数据显示，该工作流程生成的自动化DNA组装反应正确率约为95%，与手动反应制备相比，所需人工操作时间仅为后者的4%。

本DNA组装方案的总体目标是实现DNA元件可重复、可扩展、自动化和高通量的生产。本研究旨在满足对稳健且用户友好的软件工作流程的需求，该流程可根据高级DNA元件设计自动生成液体处理设备的移液指令。该技术的主要优势在于，自动化反应制备具有可重复性和可扩展性，与手动制备相比，所需人工操作时间可减少至仅4%。该方法的可视化演示至关重要，因为自动化步骤的学习难度较高，且涉及实验与计算方法的结合。本研究开发了一款可自动生成功率脚本的软件工具。使用任意网页浏览器，访问 MoCloAssembly。com 并上传所有将用于组合式 DNA 装置设计的 DNA 部件的 GenBank 文件。上传所有文件后，选择所需的 DNA 部件。可以选择部件集合，也可以选择单个部件。将部件拖动到空白画布上。排列DNA片段，使每个片段的5'端和3'端突出序列相互匹配。按照DNA片段预期的最终顺序放置各类型的部件。点击页面右下角的“组装”按钮。请注意，该软件工具仅会根据 BSA1 酶消化后每个元件两侧的四个碱基对突出端生成有效的可构建组合。转到“方案”标签页，下载工具生成的文件。这些文件将包含便于科研人员准备DNA样本及反应所需试剂的可读性板图、液体处理仪的挑取列表，以及所有待组装DNA装置的完整注释GenBank文件。在开始模块化DNA组装之前，请按照文本方案中的描述制备质粒DNA。该流程中最关键的步骤是使用工具生成的板图，正确地向设置板和试剂板中加入相应组分。根据装配工具生成的 PDF 文件中的板图，将每种稀释后的 DNA 组分指定体积加入全裙边 96 孔 PCR 板的相应孔中。将此设置板置于冰上，待用。在冰上，用以下组分配制反应主混合液。每 20 微升反应体系中，加入 2 微升 0X T4 DNA 连接酶缓冲液、0.5 微升 T4 DNA 连接酶和 1 微升 BSA1 酶。根据生成的 PDF 文件中试剂板的板图，将酶的主混合液分配至新的全裙边 96 孔 PCR 板的相应孔中。将该试剂板置于冰上或 96 孔冷冻块上保存。开始此操作时，将设置板和试剂板放置在液体处理仪的工作台上。同时放置一个空的全裙边96孔PCR板。该空板将作为输出板，用于组装反应体系。通过创建已准备的每个样本和试剂板的实例，配置液体处理仪的控制软件，确保其名称与 MoCloAssembly.com 生成的板图上显示的名称完全一致，包括标记为 reservoir 的洁净去离子水槽。在控制软件中使用 Worklist 命令，加载由我们的软件工具生成的 GWL 文件，然后使用另一个 Worklist 命令执行前一条命令中加载的 GWL 文件。使用控制器软件的“运行”命令执行脚本。在液体处理机器人完成脚本执行后，从液体处理仪工作台取下所有板。通过用铝密封膜密封设置板，并在零下20摄氏度保存，以保存剩余的DNA。用粘性封板膜密封输出板，置于PCR仪或加热块中，并按照以下循环参数运行：37摄氏度孵育2小时，50摄氏度孵育5分钟，80摄氏度孵育10分钟，最后在4摄氏度保存。为保持无菌状态，该操作应在火焰附近进行。将所需数量的E.coli感受态细胞分装物置于冰上融化。在细胞融化的同时，准备含有适当抗生素的LB琼脂平板。配制含有IPTG和X-GAL的主混合液。将100微升主混合液用移液器加到每块平板表面，并使用玻璃珠均匀涂布。在接种细菌前，将平板置于37摄氏度孵育至少15分钟。在冰上将每种反应的10微升感受态细胞分装至新的96孔PCR板中，以制备转化平板。从输出板中取一到三微升每种反应液，加入转化板的对应孔中，冰上孵育五分钟。用粘性封膜密封转化板，于42摄氏度在热循环仪中热激30秒。立即置于冰上冷却两分钟。向转化板的同一孔中加入 150 微升 SOC 培养基，用粘性封膜密封，在 37 摄氏度、900 转/分钟振荡条件下孵育 1 小时。1 小时后，将转化板每孔的全部内容物涂布于先前准备好的 LB 琼脂平板上。使用玻璃珠均匀涂布平板表面。将平板在37摄氏度下孵育过夜。转化后的第二天，准备一个或多个96孔深孔培养块，每孔加入1.5毫升LB肉汤。使用无菌牙签，在火焰附近操作，从每个转化反应的LB琼脂平板上挑取单个白色菌落，并接种至深孔培养块中。使用透气封膜密封培养板，于37摄氏度、900 RPM振荡条件下过夜培养。随后，使用任意商业化的试剂盒从细菌培养物中分离质粒DNA，并提交进行Sanger测序以验证克隆。在所有三种模式下比较了反应组装时间。手动组装耗时两小时十分钟，全部为实际操作时间。液体处理机器人执行移液指令所需时间与之相近，但其中实际操作时间仅为五分钟。声波移液器执行液体转移所需时间显著更短，且实际操作时间极短。该图表显示了每种组装方法的单次反应成本。此成本包括所用酶和移液枪头的费用。在96个手动和液体处理仪样本中，95%获得了正确的序列。从声波分配器制备的样本中，仅对96个完整组装中的12个进行了转化，其中83%是正确的。两个反应未能产生任何白色菌落，可能是由于输出板中DNA与酶预混液液滴混合不充分所致。通过白色菌落数量与总菌落数量的比值来衡量克隆反应效率，结果显示手动组装与液体处理仪组装的反应效率百分比相当。使用我们的工具，研究人员可借助液体处理机器人构建组合型DNA文库。该方法具有可重复性、可扩展性，能够节省宝贵的研究人员时间，并降低因人工执行重复性复杂移液操作而产生的移液误差风险。观看本视频后，您应掌握如何使用我们的在线工具生成用于模块化克隆反应的组合型组装方案，以及如何在液体处理机器人上执行两个生成的移液脚本。我们设想，利用液体处理机器人进行自动化DNA组装，只是未来合成生物学实验室中的一个步骤。随着设计复杂性的增加，我们预计类似的方法将越来越普遍，并且很荣幸能够在此过程中实现这一初步进展。

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