一种B族链球菌的小鼠模型 链球菌 阴道定植

该动物模型的总体目标是建立B族链球菌（Group B Streptococcus，简称GBS）在小鼠阴道部位的定植。该方法有助于我们理解有关B族链球菌定植的关键问题，例如，哪些细菌因子在定植过程中起重要作用，以及宿主免疫应答如何影响细菌在阴道的持续存在。该技术的主要优势在于，接种后通常无需使用麻醉剂、免疫抑制剂或增稠剂，即可实现超过90%的定植率。

每只小鼠取0.5毫克β-雌二醇，置于15毫升锥形管中涡旋振荡，直至所有结块完全散开，β-雌二醇呈现为细粉状。接着，每只小鼠取100微升芝麻油，经0.45微米滤器过滤后加入该管中，再次涡旋振荡。当激素在油中形成均匀悬浮液后，将试剂吸入一支新的10毫升注射器中，并安装一支18号、1英寸长的针头。

每只小鼠取100微升悬浮液，分装至一支1毫升结核菌素注射器中，并为每支注射器安装一支无菌的26号、半英寸针头。随后，将100微升β-雌二醇注射至每只动物腹腔的左下或右下象限。在注射当天，将5毫升目标GBS菌株的液体培养物接种于Todd Hewitt肉汤（THB）中，于37°C过夜培养。

次日早晨，将GBS以1:10的体积比转接到新鲜的THB培养基中，在37摄氏度下孵育2至3小时，直至细菌达到对数中期。然后，将该亚培养物转移至无菌的15毫升锥形管中，离心收集菌体。用200微升无菌PBS重悬菌体沉淀。

然后，将悬浮液的总体积用 PBS 补充至每 10 只小鼠 1 毫升，使在新的 5 毫升培养管中 OD600 达到 0.4。将培养物转移至新的 15 毫升离心管中，重新离心收集细菌。随后，用相当于原始体积十分之一的 PBS 重悬菌体细胞。

留取50微升细菌用于系列稀释，并接种于THB琼脂平板，以确定接种物的准确CFU。然后，用200微升凝胶加样枪头吸取10微升GBS，用手拇指和食指捏住第一只动物颈部背侧松弛的皮肤并固定，同时固定其尾部。将枪头插入阴道腔5至10毫米，缓慢释放全部接种液体积。

然后立即松开颈部皮肤，并提起尾巴以抬高动物的后躯，同时让其前肢在硬质表面上行走。一分钟后，目视检查阴道开口处是否有接种物反流。在进行拭子取样前，先将棉签用 PBS 预先润湿，并如前所示固定其中一只小鼠。

将拭子插入阴道腔内10毫米深处，轻轻顺时针旋转四次，再逆时针旋转四次，同时对阴道壁施加轻微压力。将拭子放入含有100微升PBS的1.5毫升微量离心管中，涡旋震荡管和拭子约15秒，使细菌从棉纤维上释放。然后用PBS对每个样本进行系列稀释，并取20微升稀释度为1:10至1:10,000的样品，接种于按制造商说明制备的鉴别培养基琼脂平板上，于37摄氏度培养24小时。

GBS 菌落呈亮粉色或紫红色。收集阴道灌洗液时，使用 200 微升加样枪头将 20 微升 PBS 加入阴道腔内。在腔内轻轻吹打整个液体体积上下四次。

然后，使用同一枪头将全部液体吸出。对于后续的灌洗液分析，将灌洗液转移至0.7毫升的微量离心管中。对于组织解剖及匀浆，用70%乙醇喷洒已处死动物的腹部腹面，再使用无菌剪刀打开腹盆腔。

将肠管移位以暴露生殖道。随后，在子宫体与卵巢之间的位置，于两侧子宫角的中段进行剪切。使用剪刀和镊子分离附着在生殖道上的内脏脂肪、膜状组织和膀胱，并将这些组织向尾侧移动。

然后，尽可能靠近外阴处横向切断阴道，以将生殖道与身体分离。将完整的生殖道转移至无菌培养皿中，并使用新的剃须刀片进行一次横向切割，将子宫与宫颈分离。再通过另一次横向切割，将宫颈与阴道分开。

然后，使用无菌镊子将每份组织转移至预先称重的、含有500微升PBS和匀浆珠的个别2毫升离心管中。称量每个2毫升离心管以确定组织重量。随后， tightly 密封螺口管，并在组织匀浆仪中以最大速度匀浆组织，持续1分钟。

为了定量细菌载量，将25微升组织匀浆液进行连续稀释，并取1:10至1:10,000的稀释液接种于鉴别培养基琼脂平板上，于37摄氏度培养24小时。为保存用于细胞因子定量的样品，需将匀浆液在负20摄氏度冷冻。在这些图像中，通过湿片法阴道灌洗液检测显示了小鼠动情周期的四个阶段。

在动情周期的发情前期接种的小鼠，其B族链球菌（GBS）定植时间长于动情周期其他各阶段的小鼠，尤其是接种时处于动情间期的小鼠。持续的动情期可促进A909株GBS在CD-1小鼠体内的持续存在，接种后两周仍有90%的小鼠观察到定植。在典型的实验中，接种前给予一次β-雌二醇处理，接种一周后仅有40%至50%的小鼠出现定植，回收的GBS平均数量与定植率相当。

研究表明，在大多数 CD-1 小鼠中维持持续性动情期可促进 GBS 在阴道的持续定植。在非近交系 CD-1 小鼠和近交系 FVB 小鼠中，GBS A909 在阴道部位的持续存在时间约为一周；而在近交系 BALB/c 和 C57BL/6 小鼠中，大多数小鼠在接种后一周即建立定植，并可持续一个月或更长时间。

在接种动物中观察到表达GFP的无乳链球菌（GBS），表明GBS附着于小鼠阴道上皮，并与阴道内其他固有菌群紧密相邻。接种过程中需防止回流，以确保所有小鼠均成功定植。一旦掌握该技术，根据动物数量的不同，操作可在一至两小时内完成。

该模型可使宿主/病原体相互作用领域的研究人员探索细菌（如B族链球菌）在女性生殖道中定植的能力。此实验流程可用于测试新型化合物或益生菌疗法，以回答有关治疗干预的其他科学问题。