Name: B组的小鼠模型链球菌阴道定植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学习建立B组链球菌小鼠阴道定植模型，用于研究宿主免疫反应和细菌定植机制。该方法无需麻醉即可实现超过90%的定植率，为测试抗GBS治疗策略提供可靠平台。

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我们感谢圣地亚哥州立大学动物实验中心的负责人及工作人员在动物饲养方面提供的支持。在本研究工作期间，K.A.P. 获得了 ARCS 奖学金以及稻盛基金会奖学金的资助。K.S.D. 获得了美国国立卫生研究院 R01 项目（项目编号：NS051247）的资助。

所有动物实验均经圣地亚哥州立大学实验动物护理办公室批准，并在公认的兽医标准下进行。本方法的建立使用了8至16周龄的雌性小鼠。
1. β-雌二醇的制备与腹腔注射
<ol>
	<li>佩戴适当的个人防护装备（PPE）后，用称量纸称取β-雌二醇（0.5 mg/只小鼠）。注意： β-雌二醇可通过皮肤和黏膜表面吸收。</li>
	<li>将β-雌二醇转移至15 ml锥形管中，涡旋振荡至无结块，使β-雌二醇呈细粉状。用10 ml注射器吸取芝麻油（100 µl/只小鼠）。使用0.45 µm滤器将芝麻油经注射器滤入含有β-雌二醇的15 ml锥形管中。涡旋振荡15 ml锥形管，直至β-雌二醇在芝麻油中形成均匀的混悬液。</li>
	<li>用一支新的10 ml注射器吸取β-雌二醇混悬液。使用18 G、1英寸针头，将混悬液分装至1 ml结核菌素注射器中，每管100 µl。为每只小鼠准备一支注射器。为每支结核菌素注射器安装一支新的无菌26 G、½英寸针头。</li>
	<li>在细菌接种前24小时，向每只小鼠腹腔注射含于100 µl芝麻油中的0.5 mg β-雌二醇（5 mg/ml）。注射部位位于下腹部象限，沿腹中线偏右或偏左，操作方法如前所述28。 
	注：注射部位无需清洁或剪毛。</li>
</ol>
2. 使用B族链球菌进行阴道接种
<ol>
	<li>接种前一天，在Todd Hewitt肉汤（THB）中于37 °C培养5 ml目标GBS菌株（如A909（Ia血清型））的过夜液体培养物。</li>
	<li>将GBS过夜培养物按1:10体积比转接到新鲜THB中，于37 °C继续培养。培养至对数中期（OD600 = 0.4–0.5）。注意：具体时间通常为2–3小时，取决于GBS菌株。</li>
	<li>将上述亚培养物转移至无菌15 ml锥形管中，在3,000 × g离心5分钟以收集菌体。吸除上清液。用200 µl无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬菌体沉淀。</li>
	<li>使用重悬后的菌体沉淀，在新的5 ml培养管中加入3–5 ml PBS（每10只小鼠使用1 ml），调节至OD600 = 0.4。此时菌液浓度约为1 × 108菌落形成单位（CFU）/ml。转移至新的15 ml锥形管中，在3,000 × g离心5分钟重新收集菌体。吸除上清液。</li>
	<li>用原始体积1/10的PBS重悬菌体沉淀。例如，若沉淀来自3 ml OD600 = 0.4的菌液，则用300 µl PBS重悬。注意：此即用于动物接种的最终菌液（约1 × 109 CFU/ml）。</li>
	<li>保留50 µl该菌悬液，用于系列稀释并在THB琼脂平板上涂布，以确定确切的接种量。</li>
	<li>每只小鼠接种10 µl最终菌悬液，使每只小鼠接受1 × 107 CFU的细菌。
	<ol>
		<li>接种时，用手固定小鼠，将操作者拇指和食指夹住小鼠颈背部松弛皮肤以固定头部，同时固定尾巴，操作方法如前所述28。</li>
		<li>用200 µl加样枪头吸取10 µl步骤2.6中制备的GBS菌液。将枪头插入阴道腔5至10 mm，缓慢释放10 µl接种物。 
		注意：为尽量减少器官损伤风险（尤其在较年轻或体型较小的小鼠中），建议使用加样枪头而非标准200 µl枪头。</li>
		<li>接种后立即松开颈部皮肤，并抬起小鼠后肢，通过握住尾巴并让前肢在硬质表面上行走约1分钟，以促进接种物在体内的分布。</li>
		<li>目视检查阴道口是否有接种物流出。若观察到回流，可使用新的枪头调整或扩大阴道口，以促进回流液体重新进入腔内。此外，也可用移液器吸回流出的接种物并重新接种。 
		注意：若需给予局部药物、益生菌或目标蛋白，可在生理缓冲液中以不超过20 µl的体积注入阴道腔。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 擦拭阴道腔以定量分析B族链球菌载量
<ol>
	<li>为每只小鼠准备一个1.5 ml微量离心管，加入100 µl PBS。在采样前，先将拭子浸入PBS中预湿。</li>
	<li>按照步骤2.7.1所述方法固定小鼠，将拭子插入阴道腔内10 mm。轻轻顺时针旋转拭子4次，再逆时针旋转4次，同时对阴道壁施加轻微压力。</li>
	<li>将拭子转移至含有100 µl PBS的1.5 ml微量离心管中。接种前，将微量离心管涡旋振荡约15秒，以使细菌从拭子上释放。用PBS对每个样本进行系列稀释，并取20 µl稀释液（1:10至1:10,000）接种于按制造商说明制备的鉴别培养基琼脂平板上。将平板在37 °C下培养24小时。GBS菌落呈亮粉色或紫红色。其他内源性菌群会被抑制，或呈现为蓝色、白色或灰色菌落。</li>
</ol>
4. 收集阴道灌洗液
<ol>
	<li>按照步骤 2.7.1 所述固定小鼠。使用 200-µl 加样枪头，向阴道腔内加入 20 µl PBS。在腔内轻柔吹打整个液体体积 4 次，然后用同一枪头将全部液体吸出。注意：如果灌洗液因黏液而较黏稠，可使用标准的 200 µl 枪头收集最终的灌洗液。</li>
	<li>若需保存灌洗液用于细胞因子分析或菌落形成单位（CFU）定量，则将其加入 0.7-ml 微量离心管中。若需确定动情周期阶段，则将至少 5 µl 灌洗液滴加到玻璃载玻片上，并在光学显微镜下以 100 倍放大观察细胞形态。注意：有关动情周期各阶段的示例，请参见 图 1。</li>
</ol>
5. 组织解剖与匀浆
<ol>
	<li>每只小鼠准备三个 2 ml 螺口管（每个组织各一个：阴道、宫颈和子宫）。在每个管中加入足量（0.4–0.5 g）1.0 mm 氧化锆珠，以覆盖管底的锥形部分。</li>
	<li>在采集组织前，将准备好的管在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟，特别是在定量细菌载量时。向每管中加入 500 µl 无菌 PBS。灭菌后称量每根管的重量，并记录以供后续参考，用于计算回收的组织重量。</li>
	<li>采用机构批准的方法（如 CO2 窒息法和颈椎脱位法）处死小鼠。用 70% 乙醇喷洒腹部腹侧。使用无菌剪刀切开腹盆腔，提起背部皮肤和腹肌，并移开肠道，使生殖道暴露。</li>
	<li>用 70% 乙醇对剪刀进行灭菌，必要时擦拭干净，然后在子宫体与卵巢之间的中段横向剪断两侧子宫角。使用剪刀和镊子从生殖道上分离内脏脂肪、膜结构和膀胱，向尾部方向操作。</li>
	<li>按照步骤 5.4 所述方法对剪刀进行灭菌。尽可能靠近外阴处横向剪断阴道，以将生殖道与身体分离。提起并取出完整的生殖道，置于无菌培养皿中。</li>
	<li>使用新的刀片进行一次横向切割，将子宫与宫颈分离。用 70% 乙醇对刀片灭菌后，再进行一次横向切割，将宫颈与阴道分离。注意：会有极少量子宫组织仍附着于宫颈；也会有极少量阴道组织仍附着于宫颈。</li>
	<li>使用无菌镊子将各组织分别转移至含有 PBS 和匀浆珠的相应 2 ml 管中。每次处理不同组织之间，用 70% 乙醇清洁镊子。</li>
	<li>称量每个 2 ml 螺口管的重量，减去管的原始重量以确定组织重量。组织重量通常在 20–100 mg 之间。 tightly 密封螺口管，并在组织匀浆仪中以最大速度匀浆 1 分钟。</li>
	<li>为定量细菌载量，取 25 µl 组织匀浆液进行连续稀释，并将稀释液按 1:10 至 1:10,000 比例接种于鉴别培养基琼脂平板上。按照步骤 3.3 所述条件培养平板。若需保存样本用于细胞因子定量，将组织匀浆液于 -20 °C 冻存。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了进一步推动对B族链球菌（GBS）在宿主环境中与宿主及其他微生物相互作用的理解，需要建立动物模型。本研究描述了在小鼠中建立GBS阴道定植的技术细节。该方案可在不使用麻醉剂接种细菌或采集拭子样本、不使用免疫抑制剂促进定植、不进行阴道预冲洗、也不添加增稠剂的情况下，实现超过&#62;90%的小鼠定植率。此外，该模型具有良好的可重复性，在GBS持续时间及细菌负荷方面，不同实验间的变异程度较小。本研究中展示的代表性结果来自多个独立实验的汇总，可为未来实验设计提供参考；然而，在不同GBS菌株和小鼠品系之间进行直接比较时应谨慎对待。
该模型模拟了人类的定植过程，因为小鼠的黏膜阴道B族链球菌（GBS）定植似乎仅局限于生殖道。尽管已观察到多种GBS菌株可上行至宫颈和子宫25，但小鼠即使在定植数月后也未表现出发病或死亡的迹象。此外，根据所研究的GBS菌株和小鼠品系不同，小鼠表现出持续性或一过性的阴道定植，这分别有助于研究细菌因素和宿主免疫应答。在此模型中，部分小鼠表现出间歇性定植；目前尚不清楚这些小鼠是否在后期时间点被重新定植，还是定植水平在某些时间点降至检测限以下（通常为5...

无乳链球菌，B组 链球菌 （GBS）是一种有荚膜的革兰氏阳性细菌，常从健康成人的肠道和泌尿生殖道中分离得到。20世纪70年代，GBS成为新生儿感染性死亡的首要病原体，每年导致超过7,000例新生儿疾病。1早发性B族链球菌病（EOD）发生于出生后的最初数小时至数天内，常表现为肺炎或呼吸窘迫，并易发展为败血症；而晚发性B族链球菌病（LOD）则在出生数月后发生，以菌血症为主要表现，且常进展为脑膜炎2截至2002年，美国疾病控制与预防中心建议在妊娠晚期对B族链球菌（GBS）阴道定植进行普遍筛查，并对GBS检测阳性孕妇在分娩期间实施抗生素预防性治疗（IAP）。1尽管由于产时抗生素预防（IAP）的实施，美国早发型B族链球菌病的年发病率已降至约1,000例，但B族链球菌（GBS）仍是早发型新生儿败血症的首要病因，且对晚发型感染的发生率并无影响1无论是在宫内、分娩期间，还是迟发性病例中，新生儿暴露于B族链球菌（GBS）均需经历在多种宿主环境与屏障中的存活与穿越、免疫逃逸，而在脑膜炎病例中，还需穿越高度调控的血脑屏障。2在新生儿发生这些致病性相互作用之前，首先是母体阴道部位的初始定植。在发达国家和发展中国家，母体B族链球菌（GBS）阴道定植率介于8%至18%之间，平均定植率估计为12.7%3,4孕妇阴道道中GBS的定植可能表现为持续性、间歇性或一过性5有趣的是，母亲年龄 &#62; 36年与持续定植相关6已确定多种与GBS阴道定植相关的生物学和社会经济学危险因素。生物学因素包括胃肠道GBS定植以及缺乏 乳酸杆菌 在肠道内。然而，种族、肥胖、卫生状况和性行为也与GBS的阴道携带有关7.
尽管B族链球菌（GBS）因引起新生儿感染而臭名昭著，但它同样可在围产期和产后导致多种 maternal 感染。患有阴道炎的女性中 GBS 定植率升高8，在某些情况下，GBS 甚至可能是致病原9。此外，妊娠期间 GBS 可沿生殖道上行，导致羊膜腔内感染或绒毛膜羊膜炎10。而且，在高达3.5%的妊娠病例中，GBS 可播散至膀胱，引起尿路感染或无症状性菌尿11。妊娠期间 GBS 菌尿与产时发热、绒毛膜羊膜炎、早产以及胎膜早破的风险增加相关12。综上所述，阴道道内存在 GBS 与多种宿主组织感染相关，因此清除该部位的 GBS 对于母婴健康至关重要。
直到最近，关于无乳链球菌与宫颈阴道道相互作用的研究大多仅限于 体外 细胞模型13-15。这些 体外 实验已揭示出对细菌黏附至关重要的细菌因子，包括表面蛋白，如菌毛和丝氨酸富集重复序列17,18以及双组分调控系统15,19 以及阴道上皮对GBS的全局转录应答19然而，要全面阐明阴道道内宿主与微生物之间的相互作用，需要一个可靠的动物模型。早期研究表明，可在接种小鼠的阴道道中回收到B族链球菌（GBS）20,21 和大鼠22 在妊娠和非妊娠状态下均进行了研究。2005年，研究人员在小鼠中建立了B族链球菌（GBS）阴道定植的短期模型，以评估噬菌体裂解酶在24小时时间内治疗阴道GBS定植的效果。23数年后，研究人员建立了一种长期的无乳链球菌（GBS）阴道定植小鼠模型，用于研究调控GBS持续定植的宿主与细菌因素。该模型已鉴定出多种参与定植的GBS相关因子，包括表面附属结构17,18 以及GBS双组分系统19,24该模型有助于鉴定宿主应答机制19,25 并用于测试多种治疗策略，包括免疫调节肽26 和益生菌27本方案提供了将无乳链球菌（GBS）接种至小鼠阴道并随后追踪定植情况及采集样本以进行进一步分析的必要指导。

<table><tbody><tr><td>芝麻油&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-雌二醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875-1G</td><td>注意：佩戴适当的个人防护装备。&amp;beta;-雌二醇可通过皮肤和黏膜表面吸收。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l 凝胶上样吸头&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1252-0610</td><td></td></tr><tr><td>泌尿生殖道无菌海藻酸钙拭子</td><td>Puritan</td><td>25-801 A 50</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar B族链球菌培养基</td><td>DRG International</td><td>SB282</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt 液体培养基</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>7161C</td><td></td></tr><tr><td>18 G，1.5 英寸针头</td><td>BD</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>26 G，0.5 英寸针头</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m PVDF 注射式滤器</td><td>Whatman</td><td>6900-2504</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（1×）</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

一种b族链球菌的小鼠模型 链球菌 阴道定植

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

无乳链球菌 （B组 链球菌，B群链球菌（GBS）是一种革兰氏阳性菌，可无症状定植于10%至30%成年人的胃肠道及阴道。在免疫功能低下的人群中，包括新生儿、孕妇和老年人，GBS可转变为侵袭性病原体，引发败血症、关节炎、肺炎和脑膜炎。由于GBS是导致新生儿感染的主要细菌性病原体，目前的预防措施包括在妊娠晚期对孕妇进行阴道GBS定植筛查，并对GBS阳性的母亲在围产期给予抗生素治疗。较高的阴道GBS载量是新生儿感染和定植的危险因素。然而，目前对促进或允许GBS在阴道定植的宿主与细菌因素仍知之甚少。本实验方案描述了一种通过单次β-雌二醇预处理建立持续性GBS阴道定植的小鼠模型，并结合每日取样以测定细菌负荷。该方案还详细说明了如何施加其他干预性治疗或感兴趣试剂，以及如何采集阴道灌洗液和生殖道组织。该小鼠模型将有助于深入理解GBS与宿主在阴道微环境中的相互作用，从而为妊娠期间控制母体阴道定植及防止向易感新生儿传播提供潜在的治疗靶点。此外，该模型也有助于增进对女性阴道道中细菌与宿主相互作用的普遍机制的理解。

在建立该模型的过程中，对影响无乳链球菌（GBS）阴道定植持续时间的多种因素进行了观察。为了确定接种时动情周期阶段对GBS细菌持续性的影响，在接种当天通过阴道灌洗液对小鼠进行动情周期分期。图1展示了通过湿片法阴道灌洗液检测所确定的小鼠动情周期的四个阶段，这是一种成熟 established 方法29。根据初始动情周期阶段将小鼠分组，并通过阴道拭子随时间监测GBS的持续定植情况。在动情前期（proestrus）阶段接种的小鼠，其GBS定植时间显著长于其他动情周期阶段的小鼠，尤其是接种时处于动情间期（diestrus）的小鼠（图2）。基于这些结果，在当前模型中，小鼠于GBS接种前一天接受β-雌二醇处理，以使其同步进入动情前期（proestrus）阶段。
其他小鼠生殖道感染模型表明，当小鼠通过外源性雌二醇处理维持在动情期时，病原体持续存在的能力增强30,31</...

本实验方案的目的是模拟人类B组 链球菌属 在小鼠模型中研究无乳链球菌（GBS）的阴道定植。该方法可用于探究宿主免疫反应及细菌因素在GBS阴道持续定植中的作用，也可用于评估治疗策略。

一种B族链球菌的小鼠模型 链球菌 阴道定植

无乳链球菌（B族链球菌，GBS）是一种革兰氏阳性菌，可无症状定植于人类胃肠道及阴道……

该动物模型的总体目标是建立B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）在小鼠阴道部位的定植。该方法有助于我们理解关于B族链球菌定植的关键问题，例如，哪些细菌因素对定植至关重要，以及宿主免疫反应如何影响细菌在阴道的持续存在。该技术的主要优势在于，接种通常可在无需使用麻醉剂、免疫抑制剂或增稠剂的情况下，实现超过90%的定植率。首先，将每只小鼠所需的0.5毫克β-雌二醇置于15毫升锥形管中涡旋震荡，直至所有结块完全消失，β-雌二醇呈现为细粉末状。接着，将每只小鼠所需的100微升芝麻油通过0.45微米滤器经注射器过滤至该管中，再次涡旋震荡混合。当激素在油中形成均匀悬浮液后，将该试剂吸入一支新的10毫升注射器中，并安装一根18号、1英寸长的针头。将悬浮液分装，每只小鼠取 100 微升加入一支 1 毫升结核菌素注射器中，并为每支注射器装配一支无菌的 26 号半英寸针头。随后，将 100 微升 β-雌二醇注入每只动物腹腔的左下或右下象限。在注射当天，于 Todd Hewitt 肉汤（THB）中培养 5 毫升目标 GBS 菌株的过夜液体培养物，37 摄氏度培养。次日早晨，将GBS以1:10的体积比转接至新鲜的THB培养基中，在37摄氏度下孵育2至3小时，直至细菌达到对数中期。然后，将转接后的培养物转移至无菌的15毫升圆锥形离心管中，离心收集菌体细胞。用200 µL无菌PBS重悬菌体沉淀。然后，将悬浮液的总体积用 PBS 补足至每 10 只小鼠 1 毫升，使在新的 5 毫升培养管中 OD600 达到 0.4。将培养物转移至新的 15 毫升离心管中，重新离心收集细菌。随后，用相当于原始体积十分之一的 PBS 重悬菌体细胞。留取 50 微升细菌用于系列稀释，并接种于 THB 琼脂平板，以确定接种物的准确菌落形成单位（CFU）。然后，用 200 微升加样枪头吸取 10 微升 GBS，用手拇指和食指捏住第一只动物颈部背侧松弛的皮肤以固定，并同时固定其尾部使其 immobilization。将枪头插入阴道腔内 5 至 10 毫米，缓慢推出全部接种液体积。然后立即松开颈背部皮肤并提起尾巴以抬高动物后躯，同时使其前爪在硬质表面上行走。一分钟后，目视检查阴道开口处是否有接种物反流。在棉签取样前，先将棉签用 PBS 预先润湿，并如前所示固定其中一只小鼠。将拭子插入阴道腔内10毫米，轻轻顺时针旋转四次，再逆时针旋转四次，同时对阴道壁施加轻微压力。将拭子放入含有100微升PBS的1.5毫升微量离心管中，涡旋震荡管和拭子约15秒，使细菌从棉纤维上释放。随后，用PBS对每个样本进行系列稀释，并取20微升稀释度为1:10至1:10,000的样品，接种于按生产商说明书制备的鉴别培养基琼脂平板上，于37摄氏度培养24小时。GBS 菌落呈亮粉色或紫红色。收集阴道灌洗液时，使用 200 微升

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