利用磁激活细胞分选与流式细胞术检测Trypanosoma brucei变异表面糖蛋白的转换

本方法的总体目标是从整个种群中分离出表达特定变异表面糖蛋白（VSG）的锥虫，并鉴定出那些已从起始优势VSG转换为其他任何VSG的寄生虫。该方法有助于解答锥虫生物学中的关键问题，例如：哪些因素或事件会影响寄生虫种群中VSG的转换。该技术的主要优势在于，它比以往发表的方法更快，并且能够简便地对发生转换与未发生转换的细胞进行定量分析。

当实验室最初开始研究抗原变异时，第一个问题是如何检测稀有的变异细胞。这类问题实际上在多年前的免疫学研究中已经得到解决，即通过磁激活细胞分选技术来富集不具有特定性状的细胞。将这种非选择性方法应用于抗原变异研究，似乎是一个极具前景的思路。

首先，将 List 427 株血液锥虫培养至每毫升 0.5 至 100,000 个的密度。取 50 × 10⁶ 个细胞分装至 15 毫升离心管中，随后离心。保留 1 × 10⁶ 个细胞进行培养，用于后续作为阳性和阴性抗体对照。

用移液器吸除大部分上清液，管中残留约 750 µL。将细胞转移至 1.5 mL 离心管中。最后，在 4 °C 条件下以 2800 ×g 离心 4 分钟。

然后用移液器吸除所有上清液。将细胞重悬于150微升培养基中，并加入适当稀释倍数的初级抗变异表面糖蛋白抗体或抗VSG抗体。接着，在4摄氏度下涡旋振荡细胞10分钟。

用800至1000微升冷的培养基洗涤细胞。在4摄氏度下以5200 × g离心4分钟。吸除上清液后，用1毫升培养基重悬细胞并再次离心。

吸去上清液，将沉淀重悬于 100 µL 培养基中。加入 110 µL 针对一抗类型的合适磁珠激活细胞分选微珠。用移液器反复吹打混匀，然后涡旋振荡。

细胞涡旋的同时，设置磁性激活分离柱。在分离柱下方放置一个15毫升离心管，用于收集预冲洗培养基。加入2毫升培养基以预冲洗分离柱。

接下来，从涡旋振荡器上取下样品，加入 800 至 1000 微升冷的培养基。离心样品，然后弃去上清液以去除未结合的抗体。用一毫升培养基重悬细胞沉淀，并再次离心。

此次吸走上清液时，需在离心管中留下 100 微升。用力振荡离心管，直至沉淀完全重悬。加入 1 毫升培养基，上下吹打以充分重悬细胞。

取下用于收集预处理缓冲液的15毫米离心管，更换为新的15毫升离心管，用于收集含有转化后寄生虫的流穿液。将细胞悬液加入已预处理的层析柱中。用柱下放置的15毫升离心管收集流穿液，通常每1毫升培养基加锥虫悬液需要6至7分钟完成流穿。

接下来，用一毫升培养基将柱子洗涤两次，并将流出液收集到同一离心管中。将总体积约为三毫升的流出液均分至两个1.5毫升微量离心管中。然后将离心管置于冰上。

向柱中加入三毫升培养基，并将柱子插入一个15毫升离心管中。此步骤可获得表达起始显性VSG的细胞。取300微升此洗脱液并置于冰上保存，其余部分可弃去。

为建立阳性对照，从起始细胞培养物中取约 100,000 个细胞，用移液器转移至 1.5 毫升微量离心管中。同样操作制备阴性对照。对流穿样品和阳性对照样品进行离心。

然后移除并弃去上清液。将阳性对照细胞重悬于100 µL含适当稀释度的荧光标记抗VSG一抗的培养基中。接着，将一份流穿组分的沉淀重悬于100 µL含适当稀释度的荧光标记抗VSG一抗的培养基中。

用该悬液重悬第二个流穿管中的沉淀，得到一个混合管。用移液器反复吹打充分混匀。涡旋振荡细胞，然后加入 800 至 1000 微升冷培养基。

将样品在 4 摄氏度、5200 ×g 条件下离心 4 分钟，然后弃去上清液以去除未结合的抗体。用 1 毫升培养基洗涤细胞，随后再次离心细胞。阳性对照、阴性对照以及先前置于冰上保存的洗脱细胞。

弃去上清液。随后，向样品中加入148.5 µL培养基。接着，加入25 µL绝对计数微球，再加入1.5 µL碘化丙啶染色液。

用175微升培养基重悬阳性对照和阴性对照沉淀。现在可将样品上样至流式细胞仪进行检测。这些流式细胞术图显示了在诱导产生双链DNA断裂的锥虫群体与未诱导细胞群体中细胞分选的结果。

左侧图显示前向散射与侧向散射，可用于区分样本中添加的活细胞、死细胞以及微球。随后可根据散射特性设置门控，以确定这些细胞群体。右侧图仅显示根据左侧图所设散射门控被分类为活细胞的细胞。

在此情况下，起始的优势VSG为VSG two。对碘化丙啶染色呈阳性的细胞为死细胞，这些细胞出现在图中Q one和Q two区域。

对优势VSG染色呈阳性而对PI染色呈阴性的细胞位于第三象限（Q3），属于污染细胞。最后，位于第四象限（Q4）的细胞为活细胞，其对优势VSG染色呈阴性，被视为发生VSG转换的细胞。该图显示了在有或无诱导断裂条件下，锥虫群体中计算得到的观察到的VSG转换频率。

体外随机转换的水平相对较低。尽管诱导断裂会导致显著更多的细胞转换为非优势VSG。一旦掌握，该技术可在约三小时内完成。

在进行该实验操作时，全程保持样品低温并充分重悬沉淀物（尤其是在柱上分离前）至关重要。完成该步骤后，可采用其他方法如RNA测序来进一步探究更多问题，例如在转换群体中表达的是哪些VSG。该方法通常用于检测VSG转换，也可用于分离和定量表达任何目标表面蛋白的寄生虫。