Name: 检测布氏锥虫变体表面糖蛋白通过磁性细胞分选和流式细胞仪开关 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习使用磁性细胞分选和流式细胞仪检测布氏锥虫变体表面糖蛋白开关的方法。该技术可快速分离表达特定VSG的锥虫并鉴定稀有变异体，为研究抗原变异机制提供高效工具。

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我们感谢 George Cross 在锥虫生物学方面的总体指导。本工作还得到了比尔和梅琳达·盖茨基金会GCE项目对DS的资助、美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1325261）对MRM的资助，以及美国国立卫生研究院/过敏与传染病研究所（资助号#AI085973）对FNP的资助。我们感谢 Galadriel Hovel-Miner 提供含有 I-SCEI 基因及其识别位点的菌株。

注意：整个操作过程中必须将细胞置于冰上。全程均应使用预冷的培养基。
1. 样品采集
<ol>
	<li>将利什曼原虫427株血液型锥虫培养至密度为0.5–1×10⁶个/mL。最好以少量寄生虫起始培养。离心50×10⁶个细胞。6 细胞/样本在1,500 × g离心10分钟。务必留下1 × 106 用于后续实验的阳性与阴性抗体对照的培养细胞。 
	注意：本方案也可用于从动物血液中分离的锥虫（详见讨论部分）。</li>
	<li>用移液器吸出或倒掉大部分上清液（保留约 750 µl）。将细胞转移至 1.5 ml 微离心管中。</li>
	<li>在4 °C下，于微型离心机中以5,200 x g离心4分钟，然后移除上清液。</li>
</ol>
2. 磁性标记
<ol>
	<li>在 150 µl 培养基（例如含血清的 HMI-9）中重悬细胞，并加入适当稀释倍数的抗 VSG 一抗。 
	注意：抗 VSG 一抗为实验室自制，使用稀释倍数为 1:50。请务必使用未标记荧光染料的抗 VSG 一抗。</li>
	<li>在 4 °C 冷室中，使用涡旋振荡仪适配器-60 以 6–8 档速度涡旋振荡细胞 10 分钟。用 800–1,000 µl 冷的含血清 HMI-9 洗涤细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 5,200 × g 离心 4 分钟，吸除上清液。用 1 ml 含血清 HMI-9 洗涤后，按上述条件再次离心，吸除上清液。将沉淀重悬于 100 µl 含血清 HMI-9 中。</li>
	<li>加入 110 µl 磁性激活细胞分选（MSC）微珠。根据所用抗 VSG 一抗的种属来源，选择相应的抗小鼠、抗兔或抗生物素微珠。充分混匀。在 4 °C 冷室中涡旋振荡细胞 10 分钟。</li>
	<li>在细胞涡旋振荡的同时，将一个磁性激活分选柱/样品安装于分离磁铁上。确保在分选柱下方放置收集容器（我们使用 15 ml 离心管）以收集流穿液。整个装置置于冷室中进行操作。</li>
	<li>加入 2 ml 含血清 HMI-9 以预处理分选柱。预处理完成后，在分选柱下方放置一个 15 ml 离心管，用于收集每个样品的流穿液。</li>
	<li>完成步骤 2.4 的 10 分钟孵育后，加入 800–1,000 µl 冷的含血清 HMI-9。在 4 °C 条件下以 5,200 × g 离心 4 分钟，去除上清液以清除未结合的抗体。用 1 ml 含血清 HMI-9 洗涤一次，并重复离心步骤，最后保留 100 µl 上清液。</li>
	<li>用力轻弹离心管，肉眼观察以确认沉淀已完全重悬。加入 1 ml 含血清 HMI-9，反复吹打以确保细胞充分重悬。</li>
</ol>
3. 磁分离
<ol>
	<li>确保按上述方法对柱子进行预处理。将细胞上样至柱中，收集流出液中的表达非优势VSG的细胞。通常情况下，1 ml培养基加锥虫需6-7分钟流过柱子。</li>
	<li>用1 ml含血清的HMI-9洗涤2次，将流出液收集至与步骤3.1相同的离心管中。</li>
	<li>将流穿液（3 ml）分装至两个1.5 ml微量离心管中。 
	注意：这些样品可后续合并，或取其中一半用于RNA提取， 等等。</li>
	<li>将柱子从磁铁上取下。向柱子中加入3 ml含血清的HMI-9培养基，将柱子插入15 ml离心管中，以收集表达起始型优势VSG的细胞。取300 µl洗脱液用于后续分析。将这些细胞置于冰上保存。</li>
	<li>作为阳性和阴性对照，从在37 °C培养且不频繁发生转换的对照细胞起始培养物中，取约100万个细胞，用移液器转移至1.5 ml微量离心管中。 
	注意：阳性对照细胞将在步骤4.1中用荧光标记抗体染色。阴性对照细胞在整个后续实验流程中均不进行染色。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 5,200 x g 离心 4 分钟，收集流穿样品和阳性抗体对照样品，并弃去上清液。 
	注意：可将另取的300 µl洗脱细胞作为抗VSG染色的阳性对照。</li>
</ol>
4. 染色以鉴定污染物和细胞系错用
<ol>
	<li>将流穿样品和阳性对照细胞重悬于 100 µl 含血清的 HMI-9 培养基中，并加入适当稀释倍数的荧光标记抗 VSG 一抗。 
	注意：荧光标记的抗 VSG 抗体为实验室自制，使用稀释比例为 1:1,000。用于流式细胞术检测的荧光标记抗 VSG 抗体可与 MACS 分离步骤中使用的未标记抗体来源相同。在完成步骤 3.5 后，应有 3 ml 流穿样品分装于两个微量离心管中。</li>
	<li>为通过流式细胞术分析全部流穿样品，将两个微量离心管中的细胞沉淀合并，并在含血清的 HMI-9 培养基 100 µl 中重悬，同时加入抗 VSG 抗体。充分混匀。</li>
	<li>在 4 °C 冷室中涡旋振荡细胞 10 分钟。加入 800 - 1,000 µl 冷的含血清 HMI-9 培养基。在 4 °C 下以 5,200 × g 离心 4 分钟，弃去上清以去除未结合的抗体。</li>
	<li>用 1 ml 含血清的 HMI-9 培养基洗涤细胞。在 4 °C 下以 5,200 × g 离心 4 分钟，弃去上清。在此最后一次离心过程中，同时离心步骤 3.4 中获得的洗脱样品和阴性对照样品。</li>
	<li>将所有流穿样品和洗脱样品重悬于以下混合液中：148.5 µl 含血清的 HMI-9 培养基、25 µl 绝对计数微球和 1.5 µl 碘化丙啶（Propidium Iodide）染色液（总体积为 175 µl）。将阳性和阴性抗体对照样品重悬于 175 µl 含血清的 HMI-9 培养基中。务必记录所用批次绝对计数微球每 25 µl 中的微球数量。</li>
	<li>将所有样品上机进行流式细胞术检测并收集数据。死细胞染色呈 PI+，污染物染色呈 PI-VSG+，发生转换的细胞（switchers）染色呈 PI-VSG-8。</li>
	<li>利用流式细胞术数据计算转换频率。 
	注意：有关计算转换频率的具体方法，请参阅补充文件 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Flow Cytometry Calculations.docx</a> 和 表 1。</li>
</ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

就实验技术而言，该方案中最关键的步骤是始终保持所有样品处于低温状态。布氏锥虫会迅速内化与其表面结合的抗体9，但这一过程依赖于细胞运动性，只要细胞维持在4 °C条件下，就不会影响检测结果。所有样品必须始终置于冰上，移液操作应迅速完成，以尽量减少暴露于25 °C实验室环境的时间。实验开始时即应准备好含血清的冷HMI-9培养基，并在整个实验过程中保持冰上放置。由于将1 ml样品通过层析柱需要5–7分钟，因此使用层析柱分离锥虫的操作必须在冷室中进行。如果样品数量超过可用的磁性分离装置数量，只要未被主动分离的样品始终保持在冰上，磁性分离可依次进行。
在与磁珠孵育后的最后一次洗涤步骤完成后、以及在磁铁上进行分离之前，必须将样品充分混匀。可通过用力弹击离心管或轻微涡旋来实现充分混悬。在将样品加入分离柱之前，不应观察到任何细胞沉淀或细胞团块，可通过显微镜观察来检查。如果存在细胞团块，则表达优势VSG的细胞流穿样品中的污染水平通常会显著高于理想水平。在计算实验结束时样品中发生转换的细胞数量时，必须明确用于流式细胞分析的是全部流穿液还是仅一半体积。如果仅使用了一半体积，则计算所得...

原生动物寄生虫， 布氏锥虫，是通过影响人类的疾病的致病因子（ 布氏冈比亚锥虫和布氏锥虫 罗得西亚锥虫）以及动物（通过 布氏布鲁氏锥虫在整个撒哈拉以南非洲地区传播。它通过采采蝇媒介的唾液传播给哺乳动物宿主。人类非洲锥虫病和动物非洲锥虫病均在流行地区造成严重的经济负担，且目前可用于治疗这两种疾病的药物极少，相关新药研发也十分有限。了解免疫逃逸机制对于开发抗锥虫病药物至关重要。覆盖在寄生虫表面的密集变异表面糖蛋白（VSG） coat 的抗原变异，是该寄生虫实现免疫逃逸的主要机制之一 T. brucei 逃避哺乳动物的抗体反应。大约有 2,000 种该蛋白的变体 VSG 基因存在于锥虫基因组中，但任意时刻仅有一个基因从约15个表达位点中的一个被转录。表达的VSG可通过将VSG基因复制到活性表达位点，或通过激活先前沉默的表达位点进行转录而发生“转换”（详见综述于1).
尽管已有大量研究致力于理解抗原变异 T. brucei，影响转换频率的因素仍不清楚。迄今为止的研究受到以下事实的限制：尽管转换是随机发生的 体外 切换频率非常低，大约为10分之16 细胞2这使得测量某一特定因素是否增加或减少转换频率变得困难，因为转换事件本身首先难以检测。在2009年之前，从特定群体中分离出发生转换的细胞的方法耗时且劳动强度大。这些方法包括将锥虫通过针对优势VSG免疫的小鼠进行传代，然后在一天后收集细胞。3，或通过免疫荧光计数数百个细胞4,5另一种策略依赖于药物抗性筛选来分离转换子6由于培养的非洲锥虫 体外 通常由表达一种主要变异体的大量群体和表达其他变异体的少量转换子群体组成，本文将该主要变异体称为主导性起始VSG。需要强调的是，我们采用这一表述并不意味着该主要变异体在群体中具有比其他变异体更高的适应性。
本文介绍一种可在3至4小时内可靠测定特定群体中表达非优势VSG的锥虫数量的方法。该方法特别适用于确定某种遗传操作或药物处理是否增加了群体中发生VSG转换的细胞数量。本方法并非通过药物或免疫手段清除表达优势起始VSG的细胞，而是首先使用连接有抗优势VSG抗体的磁珠对这些细胞进行标记，随后通过磁柱分离将其去除。发生VSG转换的细胞则保留在流穿组分中，并再次用荧光标记的抗-VSG抗体染色，以识别可能的污染细胞。通过向每个样本中加入已知数量的绝对计数微球，根据微球与细胞的比例即可实现定量，从而计算出群体中发生VSG转换的细胞数量7。

<table><tbody><tr><td>未标记的抗VSG抗体</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG抗体为本实验室自制</td></tr><tr><td>荧光标记的抗VSG抗体</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG抗体为本实验室自制</td></tr><tr><td>HMI-9培养基</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9为本实验室自制</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright绝对计数微球</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD柱</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS磁铁</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS磁性分离器</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡适配器-60</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM10014</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Coulter</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪分析软件</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

利用磁激活细胞分选与流式细胞术检测trypanosoma brucei变异表面糖蛋白的转换

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei 是一种原生动物寄生虫，可在采采蝇媒介与哺乳动物宿主之间循环传播，引起人类非洲锥虫病和动物非洲锥虫病（分别称为昏睡病和那加纳病）。该寄生虫通过周期性地更换其表面密集覆盖的变异表面糖蛋白（VSG），从而逃避免疫系统的识别。检测 Trypanosoma brucei 中的抗原变异过程既繁琐又耗费人力。本文介绍一种用于量化特定群体中“转换”表达新VSG的寄生虫数量的方法。首先用针对起始VSG的抗体对寄生虫进行染色，再用连接磁性微珠的二抗进行标记。将寄生虫样品通过置于磁场中的层析柱，表达起始VSG的寄生虫被保留在柱上，而未被保留的流穿部分则包含表达新VSG的寄生虫以及少量仍表达起始VSG的污染细胞。将此流穿群体再次用荧光标记的抗起始VSG抗体染色以标记污染细胞，并加入碘化丙啶（PI）标记死细胞。向流穿群体中加入已知数量的、可通过流式细胞术检测的绝对计数微珠，通过微珠数量与所收集细胞数量的比例，可推算出整个样品中的细胞总数。利用流式细胞术统计不表达优势型起始VSG且PI染色阴性的活细胞数量，从而定量“转换”群体的比例，并结合流式细胞术数据计算出群体中转换子所占比例。

本文所述方法用于证明，VSG表达位点内的双链断裂会增加群体中发生转换的细胞数量8在此，我们展示了在表达位点被诱导产生双链断裂的锥虫群体的代表性结果。我们将这些锥虫与未被诱导产生双链断裂的锥虫进行了比较。 图1 显示了从磁性激活细胞分选柱流穿部分收集的未诱导和诱导细胞的代表性流式细胞术图谱。在此特定实验中，起始优势VSG为VSG2。左侧面板的 图1A 显示前向散射和侧向散射，可用于在绝对计数微球以及具有活细胞典型前向散射和侧向散射特征的细胞周围设定门控。注意，门控可设置为包含更多细胞，因为死细胞可通过碘化丙啶（PI）染色排除；但所有样本的门控必须保持一致。右侧面板的 图1A 仅显示左侧面板中“活细胞”门控范围内的细胞。PI 染色阳性（Q1 和 Q2）的细胞为死细胞。对优势VSG染色阳性且PI染色阴性（Q3）的细胞为污染细胞。对PI和优势VSG均染色阴性（Q4）的细胞为已发生转换的活细胞。可以观察到，在诱导双链断裂的细胞中，Q3区域的污染细胞比例较低。然...

非洲锥虫培养 体外 以较低速率发生抗原变异，导致群体由表达一种主导型变异表面糖蛋白（VSG）的寄生虫和少量“转换”变异体组成。本方案描述了一种快速检测和定量这些群体的方法。

利用磁激活细胞分选与流式细胞术检测Trypanosoma brucei变异表面糖蛋白的转换

布氏锥虫是一种原生动物寄生虫，可引起人类非洲锥虫病和动物非洲锥虫病（分别称为昏睡病和那加纳病）。

本方法的总体目标是从整个群体中分离出表达特定变异表面糖蛋白（VSG）的锥虫，并鉴定出从起始优势VSG转换为其他任何VSG的寄生虫。该方法有助于回答锥虫生物学中的关键问题，例如：哪些因素或事件会影响寄生虫群体中VSG的转换。该技术的主要优势在于，它比以往发表的方法更快，并且能够简便地对转换细胞与非转换细胞进行定量分析。当实验室最初开始研究抗原变异时，第一个问题是如何检测稀有的转换细胞。这类问题实际上在多年前的免疫学研究中已经得到解决，即通过磁激活细胞分选技术来富集不具有特定性状的细胞。将这种非选择性方法应用于抗原变异研究似乎是一个极具前景的思路。首先，将 List 427 株血液型锥虫培养至每毫升 0.5 至 100,000 个细胞的密度。取 50 × 10⁶ 个细胞分装至 15 毫升离心管中，随后离心。保留 1 × 10⁶ 个细胞并进行培养，用于后续的阳性和阴性抗体对照。吸出大部分上清液，管中残留约750微升。将细胞转移至1.5毫升离心管中。最后，在4摄氏度下以2800 × g离心4分钟。然后用移液器吸除全部上清液。将细胞重悬于150微升培养基中，并加入适当稀释倍数的初级抗变异表面糖蛋白抗体（anti-VSG）。接着，在4摄氏度下涡旋振荡细胞10分钟。用 800 至 1000 微升冷的培养基洗涤细胞。在 4 摄氏度下以 5200 × g 离心 4 分钟。吸去上清液后，用 1 毫升培养基重悬细胞并再次离心。弃去上清液，将沉淀重悬于 100 微升培养基中。加入 110 微升适用于一抗类型的磁性激活细胞分选微珠。用移液器反复吹打混匀，然后涡旋振荡。细胞涡旋的同时，设置磁性激活分离柱。在分离柱下方放置一个15毫升离心管，用于收集预冲洗培养基。加入2毫升培养基以预冲洗分离柱。接下来，将样品从涡旋振荡器中取出，加入 800 至 1000 微升的冷培养基。离心样品，然后去除上清液以去除未结合的抗体。用一毫升培养基洗涤细胞沉淀，再次离心。此时吸走上清液，但保留100微升在管中。用力振荡离心管，直至沉淀完全重悬。加入1毫升培养基，上下吹打以充分重悬细胞。取下用于收集预处理缓冲液的15毫米锥形管，更换为新的15毫升锥形管以收集含有转换型寄生虫的流穿液。将细胞悬液加入已预处理的层析柱中。在下方用15毫升离心管收集流穿液，通常每毫升培养基加上锥虫需要六到七分钟。接下来，用一毫升培养基将柱子洗涤两次，并将流出液收集到同一离心管中。将总体积约为三毫升的流出液分装至两个1.5毫升微量离心管中。然后将离心管置于冰上。向层析柱中加入 3 毫升培养基，将层析柱插入 15 毫升离心管中。此步骤可获得表达起始优势 VSG 的细胞。从中取出 300 微升洗脱液并置于冰上保存，其余部分可弃去。为建立阳性对照，从初始细胞培养物中取约100,000个细胞，用移液器转移至1.5毫升微量离心管中。同样操作制备阴性对照。对流穿样品及阳性对照样品进行离心处理。然后移除并弃去上清液。将阳性对照细胞重悬于100 µL培养基中，加入适当稀释度的荧光标记一抗抗VSG抗体。接着，将一份流穿组分的沉淀重悬于100 µL培养基中，加入适当稀释度的荧光标记一抗抗VSG抗体。用该悬液重悬第二个流穿管中的沉淀，从而得到一个混合管。通过反复吹打充分混匀。涡旋振荡细胞，然后加入 800 至 1000 微升的冷培养基。将样品在 4 摄氏度、5200 ×g 条件下离心 4 分钟，然后弃去上清液以去除未结合的抗体。用 1 毫升培养基洗涤细胞，随后再次离心细胞。阳性对照、阴性对照以及先前置于冰上保存的洗脱细胞。弃去上清液。随后，向样品中加入 148.5 微升培养基。接着，加入 25 微升绝对计数微球溶液，再加入 1.5 微升碘化丙啶染色液。用175微升培养基重悬阳性对照和阴性对照沉淀。现在可将样品上机进行流式细胞仪检测。这些流式细胞术图显示了诱导产生双链DNA断裂的锥虫群体与未诱导细胞群体的细胞分离结果。左侧图显示前向散射与侧向散射，可用于区分样本中添加的活细胞、死细胞及微球。随后可根据散射特性设定门控，以确定这些细胞群体。右侧图仅显示根据左侧图设定的散射门控被分类为活细胞的细胞群。本实验中占主导的起始VSG为VSG two。对碘化丙啶染色呈阳性的细胞为死细胞，这些细胞位于图中Q one和Q two区域。对显性VSG染色呈阳性而对PI染色呈阴性的细胞位于Q3区域，属于污染细胞。最后，Q4区域中的细胞为活细胞，对显性VSG染色呈阴性，被视为转换细胞。该图显示了有无诱导断裂情况下，锥虫群体中计算得到的观察转换频率。体外随机转换的水平相对较低。尽管诱导断裂会导致显著更多的细胞转换为非优势VSG。一旦掌握，该技术可在约三小时内完成。在进行该实验操作时，全程保持样品低温以及充分重悬沉淀物（尤其是在柱上分离前）至关重要。在完成该操作后，可采用其他方法（如RNA测序）进一步回答更多问题，例如在发生转换的群体中哪些VSG正在表达。该方法通常用于检测VSG转换，也可用于分离和定量表达任何目标表面蛋白的寄生虫。

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

检测<em&gt;布氏锥虫</em&gt;变体表面糖蛋白通过磁性细胞分选和流式细胞仪开关

磁调制生物传感系统可用于快速、灵敏且简便地检测生物样本，例如DNA分子和蛋白质。...

基于磁调制生物传感系统的生物检测快速均相检测方法

本文介绍了一种从感染约氏疟原虫ANKA株（Plasmodium berghei...

从感染Plasmodium berghei ANKA小鼠中分离和分析脑滞留白细胞

疟原虫侵入并在红细胞内复制。因此，准确评估裂殖子侵袭和寄生血症水平对于判断疟疾感染进程至关重要。本文介绍了一种基于流式细胞术的小鼠疟疾模型中这些参数的检测方案。...

体内评估啮齿类动物疟原虫寄生率及裂殖子侵袭的流式细胞术方法

本文描述了利用一种生物发光的非洲锥虫株系来追踪晚期感染，并展示了如何 体内...

利用生物发光成像检测非洲锥虫病晚期感染

为蛋白质添加标签是深入了解其功能的有力方法。本文中，我们描述了一种可同时对数百个Trypanosoma...

高通量基因标记在Trypanosoma brucei中的应用

利用与识别表面抗原的抗体偶联的15...

利用流式病毒术分析病毒颗粒与细胞外囊泡的抗原谱

这种从血液中分离锥虫的方法依赖于锥虫表面电荷的负电性低于哺乳动物血细胞。将感染的血液置于阴离子交换柱上进行处理。该方法是非洲锥虫病最适宜的诊断手段，可提供纯净的寄生虫，用于免疫学、生物学、生物化学、药物学和分子生物学研究。...

利用阴离子交换剂（二乙氨基乙基-纤维素柱）从血液中纯化细胞外锥虫（包括非洲锥虫）

细针穿刺抽吸是一种通过使用细针从病灶或器官中获取细胞的技术。抽吸所得的样本可涂片、染色后在显微镜下检查以用于诊断，或用于分子生物学、细胞计数或体外分析。该方法成本低、操作简便、速度快，且造成的创伤极小。...

通过细针穿刺检测血管外Trypanosoma寄生虫

本方案的总体目标是指导如何测定自然暴露于恶性疟原虫（Plasmodium...

测量自然获得性诱导吞噬作用的抗体 恶性疟原虫 基于流式细胞术的寄生虫检测方法

利用低代码人工智能平台，通过简单步骤实现了对全球医学血液寄生虫的自动筛查。采用混合深度学习模型中的目标检测与分类方法，提高了血涂片的前瞻性诊断能力。主动监测与训练有素的模型相结合，有助于识别锥虫传播的热点区域。...

利用混合深度学习模型实现锥虫寄生虫的高效自动识别

我们描述了一种研究非洲锥虫血液形态中糖酵体的pH值如何响应环境刺激的方法。该方法结合了一种对pH敏感的可遗传蛋白传感器和流式细胞术，可用于测量pH动态变化，既可进行时间过程检测，也可用于高通量筛选。...

测量活体中动态的糖体pH变化 布氏锥虫

学习使用磁性细胞分选和流式细胞仪检测布氏锥虫变体表面糖蛋白开关的方法。该技术可快速分离表达特定VSG的锥虫并鉴定稀有变异体，为研究抗原变异机制提供高效工具。

利用磁激活细胞分选与流式细胞术检测Trypanosoma brucei变异表面糖蛋白的转换

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