Name: 分析蛋白导入进强调，从植物中分离叶绿体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 了解从拟南芥中分离叶绿体并研究胁迫条件下蛋白质导入机制的方法。该技术为植物生物学和叶绿体功能研究提供了可靠工具，可应用于其他植物系统。

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本工作获得了生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC；项目编号 BB/K018442/1）向 PJ 提供的资助。

1. 拟南芥植株的培养与胁迫处理
<ol>
	<li>通过将 4.3 g MS 基本盐混合物、10 g 蔗糖、0.5 g 2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) 加入去离子水中定容至 1 L，再用氢氧化钾 (KOH) 调节 pH 至 5.7，配制 1 L 的 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基。加入 6 g 植物凝胶，于 120 °C 下高压灭菌 20 分钟。
	<ol>
		<li>在培养基凝固前，将其倒入圆形培养皿中（直径 9 cm，高 1.5 cm，每皿加入 20 - 25 mL MS 培养基）。将培养皿置于超净工作台中干燥约 1 小时，然后盖上皿盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 Arabidopsis thaliana 种子放入 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL 含 0.02% (v/v) Triton X-100 的 70% (v/v) 乙醇进行表面灭菌，并持续振荡 5-10 分钟。对每种基因型/条件，准备 10 个培养皿，每个培养皿接种约 100 - 150 株幼苗。</li>
	<li>静置约 10 秒&#160;，待种子沉降至管底后，用移液器吸弃上清液。加入 1 mL 100% 乙醇，再次振荡 10 分钟。</li>
	<li>在种子灭菌过程中准备超净工作台。每个样品取一张滤纸，对折以便播种，并在超净台内用 100% 乙醇浸润。待其完全干燥。注意使用 100% 乙醇是因为其比 70% 乙醇蒸发更快。</li>
	<li>使用剪去尖端约 5 mm 的 1 mL 移液器吸头，将种子转移至滤纸上。使其干燥约 10 - 15 分钟。</li>
	<li>将约 100 - 150 粒灭菌后的种子均匀播种于每个 MS 培养基培养皿中，并用医用胶带密封各培养皿。</li>
	<li>将培养皿倒置于 4 °C 下保存 2 - 4 天&#160;，以促进并同步萌发。陈年种子可能需要在 4 °C 下放置更长时间（最长可达一周）。</li>
	<li>将培养皿转移至植物组织培养室，并正置放置。在长日照条件下（16 小时&#160;100 µmol·m−2·s−1 光照，8 小时&#160;黑暗），于 20 °C 下培养 8 天&#160;。</li>
	<li>进行胁迫处理时，当植株生长至 8 天&#160;龄时，在超净工作台中戴上经乙醇灭菌的手套，轻轻刮下琼脂培养基上的植株，转移至含有胁迫剂（例如，200 mM 甘露醇）的无菌液体 MS 培养基锥形瓶中。避免带入琼脂培养基。用无菌铝箔封住瓶口，在与步骤 1.8 相同的条件下，于摇床上轻轻振荡（约 100 rpm）继续培养 2 天&#160;。</li>
</ol>
2. 通过体外翻译制备前体蛋白 体外&#160;转录/翻译
注意：本实验方案以拟南芥光系统 I 亚基 D 前体蛋白（pPsaD）作为模板/前体蛋白，但该方法也适用于其他蛋白。
<ol>
	<li>将 pPsaD 的编码序列（CDS）克隆至 pBlueScript II SK 载体的多克隆位点（MCS）中（或任何其他具有上游 T7 启动子的类似载体）13。使用 DNA 提取试剂盒纯化质粒（pBSK-pPsaD），并通过 DNA 测序验证其序列。 
	注意：所有这些步骤均采用标准的分子克隆技术。</li>
	<li>使用设定为 260 nm 吸光度检测的分光光度计测定 pBSK-pPsaD 质粒 DNA 的浓度。将质粒稀释至终浓度为 10 ng/µL。</li>
	<li>以稀释后的质粒为模板进行 20 µL 的 PCR 扩增（共 35 个循环）。反应体系配置如下：2 µL 10× 聚合酶缓冲液，2 µL 2 mM dNTPs，1 µL 5 mM M13 正向引物（5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'），1 µL 5 mM M13 反向引物（5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'），1 µL 稀释后的 pBSK-pPsaD 质粒，1 U Taq 聚合酶，加蒸馏水至总体积为 20 µL。采用标准 PCR 程序：95 °C 预变性 5 min；35 个循环 [95 °C 变性 30 sec；56 °C 退火 30 sec；72 °C 延伸 30 sec]；最后 72 °C 延伸 5 min。</li>
	<li>取 5 µL PCR 产物在含 TAE 缓冲液（Tris-HCl，pH 7.6，20 mM 乙酸，1 mM EDTA）的 1%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳，以验证 cDNA 的正确扩增，并通过标准分子量标记物相对定量目标条带以确认其浓度。其余产物储存于 −20 °C 以备后续使用。</li>
	<li>使用基于兔网织红细胞裂解物的、适用于 PCR DNA 的无细胞转录/翻译系统，配制 50 µL 反应体系，具体如下：40 µL 转录/翻译系统提供的网织红细胞裂解物，2.5 µL 放射性标记的[35S]甲硫氨酸（11 µCi/mL，比活度：&#62;1,000 Ci/mmol），2.5 µL 无菌蒸馏水，以及 5 µL pPsaD PCR 产物（100 - 800 ng）。 
	注意：操作放射性物质时需佩戴手套、实验服和护目镜。监测并去污工作台面及设备。所有放射性废弃物须置于经批准的专用废液容器中处理。</li>
	<li>将反应体系置于 30 °C 水浴中孵育 90 分钟。将样品置于冰上以终止反应。</li>
	<li>取出 1 µL 反应产物作为检测样本（该体积也可作为步骤 5.7 的输入对照），通过标准十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结合自显影、荧光显影&#160;或磷屏成像进行验证。理想结果应显示一条与 pPsaD 分子量（约 23 kD）相符的清晰且强亮条带。其余反应产物储存于 −80 °C 以备后续使用。</li>
</ol>
3. 叶绿体分离
<ol>
	<li>配制以下贮存液：
	<ol>
		<li>制备叶绿体分离缓冲液（CIB，2×）：0.6 M 山梨醇，10 mM 氯化镁（MgCl₂）2)，10 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA），10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），20 mM 碳酸氢钠（NaHCO₃）3），40 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）；用KOH调节pH至8.0。配制2 L的2倍浓缩CIB溶液，分装后于-20℃保存 &#176;C用于长期保存，或在4℃短期保存 &#176;C 用于短期保存。配制 1× CIB 时，将 2× CIB 与蒸馏水按 1:1 体积比稀释；可在叶绿体分离实验当天新鲜配制。</li>
		<li>配制 HEPES-MgSO₄4-山梨醇缓冲液（HMS，1×）：50 mM HEPES，3 mM 硫酸镁（MgSO₄），330 mM 山梨醇，pH 8.0（使用 KOH 调节）4)，0.3 M 山梨醇；用氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 8.0。配制 400 mL 缓冲液，分装后于 -20 ℃ 保存 &#176;C用于长期保存，或在4℃短期保存 &#176;短期储存用 C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有以下操作均需在冷室中或冰上进行。开始前将所有溶液、装置、设备和转子预冷。</li>
	<li>在50 mL离心管中加入13 mL Percoll、13 mL 2x CIB缓冲液和5 mg谷胱甘肽，混匀后于43,000 × g离心，制备连续密度梯度。 &#215; g，4 ℃，30 分钟（关闭刹车） &#176;C. 离心后，需小心操作离心管，避免扰动密度梯度，并将其置于冰上以备后续使用。</li>
	<li>按基因型/条件，将 100 mL 的 1x CIB 转移至 1 L 烧杯中。
	<ol>
		<li>将幼苗从液体培养基中倾倒至筛子中，转移至另一个含有 CIB 的烧杯内；用 CIB 冲洗组织以去除残留的液体培养基，随后更换为 100 mL 新鲜的 CIB。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>匀浆时，每个样品分五次连续匀浆，每次使用盛于50 mL烧杯中的20 mL新鲜1x CIB，每份样品共使用100 mL 1x CIB。
	<ol>
		<li>第一轮匀浆时，用手将植物组织转移至50 mL烧杯中，使之前浸泡的缓冲液从指间沥出。尽量在第一轮使用大部分组织，但需确保组织完全浸没于缓冲液中；若无法实现，可将剩余未使用的组织在第二轮加入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织匀浆器的探头插入组织中，用1-2秒的脉冲进行两次匀浆处理&#160;每个样品均用两层滤布过滤匀浆液，通过轻轻挤压将其滤入250 mL离心管中。保留滤液，并将残留组织转移回50 mL烧杯中。</li>
	<li>将第二个20 mL CIB等分试样加入50 mL烧杯中，加入第一轮匀浆未使用的任何剩余组织，重复匀浆和过滤步骤。因此，重复步骤3.5和3.6，直至用完全部100 mL CIB即，取5份，每份20 mL），合并所得滤液。</li>
	<li>将混合的匀浆在1,000 × g离心 &#215; 4 ℃下以 g 离心 5 分钟（开启刹车） &#176;C，离心结束后立即倒掉上清液，注意不要扰动沉淀。将沉淀在试管中残留的少量上清液中轻轻振荡冰上操作，使沉淀重悬。切勿通过移液或涡旋剧烈重悬。</li>
	<li>使用巴斯德移液管沿接收管管壁将匀浆轻轻加至预先制备的连续密度梯度顶部，避免扰动梯度。在水平转子离心机中以7,800 × g离心 &#215; 4℃下以 g 离心 10 分钟（关闭刹车） &#176;拟南芥 
	注意：离心后在梯度中可见两条绿色条带：下层条带含有完整叶绿体，上层条带含有破损叶绿体。</li>
	<li>用移液器弃去上层条带，然后用巴斯德移液管将下层条带转移至新的50 mL离心管中，每管保留体积不超过8 mL。</li>
	<li>加入约 25 mL 1x HMS 缓冲液至试管中，轻轻倒置试管两次，以洗涤氯oplast中的 Percoll。将试管再次放入水平转子中，于 1,000 × g 离心 &#215; 4 ℃下以 g 离心 5 分钟（开启刹车） &#176;拟南芥</li>
	<li>吸除上清液，轻轻晃动试管并在冰上操作，用试管中残留的 HMS 缓冲液小心重悬叶绿体沉淀。再加入额外的 100 - 300 &#181;必要时加入 HMS 液体（根据第 4 步中沉淀物的大小和计数结果），但尽量避免过度稀释样品。
	<ol>
		<li>将叶绿体置于冰上保存。每次使用叶绿体进行后续实验前，需轻轻振荡离心管以重悬叶绿体。转移叶绿体时务必使用剪口移液器吸头（孔径增大）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 叶绿体产量与完整性的分析
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中，将5 µL分离的叶绿体加入495 µL的1x HMS缓冲液中，然后通过轻轻翻转离心管混匀，得到1:100的稀释液。</li>
	<li>将盖玻片盖在血细胞计数板的计数室上方。用移液器缓慢将约40–60 µL稀释后的叶绿体悬浮液加入盖玻片与计数室之间的缝隙中。在相差显微镜下使用10X或20X&#160;物镜观察，完整的叶绿体呈圆形、明亮，并被一圈光晕包围。 
	注意：在显微镜下，计数区域为1 mm2，包含25个大方格，每个大方格中央又分为16个小方格。</li>
	<li>计数10个大方格中的叶绿体数量。每个大方格内的叶绿体数量应平均在10至30个之间。若数量过少或过多，应相应调整稀释倍数（见上文步骤4.1），并重复该操作。</li>
	<li>按下式计算每毫升叶绿体数量（浓度）：n（步骤4.3中计算的每个大方格平均叶绿体数）× 25（大方格总数）× 100（稀释倍数）× 104（换算系数，用于将数据表示为每1 mL的数值，因为25个方格上方的体积为0.1 mm3）。</li>
	<li>将上述浓度乘以步骤3.12中获得的叶绿体悬浮液体积，计算叶绿体的实际产量。通常可获得超过50 × 106个叶绿体。</li>
</ol>
5. 叶绿体蛋白导入
<ol>
	<li>配制以下贮存液：
	<ol>
		<li>配制 10x HMS 缓冲液：500 mM HEPES、30 mM MgSO₄4，以及 3.0 M 山梨醇；用 NaOH 调节 pH 至 8.0。配制 50 mL 该缓冲液，分装后于 −20 °C 保存 &#176;C用于长期保存，4℃用于短期保存 &#176;短期储存用 C。</li>
		<li>配制导入终止缓冲液：将50 mM EDTA溶解于1x HMS缓冲液中。配制50 mL该缓冲液，分装后于−20 °C保存 &#176;拟南芥</li>
		<li>配制 2× 蛋白上样缓冲液：60 mM Tris-HCl，pH 6.8，10% (v/v) 甘油，2% (w/v) SDS，0.005% (w/v) 溴酚蓝。配制 50 mL，4 ℃ 保存 &#176;C. 使用前立即加入 100 &#181;1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）溶液 900 L &#181;缓冲液 L</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行包含3个时间点的时间进程实验时，准备3个试管，每个试管中含有130 &#181;加入等体积的蛋白导入终止缓冲液，置于冰上。准备一个450 &#181;在2 mL离心管中进行L导入反应（每个基因型/条件）。所有组分在使用前立即解冻。
	<ol>
		<li>一次导入反应通常使用 10 &#215; 106 A中的叶绿体 &#181;L 体积；例如，如果叶绿体浓度为 2.5 &#215; 108 /mL，使用 40 &#181;L 氯oplast 悬液。每个时间点需要 3 &#215; A &#181;L即, 120 &#181;L 在我们的示例中）。</li>
		<li>在冰上按以下顺序混合反应组分：蒸馏水（用于补足总体积至600） &#181;L），B &#181;L 10x HMS缓冲液（其中B = [600-3&#215;A]/10 即， 48 在我们的示例中），12 &#181;L-1-M-葡萄糖酸（钾盐），6 &#181;1 M NaHCO₃3, 6 &#181;L 20% (w/v) BSA，30 &#181;L 100 mM 腺苷 5&#8242;三磷酸镁盐（MgATP），24 &#181;L 250 mM 甲硫氨酸（非放射性标记），以及 30 &#181;L 前体蛋白。在开始导入反应前立即加入 3 &#215; A &#181;轻轻敲击试管，使氯oplast混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 25 ℃ 下孵育反应管 &#176;在100℃水浴中 &#181;摩尔&#183;m−2&#183;s−1 光照。偶尔轻弹试管以重悬叶绿体。</li>
	<li>为进行时间进程实验，吸取130 μL样品。 &#181;在蛋白导入的线性范围内，在所需的时间点吸取反应液等分试样，对于 pPsaD 而言，线性范围最长可达约 12 分钟（本例中选择 4、8 和 12 分钟的时间点较为合适）。不同蛋白质的线性范围可能有所不同。 14因此，建议在实验前对每种前体蛋白 individually 进行测试，以优化时间点。</li>
	<li>每次取出后立即转移130 &#181;将等分试样加入预冷的冰上导入终止缓冲液管中，轻轻敲击试管混匀，并将所有试管在冰上保留，直至完成时间进程实验。</li>
	<li>将所有样品离心30秒&#160;在 12,000 &#215; g 在微型离心机中离心，用移液器弃去上清液，并将沉淀重悬于 15 &#181;L 2×蛋白质上样缓冲液，涡旋混匀。</li>
	<li>通过标准 SDS-PAGE 电泳及放射自显影、荧光自显影分析所有样品以及 pPsaD 输入对照（包含相当于步骤 2.7 中每个导入反应所加量的 10% 的 pPsaD）&#160;或磷屏成像 15使用图像分析软件对结果进行量化和分析。为评估导入效率，可通过测量每条成熟条带相关的放射活性来确定不同基因型/条件下的蛋白质导入量。</li>
</ol>

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<li>Nada, A., Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+envelope+protein+32+is+imported+into+chloroplasts+by+a+novel+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway.</a> J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们最近发现，叶绿体蛋白质的导入可受到胁迫的主动调控，这对叶绿体功能和植物存活至关重要3。在该研究中，为了监测这种调控作用，我们改进了叶绿体分离和体外导入实验流程，以便评估在胁迫条件下生长的植物的蛋白质导入能力。结果表明，SP1在叶绿体蛋白质导入调控中具有重要作用。
传统的体外（in vitro）蛋白转运实验通常使用在标准MS琼脂培养基上生长的植物6,17,18。然而，对于本文所述的sp1突变体而言，此类传统实验并未显示出其蛋白转运能力与野生型（WT）之间存在任何差异3。但是，当采用本文所述方法在胁迫条件下评估蛋白转运时，SP1在调控蛋白转运中的作用则变得明显（图1）。尽管由于实验方法分别采用液体培养和琼脂培养的植株，可能无法将胁迫条件下的蛋白转运数据与传统实验结果进行直接比较，但只要所有植株均在同一液体培养基中培养（无论是否添加胁迫因子），则胁迫与非胁迫条件之间的比较仍是可行的。
与在琼脂培养基上的胁迫处理相比，液体培养更便于处理大量实验所需植株 体外 导入实验。此外，该方法能够对所有植株均匀施加胁迫，这对于短期胁迫处理尤为重要。本文所述方法已应用于通过甘露醇处理研究渗透胁迫，但也可轻松适用于多种其他胁迫类型；例如，短期盐胁迫和氧化胁迫，相应的胁迫剂可通过液体MS培养基以类似方式施加。对于其他类型的胁迫，我们建议首先优化胁迫程度；过于剧烈的处理可能对分离细胞器的产量和/或导入能力产生不利影响。
在本方案中有若干关键步骤需要特别注意，具体如下。
MS 培养基中琼脂的最佳浓度可能因生产商而异（0.6 - 0.9%，w/v），因此建议在开始实验前通过实验优化琼脂浓度。培养基的硬度不应过低，以免在收获步骤（步骤 1.9）时粘附于组织；也不应过高，以免抑制植物根系发育。蔗糖浓度也可根据所用植物种类进行调整。在处理特别衰弱的突变体时，添加 2 - 3%（w/v）蔗糖的 MS 培养基可能有助于植物更好地生长。进行胁迫处理时，不宜将过老的植株转移至液体培养基中（例如，&#62;14 天龄）。原因是较老植株发育更充分的根系在转移过程中更容易受损。
关于转录/翻译系统，主要有两种类型：基于小麦胚芽的系统和基于兔网织红细胞的系统。这些试剂盒可使用不同的模板，例如线性化质粒、非线性化质粒或PCR产物。试剂盒还针对T3、T7和SP6启动子具有特异性。需要注意的是，此处推荐的试剂盒仅适用于PCR产物和T7启动子。然而，由于未知原因，使用该系统制备的一些放射性标记前体蛋白可能在导入实验中效果不佳；在此类情况下，可考虑尝试使用适用于质粒模板的小麦胚芽提取物系统或网织红细胞裂解物系统。此外，也可根据制造商说明书优化反应条件，以提高转录/翻译反应的结果。
为了防止叶绿体因光合作用积累淀粉而影响完整细胞器的分离，应在清晨（或在生长室光照周期的早期）开始叶绿体的分离。叶绿体分离过程必须迅速进行，不得有任何不必要的延迟，且分离得到的叶绿体必须始终保持低温。这是因为分离后的叶绿体活力会逐渐下降，不利于后续实验。若使用新解冻的CIB或HMS缓冲液，使用前务必充分混匀，以获得均一的溶液。植物材料匀浆的最佳条件是通过经验确定的，若使用不同的组织匀浆器，条件可能需要调整。
如果不同植物基因型含有相似的叶绿素水平，则可在进行蛋白导入实验前，采用叶绿素定量作为样品归一化的替代方法。叶绿素含量可通过分光光度法测定，测定前需用80%（v/v）丙酮水溶液提取部分分离得到的叶绿体样品。 19,20然而，如果具有不同叶绿素含量的植物的吸收速率（例如，若需比较具有黄化表型的突变体，应在导入实验中通过叶绿体计数对叶绿体样品进行归一化处理。在步骤3.11中充分重悬叶绿体尤为关键。重悬不充分可能导致叶绿体聚集成团，从而难以准确计数，进而影响导入反应中的正确加样。若在显微镜下观察到严重的聚集现象（例如，具有聚集体的 &#62;10个叶绿体连接在一起），继续在冰上振荡叶绿体样品，直至聚集体完全消失。用较小体积的缓冲液重悬叶绿体会更加容易。
需要注意的是，由于蛋白质导入反应（第5节）具有放射性，因此必须采取适当的防护措施。必要的预防措施包括：佩戴一次性手套、实验服和护目镜，监测并清除工作台面和设备的污染，以及将所有放射性废物丢弃至经批准的废物容器中。同时需注意，在导入反应过程中，正确的渗透压对于维持叶绿体的完整性至关重要，而这一点主要由HMS缓冲液来保证。由于10x HMS溶液黏稠，应先将其升温至室温，充分混匀，并使用剪口移液枪头进行移液，以确保体积准确。在导入反应中，加入非放射性甲硫氨酸可抑制游离的放射性标记甲硫氨酸在孵育过程中通过细胞器翻译掺入非目标叶绿体蛋白；而牛血清白蛋白（BSA）则作为蛋白酶的底物，用于减少蛋白质降解。

叶绿体是存在于植物绿色组织中的高度丰富的细胞器。它们因在光合作用中的关键作用而广为人知，光合作用利用光能将二氧化碳转化为糖，从而支持地球上几乎所有生命1。此外，叶绿体（以及更广泛的、相关的细胞器家族——质体）在植物中还发挥着许多其他重要功能，包括氨基酸、脂质、色素的生物合成，以及对重力和病原体侵袭等环境信号的感知。光合作用会产生活性氧（ROS）作为副产物，这些物质在某些情况下具有有益作用，但若过量产生则可能导致损害甚至致命效应。ROS的过量生成尤其由不利环境条件所促进，因此叶绿体与植物对盐胁迫和渗透胁迫等非生物胁迫的响应密切相关2。
叶绿体具有复杂的结构。每个叶绿体都被一种称为被膜的双层膜结构所包围，该被膜由外膜和内膜组成。在内部，还存在另一个称为类囊体的膜系统，光合作用的光反应即在此进行。两个膜系统之间是一个充满液体的区域，称为基质，参与碳固定过程。一个叶绿体可能含有多达约3,000种不同的蛋白质，其中绝大多数蛋白质在细胞质中以前体形式合成，需要通过被膜上的特异性蛋白质转运复合物（translocon）导入细胞器内1。有趣的是，近期研究表明，叶绿体蛋白质的导入受到主动调控，因而能够对叶绿体蛋白质组实现重要水平的控制。例如，2015年有研究报道，蛋白质导入可通过泛素-蛋白酶体系统直接调控叶绿体外被膜转运复合物（TOC）的丰度，从而响应非生物胁迫3。
使用纯化的叶绿体和 体外 合成的前体蛋白，蛋白质的导入可被重建 体外 4,5因此， 体外 可采用多种方法评估不同突变体植物的导入速率 6，这一方法对于分析蛋白质导入机器的潜在组分以及揭示蛋白质导入及其调控机制至关重要。此外，叶绿体可在后续进行进一步的分级分离或蛋白酶消化处理， 体外 导入，有助于研究叶绿体蛋白的亚细胞器定位与拓扑结构 7,8.
为了研究应激对蛋白质导入的调控作用，我们对常规的叶绿体分离方法进行了改进，具体如下所述。重要的是，叶绿体来源于在标准的Murashige和Skoog（MS）琼脂培养基上生长8天后，转入添加了应激因子的液体MS培养基中的植物，从而实现了相对短暂且可控的应激处理。从经历此类应激处理的植物中分离得到的叶绿体，其产量和功能均适用于后续的体外蛋白质导入实验3。除了叶绿体分离方案外，我们还介绍了常规的体外蛋白质导入方法，该方法已被证实具有良好的稳定性，并被广泛使用3,9-12。

<table><tbody><tr><td>MS基本盐（Murashige和Skoog）&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>植物琼脂（phytoagar）</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通X-100（triton X-100）</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>外科胶带（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Micropore，3M）</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>过滤布（Miracloth）</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 离心瓶</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron均质器（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Kinematica PT10-35）</td><td>Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron探头（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Kinematica PTA20S）</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>离心机（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Beckman Coulter Avanti JXN-26，适用于50和250 mL管）</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>适用于250&amp;nbsp;mL瓶的固定角转子（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，JLA-16.250）</td><td>Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>适用于50&amp;nbsp;mL管的固定角转子（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，JA-25.50）</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>适用于50 mL管的摆动桶转子（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，JS-13.1）</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>放射性标记的[&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S]甲硫氨酸</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>基于兔网织红细胞裂解物的无细胞翻译系统（TNT T7 Quick试剂盒，用于PCR DNA）</td><td>Promega</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>相差显微镜（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Nikon Eclipse 80i）</td><td>Nikon</td><td>不可用</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（改进型Neubauer BS748计数室）</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>0.1 mm深度，1/400 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm &amp;times; 22 mm，厚度0.13–0.17 mm</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Eppendorf 5415D）</td><td>Eppendorf</td><td>不可用</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000分光光度计或类似设备</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>葡糖酸（钾盐）</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>甲硫氨酸</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Fisher</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Aida Image Analyzer）</td><td>Raytest</td><td>不可用</td><td></td></tr></tbody></table>

分析蛋白质向胁迫条件下植物分离叶绿体的导入

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

叶绿体是植物中具有多种重要功能的细胞器，不仅参与光合作用，还涉及多种代谢和信号传导功能。此外，叶绿体在植物响应各种非生物胁迫（如盐胁迫和渗透胁迫）过程中发挥关键作用。一个叶绿体可能含有多达约3,000种不同的蛋白质，其中部分蛋白质由叶绿体自身基因组编码。然而，大多数叶绿体蛋白质由细胞核基因组编码，在细胞质中合成，随后需要通过叶绿体被膜上的转运复合体（translocons）导入叶绿体内部。近期研究表明，叶绿体蛋白质的导入过程可受到胁迫条件的主动调控。为了在生物化学层面上研究胁迫条件下蛋白质导入的调控机制，本文介绍了一种快速且简便的实验方法，该方法可在任何实验室中轻松实施。该方法中，植物在正常条件下生长，随后转移至液体培养基中接受胁迫处理。收集植物材料后，通过匀浆释放叶绿体。利用密度梯度离心法分离粗匀浆，从而获得完整的叶绿体。通过计数评估叶绿体产量，并在显微镜下检查叶绿体的完整性。在蛋白质导入实验中，将纯化的叶绿体与 35S放射性标记 体外 翻译后的前体蛋白，并在不同时间点进行取样，以比较在胁迫条件下不同基因型之间的蛋白质导入速率。我们展示了利用该方法获得的数据，结果表明，在渗透胁迫条件下，调控突变体中蛋白质向叶绿体的导入速率发生特异性改变。

一个包含3个时间点的叶绿体蛋白导入实验示例如下所示 图1PsaD 是一种位于类囊体基质侧的光系统 I 组分，分子量约为 18 kD，其前体形式分子量约为 23 kD16PsaD 在此被选为 体外 蛋白导入实验，因为其稳态水平在该条件下升高 sp1 与野生型相比，该突变体在胁迫条件下表现出其导入效率的变化 3。该 sp1 突变体在叶绿体蛋白导入机制的一个重要调控因子——SP1蛋白中存在缺陷 3在正常生长条件下分离的叶绿体中，PsaD 的导入没有明显差异 sp1 以及WT（数据未显示）3然而，采用本文所述方法检测来自渗透胁迫植物的叶绿体中PsaD的导入情况时，发现明显差异。尽管我们在两种基因型中均观察到成熟蛋白形式随时间依赖性积累，但野生型（WT）叶绿体的导入速率显著低于 sp1 叶绿体（图1），这与我们之前的结果一致 3，揭示了SP1蛋白在胁迫条件下调控PsaD向叶绿体转运的重要作用。 
<img alt="蛋白质导入分析，Western 印迹条带，电泳结果，时间比较，WT 与 sp1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 利用在渗透胁迫条件下生长的植物中分离的叶绿体进行蛋白质导入实验。 从10天龄的野生型（Col-0）及一个突变体中分离叶绿体 sp1 在胁迫条件（200 mM 甘露醇）下生长2天的拟南芥突变体植株。A) 蛋白质导入使用[35S]-甲硫氨酸标记的pPsaD，并分别反应4、8和12分钟，随后通过SDS-PAGE和磷屏成像分析。平行实验中，pPsaD 10%输入对照包含 体外 体外翻译蛋白（IVT）被分析。图中显示了pPsaD的前体（pre）和成熟（mat）形式，两者之间有两个条带，可能对应于截短或蛋白水解的翻译产物，因为它们的强度在时间过程中未发生变化（*）。B) 比较野生型（WT）和突变型叶绿体的蛋白导入速率 sp1 在胁迫条件下生长的植物中，每条带的强度对应于导入的成熟蛋白 A 定量。所有数据均表示为野生型植株叶绿体中蛋白质导入量在12分钟时的百分比。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在胁迫条件下研究蛋白质导入分离叶绿体的新方法。该方法快速且简便，可用于研究不同胁迫条件对叶绿体蛋白质导入的影响及其相应的调控机制。

叶绿体是植物中具有多种重要功能的细胞器，不仅参与光合作用，还涉及多种其他代谢和信号传导功能。

本方法的总体目标是研究细胞核编码蛋白向叶绿体的转运过程，特别关注胁迫条件下的影响。该方法有助于解答叶绿体研究领域中的关键问题，例如叶绿体蛋白导入是如何被调控的。该技术的一个显著优势在于，能够评估胁迫对叶绿体蛋白导入的影响。尽管该方法最初是为模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）开发的，但也可经修改后适用于其他系统，例如农作物。本实验操作将由我实验室的博士后 Qihua Ling 演示。开始之前，请先按照随附文本方案中所述的方法培养拟南芥植株。然后在植物生长至第8天时进行胁迫处理。用手轻轻将植物从琼脂平板上刮下，并转移至含有胁迫因子的灭菌液体MS培养基锥形瓶中。根据实验的具体要求，可能还需将额外的植物放入不含胁迫因子的相似锥形瓶中作为对照。用灭菌铝箔封住烧瓶口，并将植物在摇床中轻轻振荡培养额外两天。通过先将13毫升Percoll、13毫升2×叶绿体分离缓冲液和5毫克谷胱甘肽混合于50毫升离心管中，制备连续密度梯度。然后离心该混合物。离心后，小心操作离心管以避免扰动梯度，并将其置于冰上以备后续使用。接下来，按每种实验条件将 100 毫升叶绿体分离缓冲液转移至 1 升烧杯中。通过将幼苗倾倒至筛子中，从液体培养基中取出幼苗。然后将它们转移至含有叶绿体分离缓冲液的烧杯中。用缓冲液冲洗组织以去除任何残留的培养基，随后更换为100毫升新鲜的分离缓冲液。进行第一轮匀浆时，手动将植物组织转移至一个50毫升的烧杯中，使之前的缓冲液从指间沥出。然后将组织匀浆器的探头插入组织中，以每次一到两秒、共两次脉冲进行匀浆。将匀浆液通过两层滤布过滤至250毫升离心管中。最后轻轻挤压滤布以收集剩余液体。保留滤液，并将植物组织转移回50毫升烧杯中。然后向50毫升烧杯中加入第二份20毫升的叶绿体分离缓冲液，并加入在第一轮匀浆中未使用的剩余组织。重复匀浆和过滤步骤再进行四次。在 4 °C 条件下，以 1,000 × g 离心合并的匀浆 5 分钟。离心后立即倾倒上清液，注意不要扰动沉淀。将离心管置于冰上，通过轻轻振荡离心管，用残留的上清液重悬沉淀。接下来，使用巴斯德移液管沿接收管管壁将匀浆液轻柔地转移至预先制备的连续密度梯度顶部。然后，在4°C条件下，将样品和梯度液放入水平转子中，以7,800 × g离心10分钟，离心时关闭刹车。离心结束后，观察梯度中可见的两条绿色条带。弃去上层含有破碎叶绿体的条带，用巴斯德吸管将下层含有完整叶绿体的条带转移至新的50毫升离心管中。随后，向管中加入25毫升HMS缓冲液，轻轻倒置管体两次，以洗涤叶绿体中的Percoll。然后将离心管重新放入水平转子中，再次离心沉淀叶绿体。倒掉上清液，通过在冰上轻轻振荡离心管，用残留的缓冲液重悬沉淀。如有必要，可额外加入 100 至 300 微升 HMS 缓冲液，但尽量不要过度稀释样品。将重悬的叶绿体置于冰上保存。首先，在1.5毫升离心管中，将5微升分离的叶绿体加入495微升HMS缓冲液中。轻轻颠倒混匀。然后将盖玻片置于血细胞计数板的计数室上方。将稀释后的叶绿体悬浮液缓慢吸取 40 至 60 微升，加入盖玻片与计数室之间的缝隙中。使用相差显微镜，以 20 倍物镜观察叶绿体。完整的叶绿体呈圆形且明亮，周围环绕着一圈光晕。然后使用10倍物镜统计10个大方格内的叶绿体数量。每个大方格内的叶绿体数量应平均在10到30之间。如果叶绿体数量过少或过多，需调整稀释倍数并重复操作步骤。当处于适当范围后，按照随附文本方案中所述方法计算每毫升的叶绿体数量。若需进行包含三个时间点的时间进程实验，准备三支试管，每管加入130 µL导入终止缓冲液，并置于冰上。在一支2 mL试管中，配制含有反应缓冲液和放射性标记前体蛋白的导入反应体系。注意，每种待测条件应设置一个反应。每个时间点使用约1000万个叶绿体。将反应管置于25摄氏度水浴中，在有限光照条件下孵育。偶尔轻弹管壁以重新悬浮叶绿体。为进行时间进程实验，在反应的线性范围内，在所需的时间点取出130微升等分试样。一旦取出，立即将每份130微升的样品转移至含有预冷的导入终止缓冲液的离心管中，并通过轻轻敲击管壁混匀，随后将各管置于冰上，直至完成整个时间进程实验。最后一个样品取出后，将所有样品在微量离心机中于12,000 × g 离心30秒。随后弃去上清液，并将沉淀物重悬于15 µL 2×蛋白上样缓冲液中。然后通过涡旋振荡混合样品。最后，使用标准的SDS-PAGE结合放射自显影、荧光放射自显影或磷屏成像技术，分析所有样品及前体输入对照。PsaD是光系统I的一个18千道尔顿组分，最初以前体形式合成，分子量为23千道尔顿。从前体加工为成熟的18千道尔顿形式表明已成功导入叶绿体。本研究中的拟南芥sp1突变体在叶绿体蛋白导入机制的重要调控因子——sp1蛋白中存在缺陷。在胁迫条件下，PsaD蛋白导入sp1突变体叶绿体的量较野生型增加，但在正常非胁迫条件下则无此现象。尽管PsaD的成熟蛋白形式在两种植物基因型的叶绿体中均随时间依赖性积累，但sp1突变体叶绿体的蛋白导入速率显著高于野生型叶绿体。这些结果表明，sp1 蛋白在胁迫条件下调控叶绿体蛋白质导入过程中具有重要作用。熟练掌握后，从叶绿体分离到完成导入实验的整个方法，若操作得当，可在五至六小时内完成。在进行该实验时，必须注意所有叶绿体分离步骤均需在 4 °C 下进行，以确保叶绿体保持最大活性。几十年前首次开发出体外叶绿体蛋白导入实验后，该方法为研究人员探索叶绿体蛋白导入机制的诸多方面奠定了基础。本文介绍的优化方法可用于研究胁迫条件对蛋白导入的影响。请注意，操作放射性物质需要特别小心。进行该操作时，应始终采取佩戴手套、实验服和护目镜等防护措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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分析蛋白质向胁迫条件下植物分离叶绿体的导入

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