分析蛋白质向胁迫条件下植物分离叶绿体的导入

本方法的总体目标是研究细胞核编码蛋白向叶绿体的转运过程，特别关注胁迫条件下的影响。该方法有助于解答叶绿体研究领域中的关键问题，例如叶绿体蛋白导入是如何被调控的。该技术的一个显著优势在于，能够评估胁迫对叶绿体蛋白导入的影响。

尽管该方法是为模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）开发的，但也可经修改后适用于其他系统，例如农作物。本实验操作将由我实验室的博士后 Qihua Ling 演示。首先，按照随附文字方案中所述的方法培养拟南芥植株。

然后在植物生长至第8天时进行胁迫处理。用手轻轻将植物从琼脂平板上刮下，并转移至含有胁迫因子的无菌液体MS培养基锥形瓶中。根据实验的具体设计，可能还需将额外的植物放入不含胁迫因子的相似锥形瓶中作为对照。

用灭菌的铝箔封住烧瓶口，将植物在轨道摇床上轻轻振荡培养额外两天。通过在50毫升离心管中先混合13毫升Percoll、13毫升2倍叶绿体分离缓冲液和5毫克谷胱甘肽，制备连续密度梯度。然后离心该混合物。

离心后，小心操作离心管以避免扰动梯度，并将其置于冰上以备后续使用。接下来，按每种条件将100毫升叶绿体分离缓冲液转移至一个1升烧杯中。通过将幼苗倾倒至筛子中，从液体培养基中取出幼苗。

然后将组织转移至含有叶绿体分离缓冲液的烧杯中。用缓冲液冲洗组织以去除任何残留的培养基，随后更换为100毫升新鲜的分离缓冲液。进行第一轮匀浆时，手动将植物组织转移至50毫升烧杯中，使之前的缓冲液从指缝间沥出。

然后将组织匀浆器的探头插入组织中，以每次1到2秒、共两次脉冲进行匀浆。将匀浆液通过两层滤布过滤至250毫升离心管中。最后轻轻挤压滤布以收集残留液体。

保留滤液，并将植物组织转移回50毫升烧杯中。然后向50毫升烧杯中加入第二份20毫升的叶绿体分离缓冲液，并加入在第一轮匀浆中未使用的任何剩余组织。重复匀浆和过滤步骤四次。

将混合匀浆在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。离心后立即倾倒上清液，注意不要扰动沉淀。将离心管置于冰上，通过轻轻振荡离心管，用残留的上清液重悬沉淀。

接下来，使用巴斯德移液管沿接收管管壁将匀浆液轻柔地转移至预先制备的连续密度梯度顶部。然后将样品和梯度液置于水平转子中，在4°C条件下以7,800 × g离心10分钟，离心时关闭刹车。离心结束后，观察梯度中可见的两条绿色条带。

弃去上层含有破碎叶绿体的条带，用巴斯德移液管将下层含有完整叶绿体的条带转移至一个新的50毫升离心管中。接着，向管中加入25毫升HMS缓冲液，轻轻倒置管子两次，以洗涤叶绿体中的Percoll。然后将离心管重新放入水平转子中，再次离心收集叶绿体。

倒掉上清液，通过在冰上轻轻振荡离心管，用残留的缓冲液重悬沉淀。如有必要，可额外加入 100 至 300 微升 HMS 缓冲液，但尽量不要过度稀释样品。将重悬的叶绿体置于冰上保存。

取5微升分离的叶绿体加入到1.5毫升离心管中含495微升HMS缓冲液的溶液里。轻轻颠倒混匀。然后将盖玻片置于血细胞计数板的计数室上方。

缓慢地将40至60微升稀释后的叶绿体悬浮液用移液器加入盖玻片与计数室之间的缝隙中。使用相差显微镜，以20倍物镜观察叶绿体。完整的叶绿体呈圆形且明亮，周围环绕着一圈光晕。

然后使用10倍物镜统计10个大方格中的叶绿体数量。每个大方格内的叶绿体数量应平均在10到30之间。如果叶绿体数量过少或过多，需调整稀释倍数并重复操作步骤。

当处于适当范围后，按照随附的文字实验方案计算每毫升中的叶绿体数量。若需进行包含三个时间点的时间进程实验，准备三支试管，每管加入130微升导入终止缓冲液，并置于冰上。在一支2毫升试管中，配制含有反应缓冲液和放射性标记前体蛋白的导入反应体系。

请注意，每种待测条件应设置一个反应。每个时间点使用约一千万个叶绿体。将反应管置于有限光照下，于25摄氏度水浴中孵育。

偶尔轻弹离心管以重新悬浮叶绿体。为进行时间进程实验，在反应的线性范围内，在所需的时间点取出130微升等分试样。一旦取出，立即将每份130微升的样品转移至含有预冷的导入终止缓冲液的离心管中，并通过轻轻敲击管壁混匀，随后将离心管置于冰上，直至完成整个时间进程实验。

最后一个样品取出后，将所有样品在微量离心机中于12,000 × g 离心30秒。随后弃去上清液，并将沉淀物重悬于15 µL的2×蛋白上样缓冲液中。然后通过涡旋振荡混合样品。

最后，使用标准的SDS-PAGE结合放射自显影、荧光显影或磷屏成像技术，分析所有样品以及前体输入对照。PsaD是光系统I的一个18千道尔顿组分，最初以23千道尔顿的较大前体形式合成。从前体加工为成熟的18千道尔顿形式表明蛋白质已成功导入叶绿体。

本研究中的拟南芥sp1突变体在叶绿体蛋白导入机制的重要调控因子——sp1蛋白中存在缺陷。在胁迫条件下，PsaD蛋白进入sp1突变体叶绿体的量较野生型增加，但在正常非胁迫条件下则无此现象。尽管PsaD的成熟蛋白形式在两种基因型植物的叶绿体中均随时间依赖性积累，但sp1突变体叶绿体的蛋白导入速率显著高于野生型叶绿体。

这些结果表明，sp1 蛋白在胁迫条件下调控叶绿体蛋白导入过程中具有重要作用。一旦掌握，从叶绿体分离到完成导入实验的整个方法，若操作得当，可在五至六小时内完成。在进行该实验时，重要的是要记住，所有叶绿体分离步骤均需在 4°C 下进行，以确保叶绿体保持最大活性。

几十年前首次开发以来，体外叶绿体蛋白导入实验为该领域的研究人员探索叶绿体蛋白导入机制的诸多方面奠定了基础。本文介绍的优化方法可用于研究胁迫条件对蛋白导入的影响。请注意，操作放射性物质需要特别小心。

进行此操作时，应始终采取佩戴手套、实验服和安全眼镜等预防措施。