Name: 粒子结合Bet v 1的变应原PM10的流式细胞分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学习使用流式细胞术定量分析负载Bet v 1过敏原的PM10颗粒物。该方法可快速可视化并量化环境颗粒物中的过敏原含量，为研究过敏原在呼吸道中的转运机制提供有效工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者谨此感谢德国环境署的 Katrin Bossmann、Anett Neumann 和 Eike Wolter 所做的宝贵前期工作。

注意：本方案描述了使用针对桦树花粉主要抗原成分 Bet v 1 的单克隆抗体（单克隆小鼠 IgG1 抗体，克隆号 MA-3B4）对 PM10 颗粒进行间接染色，随后使用藻红蛋白别藻蓝素（APC）标记的二抗（抗小鼠 IgG1 抗体，克隆号 A85-1）进行结合，并在流式细胞仪上进行后续分析。若具备其他合适的抗体，该方法可扩展用于检测结合在环境空气颗粒上的其他抗原。
1. PM10 采样
<ol>
	<li>使用低流量采样器，以 2.3 m3/hr 的流速，将环境空气中的 PM10 收集到聚四氟乙烯（PTFE）滤膜上（图 1）。该实验所用采样器的性能表征见文献16。运行时间取决于所需 PM10 的量（通常为 1 至 10 天）。</li>
	<li>孵育结束后，从采样器中取出滤膜，并在 -20 °C 下冷冻保存，直至使用。</li>
</ol>
<img alt="气象监测设备设置；温度传感器、数据采集、气候研究。" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 低流量 PM10 采样器。 一种低流量 PM10 采样器的示例。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. PM10 去除与颗粒计数
<ol>
	<li>让PTFE滤膜解冻约5分钟。然后，将滤膜放入干净的聚苯乙烯培养皿中（图 2A）。如果处理多个滤膜，每张滤膜需使用一个新的培养皿。</li>
	<li>随后，用磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖聚四氟乙烯（PTFE）滤膜。本方案设定的最终PM10浓度为8×106 每毫升颗粒数（见步骤 3.3）。为达到至少该浓度，请根据 PM10 收集时间采用以下经验体积的 PBS 覆盖滤膜： &lt;2天时使用2 ml；孵育时间≥2天时，使用4 ml。 
	注意：为提高PM10悬浮液的颗粒物浓度，可将不同滤膜上的悬浮液合并，前提是此操作适用。</li>
	<li>用镊子夹住PTFE滤膜，使用敏感型刷头的电动牙刷刷洗1分钟（图2B、图2C)。将颗粒物-PBS悬浮液（以下简称PM10悬浮液）转移至洁净的反应管中。</li>
</ol>
<img alt="使用刷子和网筛清洁培养皿的流程图，依次显示 A 到 C 阶段。" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用电动牙刷去除 PM10。 将采集了 PM10 的聚四氟乙烯滤膜置于聚苯乙烯培养皿中（A），加入 4 ml PBS。然后使用电动牙刷去除 PM10（B：刷洗前；C：刷洗 1 分钟后）。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>测量PM10颗粒物的浓度， 例如， 通过使用颗粒计数器。稀释适量体积的 PM10 悬浮液，例如 50 µl 在10 ml等渗测量缓冲液中，测量三次并计算每毫升的颗粒总数平均值。务必使用能够检测相应尺寸颗粒的颗粒计数器。</li>
</ol>
3. Bet v 1 染色
<ol>
	<li>计算分析样品所需的反应管数量：至少需要三个反应管：（i）仅含样品的反应管（天然对照）；（ii）含样品和二抗的反应管（阴性对照）；（iii）含样品、一抗和二抗的反应管（特异性样品）。若为首次检测，建议为（i）、（ii）和（iii）各准备至少两个反应管，以确保有足够的材料用于正确调整流式细胞仪参数（见步骤4.1）。</li>
	<li>根据所需反应管的数量，计算PM10悬液的用量。每个反应管需要50 µl悬液。</li>
	<li>根据步骤2.4测得的颗粒浓度，以及步骤3.2中计算的悬液体积，通过加入适量PBS将颗粒浓度调整至终浓度为每毫升8×106个颗粒。 
	注意：剩余的PM10悬液可于-20 °C冷冻保存以备后续实验使用，但本实验方案推荐使用新鲜制备的PM10悬液。</li>
	<li>通过向PM10悬液中添加牛血清白蛋白（BSA）至终浓度0.02%以封闭非特异性结合，可使用以PBS配制的1% BSA储备液。短暂涡旋混匀，并于室温孵育20分钟。</li>
	<li>对于每个需进行流式细胞术分析的样品，取50 µl步骤3.4所得悬液转移至洁净反应管中。向指定用于特异性染色的反应管中加入抗Bet v 1的单克隆小鼠抗体，终浓度为0.02 µg/µl，短暂涡旋混匀后于室温孵育60分钟。
	<ol>
		<li>将指定用于天然对照和阴性对照的含PM10-BSA悬液的反应管同样在室温下放置60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个反应管中加入500 µl含0.02% BSA的PBS进行洗涤，短暂涡旋混匀后，于室温以4,700 × g离心5分钟。使用真空泵小心弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤3.6一次。</li>
	<li>确定所需APC标记的抗小鼠IgG1二抗总量：每反应管需1 µg抗体溶于50 µl含0.02% BSA的PBS中。将适量抗体用相应体积的含0.02% BSA的PBS稀释。</li>
	<li>除指定用于天然对照的反应管外，向所有反应管中加入50 µl稀释后的二抗。向天然对照管中加入50 µl含0.02% BSA的PBS。将所有样品短暂涡旋数秒。</li>
	<li>将所有样品在避光条件下孵育30分钟。</li>
	<li>重复步骤3.6两次。</li>
	<li>向每个反应管中加入50 µl PBS，涡旋混匀后立即在流式细胞仪上进行检测。</li>
</ol>
4. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>使用内置对照，调节以下流式细胞仪参数以优化数据分析。
	<ol>
		<li>通过使用设备控制面板上显示的前向散射（FSC）阈值控制器，将FSC阈值设为最低值（200），然后开始分析。</li>
		<li>使用散射电压控制器调节前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），使所有PM10颗粒均可被检测，并使颗粒群位于FSC轴的中部附近以及SSC轴的下半部分。</li>
		<li>使用荧光电压控制器，根据需要调整 APC 电压以及另一种不与 APC 在相同波长发射的荧光电压，例如异硫氰酸荧光素（FITC）。确保所有颗粒均可见于两个荧光轴的下半部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>依次检测每个样本，包括天然对照样本，并储存每个样本至少10,000个颗粒的FSC、SSC、APC和FITC数据。</li>
	<li>使用相应的软件对数据进行评估。特异性样本中吸附的过敏原含量可通过两种方式进行定量：
	<ol>
		<li>将所有颗粒物的 APC 荧光强度（中位数值）作为衡量 PM10 颗粒物上 Bet v 1 负载量的指标进行分析。 
		注意：如果特定样本中含有过敏原，与阴性对照相比，该特定样本中的抗原呈递细胞荧光强度应增加。相反，其他荧光强度（例如，FITC 荧光强度）不应发生显著变化。</li>
		<li>计算与抗 Bet v 1 抗体结合的 PM10 颗粒所占百分比。具体操作如下：在阴性对照中，设定一个圈门，圈选被视为 APC 阳性的颗粒，将此圈门复制并粘贴至特异性样本中，然后从特异性样本中 APC 阳性颗粒的百分比中减去阴性对照中 APC 阳性颗粒的百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+air+pollution+increase+the+effect+of+aeroallergens+on+hospitalization+for+asthma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).</li>
<li>Barraza-Villarreal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution%2C+airway+inflammation%2C+and+lung+function+in+a+cohort+study+of+Mexico+City+schoolchildren%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren.</a> Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).</li>
<li>Chen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+ambient+air+pollution+with+airway+inflammation+in+schoolchildren%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren.</a> Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).</li>
<li>Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoor+allergens+in+settled+dust+from+kindergartens+in+city+of+Lodz%2C+Poland%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Occup+Med+Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland.</a> Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).</li>
<li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+peanut+protein+in+the+home+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distribution of peanut protein in the home environment.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of allergic inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).</li>
<li> World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. 16-17 January 2003, Copenhagen, Denmark, , WHO Regional Office for Europe. Chicago. 256(2003).</li>
<li>Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+atopy+and+pollinosis+in+the+adult+population+of+Switzerland+%28SAPALDIA+study%29.+Swiss+Study+on+Air+Pollution+and+Lung+Diseases+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults.</a> Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).</li>
<li>Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abortive+pollen+germination%3A+a+mechanism+of+allergen+release+in+birch%2C+alder%2C+and+hazel+revealed+by+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy.</a> J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).</li>
<li>Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+allergens+adsorbed+to+ambient+air+particles+collected+in+four+European+cities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities.</a> Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).</li>
<li>Süring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PM10+contains+particle-bound+allergens%3A+Dust+analysis+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Env+Technol+Inn%22%5BJournal%5D)">PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry.</a> Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).</li>
<li>Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+of+the+major+birch+tree+allergen+Bet+v+1+in+pollen+and+respirable+fine+particles+in+the+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere.</a> J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).</li>
<li>Buters, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allergen+Bet+v+1+in+fractions+of+ambient+air+deviates+from+birch+pollen+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts.</a> Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).</li>
<li>Buters, J. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+Bet+v+1+from+birch+pollen+from+5+European+countries.+Results+from+the+HIALINE+study%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study.</a> Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).</li>
<li>Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+house+dust+particles+and+diesel+exhaust+particles+as+allergen+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers.</a> Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).</li>
<li>Sven Leckel Ingenieurburo GmbH. LVS3/MVS6. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leckel.de/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=18
">http://www.leckel.de/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=18
</a> (2016).</li>
<li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peanut+protein+in+household+dust+is+related+to+household+peanut+consumption+and+is+biologically+active%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).</li>
<li>Jochner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+variation+of+birch+and+grass+pollen+loads+and+allergen+release+at+two+sites+in+the+German+Alps%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Env%22%5BJournal%5D)">Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps.</a> Atmos Env. , (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案的关键步骤是使用适当的滤膜从环境空气中采集PM10颗粒（见步骤1.1）。滤膜必须足够坚固，能够耐受电动牙刷的刷洗，而并非所有滤膜材料都满足这一要求。染色方案建立时采用的PM10颗粒浓度为每毫升8×106个颗粒。然而，如果样品量有限且不适合合并样本，该方法可能仍然有效，但抗体浓度（见步骤3.5和3.8）可能需要进行调整。
PM10颗粒的Bet v 1染色未产生明显区分的阳性和阴性颗粒群体。这可能是由于每个颗粒吸附的Bet v 1过敏原含量不同，从极少到大量不等。这可能导致APC信号扩展，从而使颗粒群体向APC阳性方向偏移。由于难以将阳性颗粒与阴性颗粒区分开来，因此采用了两种定量方法来确定PM10&#62;0.5样本中Bet v 1含量的差异：（i）通过测量所有颗粒的中位APC荧光强度进行相对定量，以及（ii）确定APC阳性颗粒的百分比。针对低花粉季和高花粉季PM10&#62;0.5颗粒的Bet v 1负荷，两种方法得出的结果相似。然而，推荐使用所有颗粒的中位荧光强度进行相对定量，因为该方法不依赖于设门位置，因此可能具有更低的误差风险。
迄今为止，许多研究通过提取环境空气中颗粒物中的特定过敏原，并采用ELISA进行后续定量，来检测过敏原含量。5,12-14,17此处所述方法与ELISA定量之间存在根本性差异：ELISA用于定量提取并溶解后的抗原，而流式细胞术则用于分析颗粒物结合的抗原。通过ELISA检测，所测试的PM10样品（n=8）中桦树花粉主要过敏原Bet v 1的含量低于1.2 ng/ml的检测限（数据未显示）。类似地，Buters等人亦未在PM中检测到Bet v 1 &#60;2.5 µm 组分中，而在 10 µm 组分中仅约占 7% &#62;PM &#62;2.5 µm 组分，但在 PM 中超过 93% &#62;环境空气中10 µm粒径组分13ELISA检测结果与FACS分析结果之间的差异，可能源于检测方法的不同以及灵敏度的差异。然而，仍需进一步研究以全面理解这一差异。
一种用于可视化颗粒物结合抗原的方法是扫描电子显微镜技术10,14。通过扫描电子显微镜，Ormstad 等在花粉高发季节采集的悬浮颗粒物烟灰颗粒表面观察到了Bet v 1的存在，而在花粉低发季节采集的颗粒物上该蛋白的吸附量较少15。此外，研究发现空气中来自花粉、乳胶以及β-葡聚糖的过敏原均可吸附于燃烧产生的颗粒物上10。然而，该方法无法对颗粒物结合的过敏原进行定量分析。
通过流式细胞术，可对颗粒结合的 Bet v 1 过敏原进行定量。因此，流式细胞术可能为表征 PM10 中 10 至 0.5 µm 的生物组分提供一种新方法；若有其他合适的抗体，该方法还可拓展用于检测环境空气颗粒上的其他抗原，&#160;例如，霉菌、尘螨过敏原或脂多糖（LPS）。由于 PM10 颗粒不仅易于吸附生物物质，也容易吸附化学物质和金属，因此抗体的非特异性结合可能成为一个问题。在测试一种新抗体时，关键步骤是验证其特异性结合能力，例如可通过在染色前用相应的抗原阻断该特异性抗体的结合能力来实现11。
由于环境中 Bet v 1 的含量可能与桦树花粉计数不同12,13,18，过敏症状或许与过敏原水平的相关性优于与花粉计数的相关性14,18。因此，结合临床数据，本文所述方法可在未来的实验中用于检验桦树过敏反应是否与 PM10&#62;0.5 中的 Bet v 1 过敏原负荷相对应。

近年来，空气污染被认为是导致呼吸系统过敏发病率和严重程度上升的重要环境因素1-3。此外，人们对粉尘中常见过敏原的分布也日益关注4,5。
桦树花粉可引发花粉症，也可能是过敏性哮喘的重要诱因6-8整粒桦树花粉由于其粒径较大（直径约22 µm），通常难以进入下呼吸道，也不会存在于PM10中。然而，桦树花粉中的过敏原成分（如主要过敏原Bet v 1）可在花粉破裂后释放9 并可与环境空气中的颗粒物结合10，因此可能进入下呼吸道。事实上，已有研究表明，PM10可能含有具有生物活性的过敏原，这一点已通过实验证实 体外 花粉过敏受试者嗜碱性粒细胞的活化11.
通过提取PM10样品中的相应过敏原，并采用ELISA进行后续定量，已对其中的桦树花粉主要过敏原Bet v 1含量进行了研究12-14。ELISA技术可测定溶解状态的过敏原，但携带过敏原的颗粒数量仍不清楚。扫描电子显微镜虽能显示携带过敏原的颗粒，却无法实现定量分析10,15。
本研究采用流式细胞术定量环境空气样本中携带桦树花粉主要变应原Bet v 1的PM10颗粒比例。由于流式细胞仪的检测限限制，仅能检测粒径大于0.5 µm的颗粒。PM10中粒径&#62;0.5 µm的组分在下文中将简称为PM10&#62;0.5。

<table><tbody><tr><td>聚四氟乙烯滤膜</td><td>Pall Life Sciences, USA</td><td>R2PL047</td><td>47 mm, 1.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>低流量采样器</td><td>Sven Leckel Ingenieur B&amp;uuml;ro GmbH, Germany</td><td>LVS3</td><td>空气流速为 2.3 m&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;/hr</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Biochrom, Germany</td><td>L1825</td><td>不含 Ca/Mg，低内毒素</td></tr><tr><td>电动牙刷&amp;nbsp;</td><td>Braun, Germany</td><td>Oral-B Vitality Sensitive</td><td></td></tr><tr><td>Casy 细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>Sch&amp;auml;rfe System GmbH, Germany</td><td>型号 TTC</td><td>可检测颗粒尺寸范围：0.7 &amp;micro;m 至 45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td></tr><tr><td>FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>三激光，八色（4-2-2）</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva 软件 v6.1.3&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>抗 Bet v 1 的单克隆小鼠 IgG1 抗体</td><td>Indoor Biotechnologies, UK</td><td>&amp;nbsp;MA-3B4</td><td>克隆号 MA-3B4</td></tr><tr><td>APC（别藻蓝蛋白）标记的二抗抗小鼠 IgG1 抗体&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>560089</td><td>克隆号 A85-1</td></tr><tr><td>SPSSTM 软件版本 18&amp;nbsp;</td><td>PASW Statistics 18, Hongkong, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Gosselin, France</td><td>BP50-02</td><td>直径 55&amp;nbsp;mm，高 15&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>FACS 管&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>REF 352054</td><td>5 ml 聚苯乙烯</td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche&lt;br/&gt; Germany</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>空白基质管</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>4140</td><td>1.4 ml，聚丙烯（PP）</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Heraeus, Thermo Scientific</td><td>Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td><td>型号 158 320</td><td>Inetrgra Vacusafe</td></tr><tr><td>重组 Bet v 1a 抗原&amp;nbsp;</td><td>Indoor Biotechnologies, UK</td><td>LTR-BV1A-1</td><td>浓度：2.0 mg/ml</td></tr></tbody></table>

pm10中颗粒结合型过敏原bet v 1的流式细胞术分析

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

流式细胞术是一种广泛用于定量悬浮固体（如细胞或细菌）的方法，其适用颗粒直径范围为0.5至数十微米。除了可表征前向散射和侧向散射特性外，该方法还可利用荧光标记的探针（如抗体）来检测特定结构。本实验采用间接抗体染色法，通过流式细胞术定量可吸入颗粒物（PM10，颗粒直径≤10 µm）中携带桦树花粉过敏原（确切为Bet v 1）且直径在0.5至10 µm范围内的颗粒。PM10颗粒可能作为吸附性过敏原的载体，将其输送至下呼吸道，从而引发过敏反应。
目前，PM10中的过敏原含量主要通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）和扫描电子显微镜进行研究。ELISA检测的是溶解态的过敏原，而非颗粒结合态的过敏原。与可对携带过敏原的颗粒进行可视化的扫描电子显微镜相比，流式细胞术还可实现对这些颗粒的定量分析。由于环境空气中过敏原含量可能与桦树花粉计数存在差异，因此过敏症状或许与过敏原暴露水平的相关性优于与花粉计数的相关性。结合临床数据，本方法为今后实验提供了可能性，即验证对桦树花粉抗原的过敏反应是否与PM10颗粒（&#62;0.5 µm）中Bet v 1过敏原的含量相关。

通过间接抗体染色及随后的流式细胞仪分析，定量检测了PM10&gt;0.5颗粒对Bet v 1过敏原的吸附。实验以花粉高发季节采集的PM10样品作为模板。如步骤3.1所述，阴性对照组为仅与APC标记的二抗孵育的PM10颗粒（图3A）。使用抗Bet v 1抗体和二抗染色的PM10颗粒则显示了携带过敏原的颗粒（图3B）。如步骤4.3所述，采用两种方法对过敏原负荷进行定量：一方面，分析所有颗粒APC荧光强度的中位值，阴性对照组为137，特异性样品为904；另一方面，测定结合抗Bet v 1抗体的颗粒百分比：在阴性对照组中设定门控圈定APC阳性颗粒，随后将该门控复制并应用于特异性样品。在阴性对照组中，3%的PM10&gt;0.5颗粒被判定为APC阳性。将该假阳性比例从特异性样品中阳性颗粒的百分比中扣除，最终得出特异性样品中有77.5%的PM10&gt;0.5颗粒为APC阳性。为验证抗Bet v 1抗体的结合具有特异性，在染色前使用相应抗原预先封闭其结合能力。结果显示，若以APC荧光强度进行定量，抗体结合信号降低了69%；若以Bet v 1阳性PM10&gt;0.5颗粒的百分比进行定量，则信号降低了84%（图3C）。
<img alt="流式细胞术分析示意图；APC 与 FSC-A 散点图；抗原-抗体相互作用研究。" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 结合在颗粒上的 Bet v 1 过敏原可通过流式细胞术进行可视化检测。 高花粉季节 PM10 样品的 APC 荧光强度，仅使用 APC 标记的二抗染色（A）、先使用抗 Bet v 1 一抗再使用 APC 标记的二抗染色（B），以及用重组 Bet v 1 抗原封闭一抗后的染色结果（C）。门控 PAPC+ 设定在判定为 APC 阳性的颗粒周围（以红色显示），并给出相应百分比。该图已根据文献11稍作修改。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
为了验证该方法是否可用于揭示高花粉季和低花粉季PM10&gt;0.5样品中吸附的Bet v 1含量差异，共分析了13个高花粉季的PM10样品和6个低花粉季的PM10样品。图4显示，与低花粉季的PM10样品相比，高花粉季的PM10样品在APC荧光强度以及Bet v 1阳性PM10&gt;0.5颗粒比例方面均存在显著差异。两种定量方法得出的结果相似。
<img alt="APC 荧光强度和 Bet v 1 阳性颗粒百分比；按季节比较的箱形图。" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 低花粉季与高花粉季采集的 PM10 样品中吸附的 Bet v 1 含量存在差异。 低花粉季 PM10 样品采自2013年秋季/冬季（n=6），高花粉季 PM10 样品采自2012年和2013年5月（n=13）。(A) 高花粉季 PM10&gt;0.5 颗粒的 APC 荧光强度显著高于低花粉季（高花粉季中位数/最小值/最大值：796/313/1097；低花粉季中位数/最小值/最大值：197/85/277）。(B) 高花粉季 PM10 中 Bet v 1 阳性 PM10&gt;0.5 颗粒的比例显著高于低花粉季（高花粉季中位数/最小值/最大值：45.2/18.5/74.5；低花粉季中位数/最小值/最大值：11.8/4.4/19.8）。箱形图显示中位数（箱体内实线）、第25和第75百分位数（箱体下沿和上沿）以及最小值和最大值（须线）。***p&lt;0.001，与低花粉季相比，Mann Whitney U 检验。该图经11轻微修改。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

在此，我们介绍一种通过流式细胞术定量过敏原负载颗粒的实验方案。环境中的颗粒物可作为吸附性过敏原的载体。本文表明，流式细胞术——一种广泛用于表征悬浮固体的常用方法——可用于检测和定量携带过敏原的颗粒物。 &#62;直径为0.5 µm的颗粒可用于测量这些携带过敏原的颗粒。

PM10中颗粒结合型过敏原Bet v 1的流式细胞术分析

流式细胞术是一种广泛用于定量悬浮颗粒（如细胞或细菌）的方法，其适用尺寸范围从0.5微米至数十微米。

本方法的总体目标是利用流式细胞术对携带过敏原的环境颗粒物进行定量分析。该方法有助于回答有关PM10颗粒物过敏原负荷的关键问题。这些颗粒物可能作为吸附过敏原的载体，将其运输至下呼吸道。该技术的主要优势在于能够快速可视化并定量携带过敏原的PM10颗粒物。我们已针对桦树花粉主要变应原Bet v 1建立了该方法，但该方法也可适用于其他抗原。本实验操作将由本实验室技术员Sabine Bach进行演示。首先，使用低流量采样器，通过聚四氟乙烯滤膜采集环境空气中直径小于或等于10微米的颗粒物。根据空气中颗粒物的含量和所需的时间分辨率，运行采集器一到十天。采集结束后，从采样器中取出滤膜，并在负20摄氏度下冷冻，直至进行分析。当准备继续进行样品分析时，从冷冻箱中取出聚四氟乙烯滤膜，使其解冻约五分钟。然后将滤膜放入干净的聚苯乙烯培养皿中，并加入足够的PBS覆盖滤膜，以获得每毫升8×10⁶个颗粒的浓度。用镊子夹住滤膜，使用带有敏感刷头的电动牙刷刷洗一分钟。然后，将颗粒物PBS悬浮液转移至一支干净的反应管中。取50微升PM10悬浮液，用10毫升等渗测量缓冲液稀释。使用颗粒计数器测量所收集的 PM10 颗粒的浓度。根据三次独立测量结果计算平均颗粒浓度。如果发现颗粒物浓度过低，且合并多个样品是合适的情况下，可使用一个样品的颗粒 PBS 悬液来收集另一个滤膜上的颗粒。首先，确定所需的反应管数量。对于每一种待分析的 PM10 悬液，需要三种类型的反应管：一支含有天然对照样品的反应管，一支含有阴性对照样品的反应管，以及一支含有特异性染色样品的反应管。接下来，计算所需PM10悬浮液的体积。每个反应管需要50微升悬浮液。然后，通过加入适量的PBS，将样本中测得的颗粒浓度调整至最终浓度为每毫升8×10⁶个颗粒。接下来，通过向 PM10 悬液中添加 0.02% BSA 进行非特异性结合封闭，该 BSA 溶液由 PBS 配制的 1% BSA 储存液稀释获得。轻轻涡旋混匀 PM10 BSA 悬液，并在室温下孵育 20 分钟。对于每份需进行流式细胞术分析的样品，取 50 微升该悬液转移至洁净的反应管中。向指定用于特异性染色的反应管中加入抗 Bet v 1 的单克隆小鼠抗体，终浓度为 0.02 微克/微升。短暂涡旋混匀，然后将所有反应管在室温下孵育 60 分钟。接着，通过向每根反应管中加入 500 微升含 0.02% BSA 的 PBS 缓冲液，并短暂涡旋混匀，对所有样本进行洗涤。然后，使用真空泵将样品离心成团，并小心弃去上清液。确定所需APC标记的二抗（抗小鼠IgG1）的总量，并用相应体积的含0.02% BSA的PBS稀释。除天然对照外，向所有反应管中加入50 µL稀释后的二抗。向阴性对照中加入 50 微升含 0.02% BSA 的 PBS。将所有样品涡旋振荡数秒，并在避光条件下孵育 30 分钟。孵育结束后，按前述方法将所有样品洗涤两次。最后一次洗涤后，向每个反应管中加入 50 微升普通 PBS。然后涡旋混匀样品，并在流式细胞仪上进行分析。使用同型对照调节细胞仪参数，以优化数据分析。首先，将前向散射阈值设为最低值200，然后开始分析。接着，使用散射电压控制器调节前向散射，随后调节侧向散射，使所有PM10颗粒均被检测到，并使颗粒群大致位于前向散射轴的中部以及侧向散射轴的下半部分。重新启动分析并记录数据。然后，使用荧光电压控制器调整二抗的荧光电压以及另一荧光信号（如 FITC）。此步骤完成后，重新启动分析并记录数据。确保所有颗粒均出现在两个荧光轴的下半部分。依次检测每个样本，并记录每个样本中至少10,000个颗粒的前向散射、侧向散射、二抗荧光以及FITC数据。一种量化吸附过敏原含量的方法是分析所有颗粒的APC荧光强度。为此，点击FITC中位数和APC中位数按钮以编辑统计结果。然后，将各组数值及阴性对照与特异性染色样本中的数值进行比较。另一种量化吸附过敏原含量的方法是测定携带结合抗Bet v 1抗体的PM10颗粒所占的百分比。该方法首先设定一个门控范围，圈选被视为假阳性的颗粒。接下来，点击特异性染色的样本，并使用相同的门控，分析该样本中 APC 阳性的颗粒。在花粉高发季节，大量 PM10 颗粒已结合 Bet v 1 抗原。Bet v 1 的识别具有特异性，因为当使用重组 Bet v 1 抗原封闭一抗时，信号显著下降。将花粉高发季节采集的PM10颗粒物与花粉低发季节采集的颗粒物进行比较时，发现Bet v 1阳性PM10颗粒物所占比例存在显著差异。花粉高发季节采集的颗粒物更有可能含有Bet v 1抗原。一旦掌握该方法，若操作得当，对采集的PM10颗粒物进行流式细胞术分析可在四到五小时内完成。请注意，流式细胞术仅能检测大于5微升的颗粒。如果采用本实验流程，需牢记我们发明此方法的目的是用于测定PM10颗粒中桦树花粉主要变应原Bet v 1的负荷量，这与ELISA方法存在根本区别，因为ELISA检测的是溶解状态的抗原。若环境中空气的Bet v 1含量与花粉计数存在差异，则过敏症状可能与变应原水平相关。结合临床数据，该方法可用于检测桦树花粉过敏反应是否与PM10中的过敏原水平相对应。若备有其他合适的抗体，该方法还可拓展用于检测环境空气颗粒物上的其他抗原，如LPS、霉菌或尘螨过敏原。

flow-cytometric-analysis-of-particle-bound-bet-v-1-allergen-in-pm10

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

粒子结合Bet v 1的变应原PM10的流式细胞分析

本文描述了分离小鼠肺泡巨噬细胞（肺部固有先天免疫细胞）并检测其在与聚酐纳米颗粒共培养后活化反应的实验方案。...

收获小鼠肺泡巨噬细胞及评估聚酸酐纳米颗粒诱导的细胞活化

我们描述了一种在卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症条件下，监测肺树突状细胞对卵清蛋白刺激的成熟与迁移的策略。该策略可经修改后用于评估感染条件下肺树突状细胞的迁移情况。...

过敏性气道炎症期间肺树突状细胞成熟与迁移的分析

在本视频中，我们演示了使用流式细胞术检测在试验性变应原存在下嗜碱性粒细胞活化的方法。...

使用流式细胞术分析测试变应原存在下的嗜碱性粒细胞活化

本研究描述了一种采用组分解析方法的实验方案，用于研究中国南方一群过敏性鼻炎和/或哮喘患者对禾本科花粉过敏原的致敏情况。...

针对中国南方过敏性鼻炎和/或哮喘患者进行禾本科花粉过敏原研究的组分解析诊断方法

本文的目的是详细介绍通过双腔体积描记法评估清醒小鼠呼吸功能的推荐操作步骤。...

通过双腔体积描记法评估清醒小鼠的呼吸功能

了解环境颗粒物的生物组成对于研究其对人类健康和疾病传播的重要影响具有重要意义。本文采用三种生物气溶胶采样方法及对空气微生物的生物学分析，以更深入地探究不同环境条件下空气微生物群落的特征。...

不同环境条件下生物气溶胶的组成与分布分析

本文介绍了一种基于微流控芯片化学发光系统的血清特异性免疫球蛋白E检测方法，并评估了其在过敏诊断中的应用价值。...

生物芯片微流控技术在血清特异性免疫球蛋白E（sIgE）过敏原检测中的应用

环境过敏原（如屋尘螨（HDM））通常含有可激活先天免疫反应以调节过敏性炎症的微生物成分。本文所述方案展示了如何鉴定HDM过敏原中的双链RNA（dsRNA）成分，并表征其在调控嗜酸性粒细胞肺部炎症中的免疫原性活性。...

鉴定和表征尘螨过敏原中调节嗜酸性粒细胞肺部炎症的免疫原性RNA种类

本文介绍了使用转染了人IgE受体的大鼠嗜碱性白血病细胞系进行的介质释放试验，以模拟在I型过敏反应中通常观察到的效应细胞脱颗粒过程。该方法以高度敏感、可重复且可定制的方式研究过敏原的生物活性。...

人源化介质释放检测作为过敏原效力的读出方法

我们详细阐述了在印度实地开展的一项大型随机对照试验中，空气和生物样本采集过程所采用的一致且高质量的操作流程。通过对适用于农村地区暴露评估的创新技术应用进行监督所获得的经验，有助于改进野外数据采集实践，获得更可靠的研究结果。...

可视化印度家庭空气污染干预网络试验中暴露与生物标志物评估的现场数据收集流程

本文介绍了一种用于测量气道巨噬细胞碳含量的详细实验方案，旨在评估个体暴露于颗粒物水平下的内部暴露剂量。...

测量暴露于含碳颗粒物的气道巨噬细胞中的碳含量

学习使用流式细胞术定量分析负载Bet v 1过敏原的PM10颗粒物。该方法可快速可视化并量化环境颗粒物中的过敏原含量，为研究过敏原在呼吸道中的转运机制提供有效工具。

PM10中颗粒结合型过敏原Bet v 1的流式细胞术分析

探索更多视频