一种简便高效的可逆二硫键交联胶束制备方法

本实验的总体目标是提供一种简单且高效的方案，用于合成载药型二硫键交联胶束，以实现靶向药物递送。该方法有助于回答纳米医学领域中的一些问题，例如如何有效制备稳定的纳米制剂。

该技术的主要优势在于，能够大规模地轻松合成二硫键交联胶束，这对于开展患者的临床研究极为有利。开始此操作时，将两克单甲氧基封端的聚乙二醇单胺加入圆底烧瓶中，再加入十毫升无水DMF以溶解该物质。

在冰上冷却。向圆底烧瓶中加入三当量的羟基苯并三唑、三当量的二异丙基碳二亚胺（DIC）以及三当量的二乙基甲氧羰基保护的赖氨酸。随后，加入10 mL无水DMF。

将混合物在磁力搅拌器上搅拌20分钟。然后将该混合物加入含有单甲基封端聚乙二醇的圆底烧瓶中。将圆底烧瓶从冰浴中取出，随后在室温下搅拌过夜。

搅拌完成后，按照文本方案中所述确认反应是否完全。向反应瓶中加入200毫升冰乙醚。在4摄氏度下以6,000 × g离心6分钟，以分离析出的聚合物。

重复沉淀和离心过程两次，每次沉淀前将产物重新溶解于10毫升DMF中。然后用冰乙醚洗涤聚合物三次。将试管连接至高真空源，以除去残留的乙醚。

随后，向聚合物中加入 20 毫升 20% 的 4-Methylpiperidine DMF 溶液。搅拌至完全溶解。让反应持续进行三小时。

在确认反应完成后，将聚合产物干燥。现在将聚合中间体2号置于真空条件下，然后按照文本方案中所述进行额外的聚合合成步骤。当聚合中间体10号生成后，将其转移至反应烧瓶中。

加入30毫升无水DMF。在另一个烧瓶中，将24当量的活化胆酸溶于20毫升DMF中。然后加入48当量的N, N-二异丙基乙胺。

搅拌10分钟。搅拌结束后，将混合物转移至含有聚合物中间体10的反应烧瓶中。让反应过夜进行。

第二天，按照文本方案确认反应完成，并沉淀聚合物中间体11。随后将聚合物中间体在去离子水中透析。冻干样品，得到白色粉末。

制备胶束后，将20毫克的端粒树状聚合物和5毫克的紫杉醇溶解于1毫升氯仿中。使用旋转蒸发仪除去溶剂，得到均匀的干燥聚合物薄膜。通过涡旋振荡，用1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重新溶解该薄膜。

然后在40千赫兹下超声处理30分钟。加入3%过氧化氢以氧化端树状大分子上的巯基。按照文本方案中所述进行额外的制备和验证步骤。

胶束制备完成后，使用动态光散射仪测定胶束的粒径及粒径分布。测量在室温下进行，并将胶束浓度保持在每毫升1毫克。接下来，配制浓度为每毫升7.5毫克的十二烷基硫酸钠PBS储备溶液。

然后在 PBS 中配制浓度为 1.5 毫克/毫升的二硫键交联胶束储备液。使用该储备液配制混合液，使最终 SDS 浓度为 2.5 毫克/毫升，胶束浓度为 1.0 毫克/毫升。

加载样品，并每隔两分钟测量胶束溶液的粒径及粒径分布。从裸鼠采集新鲜抗凝血后，取1毫升血液样本，在1,000 × g离心10分钟以收集红细胞。用PBS洗涤三次，然后用PBS重悬细胞沉淀，最终浓度为2%。取200微升红细胞悬液与浓度为1.0毫克/毫升的PTX NCMs溶液混合。

然后将200微升红细胞悬液与浓度为1.0毫克/毫升的PTX DCM溶液混合。将混合物置于37摄氏度的摇床培养箱中孵育4小时。孵育结束后，在3,000 × g条件下离心5分钟。

将每个样品的上清液100微升转移至96孔板中。随后使用酶标仪在540纳米处测定游离血红蛋白的吸光度。根据Ellman's Test测定结果，经过48小时的氧介导氧化后，游离巯基转化为二硫键的转化率达到85%。

此处采用过氧化氢介导的氧化方法作为替代方法。该方法在30分钟内转化率达到88%，比氧气介导的方法快96倍。

采用这种更高效的方法，已制备出超过50克的纳米颗粒，测得粒径为27纳米，且粒径分布狭窄。此外，在强烈的胶束破坏条件下，也考察了载有紫杉醇（PTX）的二硫键交联胶束的稳定性。胶束的粒径随时间保持稳定，表明其结构保持完整。

在细胞内浓度的谷胱甘肽（GSH）引入后，载药的二硫键交联胶束尺寸在30分钟内保持完整，随后迅速减小至1纳米。这表明达到一定数量的关键二硫键被还原，这是胶束快速解离的前提条件。此处展示了载紫杉醇（PTX）胶束溶血活性的代表性结果。

PTX NCMs 具有剂量依赖性的红细胞裂解作用。然而，具有二硫键交联的 PTX DCMs 则未表现出可观察到的溶血活性。一旦掌握，只要操作得当，该技术可在其他情况下同样成功实施。

在进行该操作时，重要的是要记住加入等量的3%过氧化氢以形成二硫键。完成此操作后，可进行溶血实验，以评估二硫键交联胶束的血液相容性。观看本视频后，您应能够充分理解如何有效合成载药的二硫键交联胶束。

请注意，其中一些化学品可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，应始终采取佩戴个人防护装备等预防措施。