一种用于定量检测犬中性粒细胞胞外诱捕网释放的简易荧光检测法

本实验的总体目标是分离静息态中性粒细胞，并检测其在激动剂刺激下释放DNA的反应。该方法有助于回答免疫学和兽医学领域的一些关键问题，例如：中性粒细胞对不同中性粒细胞胞外诱捕网（NET）诱导剂或细胞死亡激动剂的反应如何？该技术的主要优势在于能够快速筛选多种NET形成的激动剂和抑制剂。

首先，将21号蝶形针插入健康犬供体的头静脉，然后连接一个3毫升注射器，采集三份3毫升的血液样本，并立即将样本转移至未加盖的含EDTA的采血管中。注意穿刺过程应无创，且血流应顺畅，因为采血不良将导致中性粒细胞得率降低。每填满一管后，立即倒置混匀，以确保血液与抗凝剂充分混合。

将血液收集至一个50毫升锥形管中。加入等体积的无菌室温3%右旋糖酐500，轻轻倒置混匀，室温下静置18至20分钟。随后将上层淡黄色液体转移至新的离心管中，直至无法在不混入下层红色成分的情况下继续收集为止。

离心上层液体。弃去上清液，将沉淀物用10毫升无菌室温磷酸盐缓冲液（PBS）手动重悬。接着，向50毫升锥形管中加入10毫升室温的聚蔗糖-泛影酸钠细胞分离溶液。

将细胞小心地铺在分离液上。通过离心分离细胞。弃去上层的三层血浆、血小板单个核细胞及密度梯度层。

用10毫升室温水裂解任何残留的红细胞。30秒后，加入10毫升无菌室温1.8%氯化钠溶液以恢复渗透压。通过轻柔倒置混匀细胞。

现在通过离心收集细胞。将白色沉淀物在10毫升无菌PBS中轻轻重悬。计数后，再次离心细胞，并将沉淀物重悬于无菌室温PBS中，浓度为每毫升5×10⁶个细胞。

根据需要，将少量细胞滴加于载玻片上自然干燥，随后按照制造商说明书使用快速固定和染色试剂盒进行染色。若中性粒细胞分离成功，在光学显微镜下观察应可见至少95%的有核细胞为粒细胞，且红细胞污染极少。中性粒细胞分离后立即进行操作，将细胞悬液经无菌70微米滤膜过滤，取5 × 10⁴个细胞加入含培养基的96孔板检测孔中，于39摄氏度、4%二氧化碳条件下孵育30分钟。

待细胞贴壁后，向检测孔以及仅含 PBS 的两个空白孔中加入终体积为 100–200 微升的含目标激动剂的 RPMI 培养基（不含酚红，并添加热灭活的胎牛血清）。随后向细胞中加入适量的细胞不可渗透性核酸染料，并将培养板放回孵箱。经过适当的孵育时间后，使用酶标仪检测荧光信号。

血小板活化因子刺激犬中性粒细胞一小时后，其荧光强度较未刺激的对照细胞平均增加四倍。然而，PMA 是一种作用较慢的激动剂，在激活两小时之前不会显示出中性粒细胞荧光的增强，但随时间推移最终产生相似倍数的荧光增加。核酸染料荧光并非中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的特异性指标，因为若细胞通过其他机制发生死亡，或试剂被DNA污染时，亦可出现荧光信号。

例如，在本代表性实验中，一种商用LPS制剂在无中性粒细胞存在时即产生很强的荧光，可能是由于被细菌DNA污染所致。若操作得当，掌握该技术后可在约六小时内完成实验。在进行该操作时，重要的是要注意轻柔处理中性粒细胞。

不要涡旋细胞，弃上清时应使用移液器吸取，而非倾倒。按照此步骤操作后，可进行其他方法，如免疫荧光显微镜检测，以确认所释放的DNA与NETosis相关。该技术建立后，为血液学领域的研究人员探索释放的DNA在凝血过程中的相互作用，以及新型NET诱导剂（包括患者血浆）的作用提供了途径。

观看本视频后，您应能充分了解如何分离犬中性粒细胞并检测其对激动剂的反应。