简单而高效的生产和鼠标髓鞘少突胶质糖蛋白的纯化的实验性自身免疫性脑脊髓炎研究

该方案的总体目标是基于髓鞘少突胶质细胞糖蛋白或 MOG 的胞外结构域生成蛋白质，可用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎或 EAE。该协议使任何实验室都可以制造 MOG 蛋白，以用作诱导 EAE 的抗原。该方案的主要优点是它不依赖于专门的蛋白质处理设备，而是您可以使用几乎任何免疫学实验室中的标准设备。

嗯，该方案基于小鼠版本针对 MOG 标签蛋白进行了优化，它应该适用于其他包含用于纯化的 hestate 的 MOG 蛋白表达系统。用 BL 21 MOG 标签甘油原液接种 5 毫升无菌肉汤，并在 37 摄氏度和 200 RPM 下孵育过夜。将 500 微升 100 毫克/毫升氨苄青霉素添加到装有 500 毫升无菌 LB 的 500 毫升烧瓶中。将 1 mL 过夜培养物转移到两个 LB 肉汤瓶中。

在 37 摄氏度和 200 RPM 下孵育 5 小时或光密度高达 0.6。达到所需的细胞密度后，向每个培养瓶中加入 0.5 毫升 1 摩尔 IPTG。孵育培养瓶，在 37 摄氏度和 200 RPM 下放置 4 小时，然后在室温下以 75 RPM 放置过夜。

将培养物均匀分布在与高速离心兼容的 250 毫升瓶子中，并从此时开始将瓶子保持在冰上。在 4 摄氏度下以 22， 000 倍 g 的浓度沉淀细菌细胞 15 分钟。将所有细菌沉淀重悬并混合在总共 30 mL 的裂解物缓冲液中。

将此体积转移到底部 50 毫升管中，该管能够高速离心。将此试管置于 30 摄氏度的水浴中 30 分钟。在孵育期间，摇动试管两次以重悬细胞。

孵育后，将试管运送到冰上，以 20 kHz 的频率和振幅 70% 的幅度对溶液进行超声处理，脉冲开启 3 秒，关闭 3 秒，持续 5 次脉冲，对溶液进行总共 6 轮 5 次脉冲的超声处理，让溶液在轮次之间在冰中冷却。接下来，将溶液在 4 摄氏度下以 24， 000 次 g 离心 15 分钟，然后将沉淀重悬于 30 毫升缓冲液 A 中，并在 4 摄氏度下孵育溶液 3 小时。孵育后，像以前一样在冰上对溶液进行超声处理，然后向溶液中加入 17.2 克盐酸胍。

将样品在冰上孵育 1 小时以溶解 MOG 标签蛋白。要对镍树脂进行装料和平衡，首先向每根含有树脂的试管中加入 40 毫升水来清洗树脂。将试管水平放在摇杆上，让它们在 4 摄氏度下搅拌 5 分钟。

完成后，在 4 摄氏度下以 4500 倍 g 离心试管 8 分钟。通过移液丢弃上清液，以避免干扰沉淀。然后向每管中加入 40 毫升电荷缓冲液。

将试管转移到摇杆上，让它们在 4 摄氏度下搅拌 15 分钟，然后像以前一样再次离心。弃去上清液，向试管中加入 40 毫升缓冲液 B。将试管转移到摇杆上，让它们在 4 摄氏度下搅拌 5 分钟，然后再次用树脂离心试管。

为了纯化 MOG 标签蛋白，将整个体积的溶解蛋白转移到第一个含有镍树脂的试管中。混合后，将试管水平放在 4 摄氏度的摇杆上 1 小时。在 4 摄氏度下以 4500 倍 g 的浓度集中熔合试管 8 分钟后，将该上清液转移到第二管镍树脂中，并像以前一样孵育。

同时，将第一根试管中的镍树脂重悬于 40 mL析出缓冲液中，并将试管水平放在 4 摄氏度的摇杆上 5 分钟，然后像以前一样离心。将含有暗示的 MOG 标签蛋白的上清液转移到一个 250 毫升标记的纯化 MOG 标签蛋白瓶中。将此瓶子保持在 4 摄氏度。

在每个洗脱步骤中，将所得上清液合并到该瓶中。向第一根试管中的镍中加入 40 毫升条状缓冲液，并在 4 摄氏度下水平放置在摇杆上 5 分钟。离心管，弃去上清液，并像以前一样重新填充上升的镍。

完成后，像处理第一根管子一样，继续处理第二根管子。将溶解的蛋白质总共四轮吸收到带电的镍树脂上并洗脱将回收大部分蛋白质。切割大约 30 厘米的蛇皮透析管。

将蛇皮的末端折叠 3 次以上，然后用止血钳夹住折叠的一端，用锁定的止血钳固定一端。用稀释的 MOG 标签蛋白填充蛇皮。然后通过将蛇皮从开口端挤出来去除蛇皮上的任何气泡。

最后，使用第二个锁定止血钳密封管子的另一端。接下来，在一个大桶中加入 1 升含 4 摩尔胍的 1 x 乙酸盐缓冲液。将最多两段含有 MOG 标签蛋白的透析管放入桶中。

使用胶带将止血钳固定在桶的侧面，为磁力搅拌棒在底部畅通无阻地旋转留出空间。将桶放在 4 摄氏度的房间里，放在磁性裙板上，然后以缓慢的转速打开。透析至少需要三天才能逐渐减少缓冲液中胍的量。

定期检查以确保管子开始完好无损，并且末端已牢固闭合。4 到 5 小时后，向透析桶中加入 1 升 1 升 x 乙酸盐缓冲液。每 4 到 5 小时重复一次此过程，总共 3 次，使桶中的水量总计为 4 升。

丢弃桶中的一半缓冲液后，重新填充 1 升 1 x 乙酸盐缓冲液，并设置管道和搅拌棒。最后，用 4 升新鲜的 1 x 乙酸盐缓冲液替换桶中的全部 4 升体积，并搅拌 4 至 5 小时。为获得最佳结果，请在蛋白质浓缩当天执行此步骤。

为了浓缩 MOG 标签蛋白，用铝箔衬在笔上，并用 PEG 3350 和 PEG 1000 以一比一的比例覆盖铝箔。PEG 3350 有助于防止浓缩过程中的蛋白质聚集，是一种有效的冷冻防腐剂。将含有蛇皮管的 MOG 标签蛋白放在铝箔上，并用 PEG 8000 覆盖。

将其置于室温下并定期检查体积，直到体积等于或低于估计的最终体积。如果笔在浓缩过程中被水过度饱和，请用铝箔和 PEG 设置一个新鲜的平底锅。在整个纯化方案中采集蛋白质样品或在 SDS 页面凝胶上运行以确认纯度。

显示了一个代表性凝胶，显示高度纯化的 MOG 标签为 31.86 千道尔顿。为了验证 MOG 标签蛋白已正确折叠，使用流式细胞术评估了 MOG 标签蛋白与来自野生型 C57 黑色 6 小鼠或 IgH MOG 小鼠的淋巴结的 CD19 阳性、CD4 阴性、9 个 B 细胞的结合表达对 MOG 蛋白具有特异性的免疫球蛋白重链。该协议从开始到结束至少需要 10 天。

在整个分离过程中，跟踪蛋白质并记住需要保留和丢弃的内容非常重要。不要忘记在使用六水硫酸镍时用于给镍树脂充电，这是极其危险的，应采取预防措施以防止吸入或接触皮肤或眼睛。看完这个视频，您应该对如何生产和纯化自己的 MOG 标签蛋白有很好的了解。

纯化后，MOG 标签蛋白可以在完全弗氏佐剂中乳化，并用作诱导 EAE 的免疫。MOG 标签诱导的 EAE 可用于研究多种细胞类型（如 CD4 或 CDAT 细胞或 B 细胞）在中枢神经系统自身免疫中的参与。与受 MHC 限制的短肽不同，蛋白抗原可用于任何品系的小鼠。