用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简单高效制备与纯化

本实验方案的总体目标是制备基于髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）胞外结构域的蛋白质，该蛋白可用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）。本方案使得任何实验室均可自行制备MOG蛋白，并将其作为抗原用于诱导EAE。该方案的主要优势在于无需依赖特殊的蛋白质处理设备，而是可以使用几乎所有免疫学实验室中常见的标准设备完成。

该实验方案是基于小鼠版本的MOG标签蛋白优化的，因此也适用于其他包含纯化用标签的MOG蛋白表达系统。取BL21 MOG标签甘油菌种接种于5毫升无菌培养基中，于37°C、200 RPM条件下过夜培养。向两个各装有500毫升无菌LB培养基的500毫升锥形瓶中，分别加入500微升浓度为100毫克/毫升的氨苄青霉素。将过夜培养物各取1毫升，分别接种至两瓶LB培养基中。

在37摄氏度、200转/分钟条件下培养五小时，或直至光密度达到0.6。当细胞密度达到预期值后，向每个培养瓶中加入0.5毫升1摩尔的IPTG。将培养瓶继续在37摄氏度、200转/分钟条件下培养四小时，随后在室温、75转/分钟条件下过夜培养。

将菌液均匀分配至适用于高速离心的250毫升离心瓶中，此后所有操作均需将离心瓶置于冰上。在4°C条件下，以22,000 × g离心15分钟，收集细菌细胞沉淀。将所有细菌沉淀重悬并合并于总共30毫升的裂解缓冲液中。

将此体积转移至约底部50毫升的离心管中，该离心管可耐受高速离心。将该离心管置于30°C水浴中孵育30分钟。在孵育期间，振荡离心管两次以重新悬浮细胞。

孵育结束后，将离心管转移至冰上，于20千赫兹、70%振幅条件下对溶液进行超声处理，每次超声3秒，间歇3秒，共5次脉冲；重复此过程共6轮，每轮之间将溶液置于冰上冷却。随后，在4摄氏度条件下，以24,000 ×g离心15分钟，弃上清后将沉淀重悬于30毫升缓冲液A中，并于4摄氏度孵育3小时。孵育结束后，如前所述在冰上对溶液再次进行超声处理，然后向溶液中加入17.2克盐酸胍。

将样品置于冰上孵育一小时，以溶解MOG标签蛋白。为使镍树脂结合并达到平衡，首先向每管含有树脂的样品中加入40毫升水进行洗涤。将各管水平放置于摇床上，在4°C下振荡五分钟。

操作完成后，在 4 °C 条件下以 4500 × g 离心 8 分钟。用移液器小心吸弃上清液，避免扰动沉淀。然后向每根试管中加入 40 毫升电荷缓冲液。

将离心管置于摇床上，于4 °C条件下振荡15分钟，然后按之前方法再次进行离心。弃去上清液，向各管中加入40 mL缓冲液B。将离心管再次置于摇床上，于4 °C条件下振荡5分钟，随后将含有树脂的离心管再次离心。

为纯化MOG标签蛋白，将溶解后的全部蛋白体积转移至含有镍树脂的第一管中。混匀后，将该管置于4°C条件下，水平放置在摇床上孵育1小时。在4°C、4500 × g条件下离心8分钟后，将上清液转移至第二管镍树脂中，并按前述条件孵育。

在此期间，将第一个管中的镍树脂重悬于40毫升洗脱缓冲液中，置于4°C水平摇床上轻摇5分钟，然后按前述方法离心。将含有目标MOG标签蛋白的上清液转移至一个标记为“纯化的MOG标签蛋白”的250毫升瓶中，并将该瓶置于4°C保存。

每进行一次洗脱步骤，都将所得上清液收集到此瓶中。向第一根试管中的镍中加入40毫升洗脱缓冲液，并在4°C下水平放置于摇床上孵育5分钟。离心试管，弃去上清液，并像之前一样重新装填镍柱。

完成后，对第二根试管重复与第一根试管相同的操作。经过四轮对可溶性蛋白在带电镍树脂上的吸附与洗脱，即可回收大部分蛋白。剪取约30厘米长的蛇皮透析管。

用止血钳夹紧一端，将蛇皮末端折叠三次，然后用止血钳夹住折叠端。用稀释的MOG标签蛋白填充蛇皮。然后通过挤压将蛇皮中的气泡从开口端排出。

最后，使用第二把锁紧止血钳封闭管子的另一端。接着，将一升一倍乙酸盐缓冲液与四摩尔胍溶液混合后倒入一个大桶中。将最多两段含有MOG标签蛋白的透析管放入桶内。

使用胶带将止血钳固定在桶的侧面，以便为底部磁力搅拌子的自由旋转留出空间。将桶置于4°C的房间内，放在磁力搅拌底座上，并以缓慢的转速启动。透析至少需要三天时间，以逐步降低缓冲液中胍的含量。

定期检查以确保透析管完整无损，且两端已牢固封闭。四到五小时后，向透析桶中加入1升1×醋酸盐缓冲液。此后每四到五小时重复此步骤，共重复三次，最终使桶中液体总体积达到4升。

倒掉桶中一半的缓冲液后，加入一升 1× 醋酸盐缓冲液，并安装好管路和搅拌子。最后，将桶中的全部四升缓冲液更换为四升新鲜的 1× 醋酸盐缓冲液，持续搅拌四到五小时。为获得最佳效果，建议在蛋白质浓缩当天进行此步骤。

为浓缩MOG标签蛋白，用铝箔衬垫一支笔管，并在铝箔上覆盖等比例的PEG 3350与PEG 1000。PEG 3350有助于防止蛋白在浓缩过程中发生聚集，且具有有效的冷冻保护作用。将含有MOG标签蛋白的透析管置于铝箔上，再用PEG 8000覆盖。

将此溶液置于室温下静置，并定期检查体积，直至体积等于或低于预估的最终体积。如果透析袋在浓缩过程中因吸水过多而过度饱和，请更换新的铝箔和聚乙二醇（PEG）重新设置。在纯化方案的各个阶段提取蛋白质样品，或将其进行SDS-PAGE凝胶电泳以确认纯度。

图中显示了代表性凝胶结果，可见高度纯化的MOG标签蛋白条带位于31.86千道尔顿处。为验证MOG标签蛋白是否正确折叠，通过流式细胞术检测了该蛋白与来自野生型C57BL/6小鼠或表达针对MOG蛋白的免疫球蛋白重链的IgH MOG小鼠淋巴结中CD19阳性、CD4阴性B细胞（共九种B细胞）的结合能力。本方案从开始到结束至少需要10天。

在整个分离过程中，重要的是要追踪蛋白质的去向，并明确哪些部分需要保留，哪些部分需要弃去。使用六水合硫酸镍对镍树脂进行活化时，务必格外小心，因为该物质具有极高危险性，应采取预防措施，避免吸入或与皮肤及眼睛接触。观看本视频后，您应能够充分掌握如何自行表达并纯化带有MOG标签的蛋白质。

纯化后的MOG标签蛋白可与完全弗氏佐剂乳化，用于免疫以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。由MOG标签蛋白诱导的EAE可用于研究多种细胞类型（如CD4+或CD8+ T细胞以及B细胞）在中枢神经系统自身免疫中的作用。与受MHC限制的短肽不同，蛋白抗原可在任何品系的小鼠中使用。