Name: 简单而高效的生产和鼠标髓鞘少突胶质糖蛋白的纯化的实验性自身免疫性脑脊髓炎研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 学习利用标准实验室设备生产和纯化小鼠髓鞘少突胶质糖蛋白（MOG）融合蛋白的方法，用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型。该方案无需专用蛋白处理设备，适用于各类免疫学研究实验室开展多发性硬化症相关研究。

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本研究工作获得了加拿大多发性硬化症协会的资助。RWJ 获得了加拿大多发性硬化症协会Waugh家族博士生奖学金。

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文描述了一种MOGtag蛋白的制备方案，以及如何从MOGtag蛋白中获得纯化的MOG1-125。该方案基于标准的His标签蛋白纯化方法，同时也参考了先前报道的一种较早期MOG相关蛋白的制备流程15。尽管本文未详细说明，MOGtag蛋白的主要用途是通过蛋白抗原免疫来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。一种与MOGtag蛋白兼容的小鼠EAE诱导方案可参见文献3。我们此前已证实，使用MOGtag或由MOGtag衍生的MOG1-125进行免疫，不仅能够诱导出比标准MOG35-55肽更强的中枢神经系统自身免疫性疾病，表现为更显著的脊髓炎症和脱髓鞘，而且还能激活识别MOG蛋白的致病性IgHMOG B细胞，使其针对MOGtag或MOG1-125产生生发中心反应，而MOG35-55则无法实现这一效应5...

多发性硬化症（MS）是一种人类疾病，其特征是中枢神经系统（CNS）发生慢性炎症和神经退行性病变，被认为是由针对髓鞘的自身免疫反应所引发。随着时间推移，髓鞘和轴突的丧失导致认知功能和运动功能逐渐下降1。&#34;实验性自身免疫性脑脊髓炎&#34;是用于描述以CNS髓鞘为靶标的自身免疫性疾病动物模型的统称。与人类MS相似，EAE通常表现为免疫细胞浸润中枢神经系统，在某些情况下还伴有脱髓鞘2。然而，任一特定EAE模型在多大程度上模拟人类MS，部分取决于所使用的物种或品系，以及潜在抗髓鞘自身免疫反应的复杂性。
抗髓鞘自身免疫可通过多种方式在实验中诱导产生，但目前最常用的方法是用一段模拟髓鞘蛋白中免疫优势CD4+ T细胞表位的短肽对小鼠进行免疫。这代表了诱导致病性免疫反应的最低要求。其中最常用的是来源于少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（MOG35-55）的21个氨基酸肽段，该肽段用于在C57Bl/6小鼠中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）3。然而，出于某些实验目的，使用较大的蛋白质抗原进行免疫更为理想，甚至必不可少，且相比短肽免疫具有多项优势。首先，由于MHC限制性，短肽通常仅在少数品系中有效，而较大的蛋白质抗原（代表完整蛋白或特定结构域）可被正常加工并在多种近交系小鼠甚至不同物种中呈递4。其次，较大的蛋白质抗原能够诱导更为复杂的免疫反应，使更多类型的淋巴细胞参与抗原识别，而不局限于CD4+ T细胞的识别。例如，B细胞通过其B细胞受体（BCR）直接与完整蛋白而非加工后的蛋白发生相互作用。我们及其他研究者已证实，由MOG35-55免疫激活的B细胞无法识别MOG蛋白5。鉴于近期研究已证明B细胞在人类多发性硬化症（MS）中具有致病作用6，能够将B细胞纳入自身免疫病理过程的EAE模型正变得日益重要。
尽管使用较大的蛋白质抗原诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）具有诸多优势，但目前市面上此类蛋白质的来源仍然十分有限。事实上，像MOG35-55这样的短肽可以快速合成且成本相对较低，而MOG蛋白的商业化选择则较少，且购买价格显著更高。尽管如此，目前已有若干表达载体可供研究团队自行制备MOG胞外域（MOG1-125）。然而，我们在文献中所发现的所有表达系统均基于较早期的技术，而这些技术目前已被更高效的表达系统所取代7。此外，大多数系统基于大鼠或人源MOG8。在针对小鼠自身免疫性疾病的研究中，使用基于小鼠MOG自身抗原的抗原更为理想。最后，我们所发现的所有基于MOG的蛋白质，无论是商业产品还是表达载体，均为融合蛋白，其在MOG1-125基本序列基础上额外添加了其他氨基酸序列。这些附加序列包括用于纯化的标签，通常还包含其他功能未知的序列。
为解决这些局限性，我们构建了一种基于小鼠MOG胞外域的新型融合蛋白，该融合蛋白连接了一个含有硫氧还蛋白的标签，以克服MOG蛋白已知的不溶性问题5。该标签序列还包含一个6xHis序列用于纯化，以及一个TEV蛋白酶切割位点，可根据需要完全去除所有标签序列。据我们所知，这是目前唯一能够获得纯MOG1-125蛋白的方法。为了便于大量生产蛋白，MOG1-125序列经过密码子优化以适应细菌表达系统，并将MOGtag融合蛋白插入pET-32表达系统中。本文详细描述了利用大多数免疫学实验室常见的非专用设备来生产并纯化MOGtag蛋白以及纯MOG1-125蛋白的实验方案。

<table><tbody><tr><td>BL21 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;- pet32-MOG&lt;sub&gt;tag&lt;/sub&gt;</td><td>Kerfoot 实验室</td><td></td><td>需要这些细菌来表达 MOG&lt;sub&gt;tag&lt;/sub&gt; 蛋白。这些细菌的甘油菌种可根据要求提供。</td></tr><tr><td>LB 培养基（Miller 配方）</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>将粉末溶于 50% 乙醇/50% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，配制成 100 mg/ml 溶液。于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>将粉末溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，配制成 1 M 溶液，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>鸡卵溶菌酶</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>将粉末溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，配制成 50 mg/ml 溶液，于 -80 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>life technologies</td><td>20012-027</td><td>无需使用商用磷酸盐缓冲液，任何实验室自制的标准 PBS 均可满足要求。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>纯度必须高于 98%。</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镍(II)</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>His Bind 树脂</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>以 20% 乙醇/80% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EAAN</td><td>根据需要用水稀释。</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>三水合乙酸钠</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白标准品</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 分子量截留蛇皮透析管</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>该试剂不得在通风橱外操作。</td></tr><tr><td>AcTEV 蛋白酶</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>可使用（https://www.addgene.org/8827/）构建并表达 TEV 蛋白酶，并参照文献 17 进行纯化。</td></tr><tr><td>聚乙二醇 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 平底 96 孔板</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon 微孔板分光光度计</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>该设备使用 Gen5 数据分析软件。</td></tr><tr><td>Gen5 数据分析软件</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白脱盐柱</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>预制 12% 聚丙烯酰胺凝胶</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>快速染色试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统（Gel Dock EZ）</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>白光样品托盘</td><td>bio-rad</td><td>1708272&amp;nbsp;</td><td>与凝胶成像系统（Gel Dock EZ）配合使用，用于考马斯亮蓝染色成像</td></tr><tr><td>蛋白分子量标准</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简单高效制备与纯化

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性炎症性疾病，被认为是由针对髓鞘的自身免疫反应所引发。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是CNS自身免疫性疾病的最常用动物模型，通常通过使用代表髓鞘蛋白免疫优势CD4+ T细胞表位的短肽进行免疫接种来诱导。然而，B细胞可直接识别未加工的完整蛋白，而短肽免疫无法激活那些识别天然蛋白的B细胞。鉴于近期针对多发性硬化症患者的B细胞耗竭疗法的临床试验提示B细胞在人类疾病进展中具有重要作用，迫切需要能够包含B细胞对自身抗原识别的动物模型。为此，我们构建了一种新的融合蛋白，其中包含小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的胞外结构域，并在其N端融合了用于纯化的His标签以及硫氧还蛋白蛋白以提高可溶性（MOGtag）。该融合蛋白还包含烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点，以便去除所有标签序列，仅保留纯净的MOG1-125胞外结构域。本文介绍了一种仅使用常规实验室设备即可大量制备纯净MOGtag或MOG1-125的简便方案。该方案可稳定产出超过200 mg的MOGtag蛋白。使用MOGtag或MOG1-125进行免疫接种均可引发包含识别天然小鼠MOG的致病性B细胞在内的自身免疫反应。

纯化完成后，应将步骤 1.4、2.1、3.4 以及步骤 6.4 的最终产物所收集的样品进行蛋白质凝胶电泳分析（图 3A）。MOG标签 应首先在T中表现为一条31.86 kDa的条带过夜 样本，但非T0，且应是最终纯化产物中的唯一条带。为了检测MOG标签 蛋白正确折叠后，MOG标签 蛋白可用于通过FACS标记MOG蛋白特异性B细胞。通过以1:1,000稀释度的MOG标记小鼠淋巴细胞标签 结合针对 His 标签的二抗以及荧光标记的抗 IgG1 三抗，可鉴定 MOG 特异性 B 细胞（图3B）。或者，MOG标签 可直接与荧光染料偶联，以减少背景染色（由B细胞与二抗和三抗结合所致），具体方法见参考文献5 用于鉴定MOG特异性B细胞。在野生型小鼠中鉴定MOG结合性B细胞时，此步骤是必要的，因为这类细胞通常极为稀少5IgH...

我们介绍一种仅使用常规实验室设备的简单方案，用于大量制备和纯化含有小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的融合蛋白。该蛋白可用于诱导由T细胞和B细胞共同介导的实验性自身免疫性脑脊髓炎。

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性炎症性疾病，被认为由自身免疫反应引发……

本方案的总体目标是制备基于髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）胞外结构域的蛋白质，可用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）。该方案使任何实验室均可自行制备MOG蛋白，作为抗原用于诱导EAE。本方案的主要优势在于无需依赖专用的蛋白质处理设备，而是可以使用几乎所有免疫学实验室都具备的标准设备完成。该实验方案是基于小鼠版本的MOG标签蛋白优化的，因此也适用于其他带有纯化用标签的MOG蛋白表达系统。取5毫升无菌培养基，接种BL21 MOG标签甘油菌，于37摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养。向两个各装有500毫升无菌LB培养基的500毫升锥形瓶中，分别加入500微升浓度为100毫克/毫升的氨苄青霉素。将过夜培养物各取1毫升，分别接种至两瓶LB培养基中。在37摄氏度、200 RPM条件下培养五小时，或培养至光密度达到0.6。当达到所需细胞密度后，向每个培养瓶中加入0.5毫升1摩尔的IPTG。将培养瓶置于37摄氏度、200 RPM条件下继续培养四小时，随后在室温、75 RPM条件下过夜培养。将菌液均匀分配至适用于高速离心的250毫升离心瓶中，此后所有操作均需将离心瓶置于冰上。在4°C条件下，以22,000 × g离心15分钟，收集细菌细胞沉淀。将所有细菌沉淀重悬并合并于总共30毫升的裂解缓冲液中。将此体积转移至约底部50毫升的离心管中，该离心管可耐受高速离心。将该离心管置于30°C水浴中孵育30分钟。在孵育期间，振荡离心管两次，以重新悬浮细胞。孵育结束后，将离心管转移至冰上，于冰上以20千赫兹、70%振幅超声处理溶液，开启3秒，关闭3秒，共5个脉冲；重复此过程共六轮，每轮之间将溶液置于冰上冷却。随后，将溶液在4°C、24,000 ×g 条件下离心15分钟，弃上清，将沉淀重悬于30毫升缓冲液A中，并在4°C孵育3小时。孵育结束后，再次如前所述在冰上对溶液进行超声处理，然后向溶液中加入17.2克盐酸胍（guanidine HCl）。将样品置于冰上孵育一小时，以溶解MOG标签蛋白。为使镍树脂结合并达到平衡，首先向每管含树脂的样品中加入40毫升水进行洗涤。将各管水平放置于摇床上，在4°C条件下振荡五分钟。操作完成后，在 4 °C 条件下以 4500 × g 离心 8 分钟。用移液器小心吸弃上清液，避免扰动沉淀。然后向每个试管中加入 40 毫升平衡缓冲液。将离心管置于摇床上，4摄氏度下振荡15分钟，然后按之前方法再次离心。弃去上清液，向各管中加入40毫升缓冲液B。将离心游戏副本置于摇床上，4摄氏度下振荡5分钟，然后再次对含有树脂的离心管进行离心。为了纯化MOG标签蛋白，将溶解后的全部蛋白溶液转移至含有镍树脂的第一管中。混匀后

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

简单而高效的生产和鼠标髓鞘少突胶质糖蛋白的纯化的实验性自身免疫性脑脊髓炎研究

本视频展示了一种高效的均质化技术，用于制备抗原-佐剂乳剂，以在小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。该乳剂的水相中含有自身抗原——髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），周围由包含灭活病原菌的连续油相包裹。该乳剂可实现抗原的持续释放，从而引发持久的免疫反应。...

制备抗原-佐剂乳剂以诱导自身免疫性脑脊髓炎

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本视频演示了通过注射髓鞘来源的多肽并联合佐剂以激活自身反应性T细胞来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的方法。这些T细胞会迁移至脑部。同时给予百日咳毒素以增加血脑屏障的通透性，使这些T细胞及其他免疫细胞得以进入脑组织。这些免疫细胞引发脱髓鞘，导致神经传导受损，从而诱发EAE。...

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

来源：Jain, R. W., et al. 用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简易高效制备与纯化. J. Vis. Exp.

重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的分离与纯化

神经干细胞/祖细胞（NPCs）的移植在神经再生医学领域具有广阔前景。系统性递送NPCs已成为一种高效、低侵入性的治疗方案，可将干细胞成功输送至患有实验性慢性中枢神经系统炎症损伤的啮齿类动物和非人灵长类动物的脑和脊髓中。...

慢性EAE小鼠模型中神经干细胞/祖细胞的全身注射

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的一种成熟动物模型。通过用髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫C57BL/6小鼠，可诱导中枢神经系统中自身反应性免疫细胞引发的上行性弛缓性瘫痪。本文将讨论疾病诱导与监测的相关方案。...

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）诱导的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）

我们描述了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁珠分离方法，该方法可快速、特异性地分离出细胞用于 体外...

小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁珠分离

为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化症的动物模型），需用含有自身抗原和完全弗氏佐剂的油包水乳剂对小鼠进行免疫。尽管目前已存在多种乳剂制备方案，本文介绍了一种快速、简便且标准化的乳剂均质化制备方法。...

一种快速、简单且标准化的匀浆方法用于制备抗原/佐剂乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

学习利用标准实验室设备生产和纯化小鼠髓鞘少突胶质糖蛋白（MOG）融合蛋白的方法，用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型。该方案无需专用蛋白处理设备，适用于各类免疫学研究实验室开展多发性硬化症相关研究。

用于实验性自身免疫性脑脊髓炎研究的小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的简单高效制备与纯化

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