使用滤芯过滤水样并提取环境DNA

本实验方案的总体目标是使用滤膜滤筒过滤水样，并在无需切开滤筒外壳的情况下直接提取环境DNA，以用于对多种水生生物进行环境DNA宏条形码分析。该方法可帮助解决生态学领域的关键问题，例如生物多样性监测和群落生态学研究。该技术的主要优势在于滤筒可处理较大体积的水样，且过滤与DNA提取过程均可在无菌条件下完成。

开始此操作时，将高真空管路连接至吸液泵的输入接口。将管路的另一端连接至多通道阀。确保多通道阀上的三个红色T型阀均处于关闭位置。

接下来，戴上一副干净的手套。将雌性鲁尔接头插入真空橡胶管的上端，然后将真空连接器插入下端。

小心地将雌性鲁尔接头连接到滤筒的出口端口。然后，将真空连接器连接到硅胶塞上。将一升采集的水样倒入已准备好的塑料袋中。

将带有公鲁尔锁扣接头的螺帽包住。然后，小心地将组装好的滤筒的一个进液口与公鲁尔锁扣接头连接。确保所有连接处均牢固。

然后，将塑料袋挂在网状面板的两个叉状物上。将硅胶塞插入多通阀的入口端口。接着，打开抽吸器。

打开红色三通阀进行过滤。运行 manifold 系统直至滤芯干燥，然后关闭红色三通阀。

重复整个过程以过滤所需量的水。当所有采样水过滤完毕后，小心地将滤芯从塑料袋和真空容器中取出，并使用合适的鲁尔帽封闭滤芯两端。

然后，使用耐溶剂记号笔标记滤 cartridge 和进样鲁尔帽。在准备进行 DNA 提取前，于 20 摄氏度下保存。对于超过四升的样品，按照文本方案中的说明准备一个十升的细口瓶。

加入待过滤的水样。然后，将一支10毫升的移液器吸头紧密插入书形瓶的阀门中。再将滤筒的进样口紧密插入移液器吸头中。

然后，将硅胶塞插入歧管的进样口。打开抽滤泵，随后打开红色T型阀进行过滤。

运行 manifold，直至滤筒干燥。过滤完成后，关闭红色T型阀。小心地将滤筒从塑料袋和真空连接器上取下。

然后使用合适的鲁尔帽封闭柱子的两端。使用耐溶剂的笔标记柱子和入口鲁尔帽。在20摄氏度下保存，直至准备进行DNA提取。

将培养箱预热至 56 摄氏度。然后，从一个 2.0 毫升离心管上切下铰链盖并丢弃盖子。取下滤器 cartridge 的入口鲁尔帽。

然后，将进样口插入2.0毫升离心管中。使用自封膜将 cartridge 与收集管之间的连接处严密密封。接着，将组合单元插入适用于15毫升锥形管的离心机适配器中。

将滤芯在5000 × g条件下离心1分钟，以去除滤膜中残留的液体。离心完成后，从滤芯上取下收集管并弃去。然后，重新盖上进样口盖帽。

接下来，将 20 µL 蛋白A-Case溶液、220 µL 磷酸盐缓冲液和 200 µL AL缓冲液混合。取下入口盖，用移液器将混合液加入滤筒中，移液器应完全插入入口孔。重新盖上入口孔盖。然后，将滤筒置于旋转摇床上。

将旋转摇床放入预热的培养箱中，并将摇床转速设为20 rpm，持续20分钟。在孵育期间，使用耐溶剂记号笔标记一个新的2.0毫升离心管，然后将其放入一个50毫升锥形管中。

孵育完成后，取下进样帽，然后将进样口插入新的2.0毫升离心管中，用螺旋盖盖紧锥形管。

在5000 × g下离心一分钟以收集提取的DNA。然后，使用灭菌镊子将 cartridge 转移至2.0 mL离心管中。盖上管盖，并按照文本方案中的说明纯化提取的DNA。

在此实验中，使用同一套多通道过滤装置和两种不同的滤膜，对四种不同体积的海水进行过滤，随后提取环境DNA（eDNA）。滤筒式滤膜检测到的物种数量平均比玻璃纤维滤膜多50%。若操作熟练，正确执行该技术可在两小时内完成。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用滤芯对水样进行过滤，以及如何在不切开滤芯外壳的情况下直接提取环境DNA，用于对多种水生生物的环境DNA进行 metabarcoding 分析。