Name: 超极化 13ç代谢磁共振波谱与成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学习使用动态核极化技术对碳13标记分子进行超极化，并通过磁共振波谱实时监测前列腺癌细胞中的乳酸脱氢酶活性。该方法可显著增强代谢信号，为癌症代谢研究提供重要工具。

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E.K. 感谢慕尼黑工业大学生物工程研究生院（GSB）提供的支持。本工作得到了德国研究基金会（DFG）在合作研究中心 SFB 824 项目“癌症治疗的成像选择、监测与个体化”中的资助。

1. 样品储备液的制备
<ol>
	<li>向浓缩的[1-13C]丙酮酸中加入钆特酸葡胺（GadM，0.5 mol/L），使GadM的终浓度为1 mmol/L。向该混合物中加入三苯甲基自由基三（8-羧基-2,2,6,6-四（羟乙基）-苯并[1,2-4,5]双（1,3）二硫杂环-4-基）甲基钠盐（OX063），使其终浓度为15 mmol/L。涡旋振荡至完全溶解。 
	注意：该储备液的配制适用于3.35 T的临床前DNP超极化仪。当使用7 T的临床超极化仪时，无需添加钆特酸葡胺，因为在较高磁场下其作用可忽略不计。添加基于钆的对比剂可提高固态下的极化度及极化速率；然而，在液态下，该对比剂会缩短T1弛豫时间。</li>
</ol>
2. 培养细胞
<ol>
	<li>在具有125 cm2生长面积的培养瓶中培养PC3细胞。使用含10%胎牛血清（FCS）的F-12K培养基，在37 °C、5% CO2的湿化气氛中维持细胞生长。在溶解步骤前，从培养瓶中移除培养基。 
	注意：每种细胞系均需要特定的传代培养方案。请咨询细胞系供应商以获取相关要求。</li>
</ol>
3. 实验用细胞的制备
<ol>
	<li>移除细胞培养基，并用约 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>向培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶，将细胞培养瓶放回培养箱中孵育3至5分钟。</li>
	<li>加入约 5 mL F-12K 培养基以灭活胰蛋白酶。</li>
	<li>使用自动细胞计数器对细胞进行计数。混匀 10 µL 细胞悬液的 10 µL 染色液。用移液器充分混匀后转移 10 µL 将混合液加入“计数玻璃”的计数室中。</li>
	<li>消化并计数培养瓶中的细胞。转移含有目标数量细胞的相应体积悬液（例如， 5 × 106 最多108) 转移至塑料样品瓶中。</li>
	<li>以 1,200 × g 离心 5 分钟，弃上清液。</li>
	<li>用含10% FCS的F-12K培养基重悬细胞，定容至总体积 800 μL 并将它们转移至一个反应杯（2 mL）中。将反应杯放入装有温水的塑料管中。</li>
</ol>
4. 溶解剂的制备
注意：溶解剂是用于溶解超极化样品的液体。在生物学应用中，通常使用基于水（H2O）或重水（D2O）的缓冲液进行溶解，例如含有1 g/L乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS）或三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）缓冲液。
<ol>
	<li>20 mmol/L PBS 缓冲液的制备
	<ol>
		<li>配制 100 mL 溶解剂时，将 36 mg 一钠磷酸盐（NaH2PO4）、247 mg 二钠磷酸盐（Na2HPO4）和 10 mg EDTA 溶解于 100 mL 含 20 mmol/L 氢氧化钠（NaOH）的 D2O 溶液中，充分混匀直至完全溶解。 
		注意：缓冲液中添加 EDTA（1 g/L）是为了消除可能存在的铁磁性离子，这些离子可能破坏超极化状态。NaOH 用于以 1:1 摩尔比中和丙酮酸，使 pH 达到 7.4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 可变温度插件（VTI）冷却
<ol>
	<li>在 DNP-NMR 极化仪程序的主窗口中，点击“Cooldown”（冷却）。
	 
	注意：此操作将启动真空泵，将 VTI 抽真空至约 5.0 mbar。随后，VTI 与液氦储罐之间的针阀完全打开，使液氦流入 VTI。针阀调节液氦流速，以在达到氦沸点前维持 VTI 内最佳液氦量。之后，VTI 被抽至接近完全真空，温度降至约 1.4 K。VTI 中的液氦填充至 65%。此时，仪器已准备好进行样品装入。</li>
</ol>
6. 样品制备与插入
<ol>
	<li>使用微量移液器，将约 8 µL 的 13C 标记样品储备液加入塑料杯中。</li>
	<li>将塑料杯固定到插入杆上，并在主程序窗口中点击“插入样品”以启动样品插入过程。选择“普通样品”，然后点击“继续”。 
	注意：在此过程中，针阀首先关闭，以停止液氦流入 VTI，随后 VTI 内压力上升。VTI 内的样品架从液氦中升起，VTI 顶部的进气阀打开，并通过进气阀引入氦气流，以防止空气中的湿气污染。</li>
	<li>当系统提示时，将带有塑料杯的插入杆向下推入 VTI 中。务必确保到达 VTI 底部的样品架位置，否则氦气可能将样品推出 VTI。</li>
	<li>拆下并取出插入杆。</li>
	<li>在对话窗口中点击“下一步”以完成该步骤。样品插入过程不应超过 10 秒。 
	注意：随后进气阀关闭，停止氦气流，带样品杯的样品架重新浸入液氦中，针阀打开，使液氦重新流入 VTI。5 至 10 分钟后，VTI 温度降至 1.4 K 以下，从而使所有自由电子实现极化。</li>
	<li>通过检查确认样品塑料杯已正确进入 VTI，确保其未仍附着在插入杆上，也未被氦气推出 VTI。然后点击“完成”。</li>
</ol>
7. 微波扫描（可选）
注意：微波扫描可用于确定最佳微波频率，以最大化目标化合物中13C原子核的超极化速率。
<ol>
	<li>为测量微波扫描，请启动 RINMR 程序，输入“HYPERSENSENMR”，然后点击“Select Config”和“Do Microsweep”。</li>
	<li>为启动该过程，请在主程序窗口中选择“calibrate”选项卡。</li>
	<li>点击“Generate”，并设置起始和终止频率（例如，94.100 GHz–94.200 GHz）、频率步长（例如，20 MHz）、功率（100 mW）和时间（60 s）。然后点击“Continue”、“Enable”和“Start”。 
	注意：使用这些参数时，超极化仪首先以94.100 GHz的微波频率和100 mW的功率对样品进行60秒的极化。随后，施加一个90°射频（RF）脉冲，并利用内置的波谱仪采集超极化的13C信号。上述步骤将在指定频率范围内的每个频率点重复进行。在后续的超极化实验中，应选择所测得信号幅度最大的微波频率。</li>
</ol>
8. 偏振
<ol>
	<li>为了测量极化建立过程，启动 RINMR 程序，输入“HYPERSENSENMR”，然后点击“Select Config”和“Solid Build-up”。</li>
	<li>在 DNP-NMR 极化仪程序主窗口中，点击“极化”以启动超极化过程。</li>
	<li>选择最佳微波频率（在微波扫描过程中获得）和功率（例如， 100 mW）照射样品，然后点击“下一步”。</li>
	<li>启用“偏振累积监测”并点击“完成”。</li>
	<li>对样品进行极化处理 &gt; 95%（约60分钟，适用于[1-13C]丙酮酸 
	注意：在极化过程中，微波被引导进入VTI并到达样品，导致 13C 自旋与超极化未配对电子自旋对齐。为测量超极化建立过程，采用翻转角（FA）为 5° 定期施加（例如， 每300秒），并将所得信号绘制成偏振建立曲线。</li>
</ol>
9. 溶解
<ol>
	<li>当极化度达到 > 95% 时，在 DNP-NMR 极化仪程序主窗口中点击“Dissolution”以启动溶解过程。</li>
	<li>从下拉菜单中选择溶解过程，然后点击“Next”。 
	注意：极化仪允许通过选择吹扫气体的时间来定义所需的溶解过程。</li>
	<li>通过顶部阀门将约 5 mL 溶解剂注入极化仪溶解部分的加热容器中。使用以下公式计算所需溶解剂的精确体积： 
	<img alt="静态平衡方程；V_{DA} 公式。" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> 
	其中 VDA 为所需溶解剂体积，mPA、mOX063 和 mGad 分别为加入样品储备液中的丙酮酸、OX063 和钆特酸葡甲胺的质量。</li>
	<li>将溶解棒置于进样阀上方的激活位置。 
	注意：此操作可使仪器将其溶解装置连接至VTI中的样品杯。</li>
	<li>点击“Finish”以启动溶解过程。 
	注意：溶解剂被氦气加压至 3 bar，并随后加热至 200 °C，导致压力升高。当压力达到 10 bar 时，针阀关闭，停止液氦流入 VTI。样品架将样品杯从液氦中升起。溶解棒下降进入 VTI 并与样品杯连接。受加热容器中溶解缓冲液和氦气产生的压力推动，预处理后的溶解剂经由溶解棒流入样品杯，使样品迅速溶解。溶液随后通过塑料管流入收集瓶中。接着，带样品杯的溶解棒从 VTI 中升起。</li>
	<li>将带样品杯的溶解棒移至“cleaning”位置，并点击“Finish”完成该过程。</li>
</ol>
10. 检测13C超极化信号
<ol>
	<li>13碳代谢磁共振波谱 体外
	<ol>
		<li>混合 200 µL 来自收集烧瓶的20 mmol/L溶解的超极化样品 800 µL 细胞悬液的 
		注意：最终得到的[1-13C]丙酮酸盐为 4 mmol/L。</li>
		<li>使用移液器充分混匀悬浮液，并转移约 600 µL 装入5毫米核磁共振管中。</li>
		<li>将5 mm核磁共振管插入1-T核磁共振波谱仪中。在软件主窗口中，点击“Run”开始测量，施加一系列共一百次的 10° 每3秒一次射频脉冲。 
		注意：测量超极化样品与细胞初始混合至波谱采集开始之间的时间。确保混合过程不超过30秒，以尽量减少极化度损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>13C代谢磁共振成像
	<ol>
		<li>用于构建容器的 体外 使用MRI波谱仪进行实验时，取一支5 mL注射器，并将其连接至一根足够长的导管（直径d = 1.2 mm），导管长度需能从波谱仪的等中心延伸至可操作区域。</li>
		<li>填充 体外 用于实验的所需浓度细胞溶液的容器（例如， 108）或使用酶溶液。</li>
		<li>放置一个 体外 容器置于MRI磁体的等中心处。放置一个 13容器上放置C调谐射频接收线圈。放置浓缩的 13C标记的校准模体（例如， 10-mol/L 13C-尿素）附近。</li>
		<li>插入“体外 容器”置于核磁共振扫描仪的等中心附近。</li>
		<li>运行扫描仪的标准三平面定位序列并进行调整 体外 根据需要调整容器位置至等中心。</li>
		<li>运行一个 1H T2加权“解剖”序列，覆盖整个 体外 容器定位。使用以下参数：二维自旋回波，轴向方位，重复时间（TR）= 2,000 ms，回波时间（TE）= 20 ms，层厚 = 1 mm，视野覆盖 体外 容器，每次激发采集16个回波。此步骤中需对质子进行磁场匀场。</li>
		<li>在解剖图像中，选择以目标区域为中心的5个连续切片。开具一个 13C谱学校准数据采集，覆盖所选解剖切片。采用以下参数：二维Block-Siegert校准序列，轴向定位，12 × 12中心编码，TR = 1,000 ms，层厚 = 5 mm，视野与解剖图像匹配，扫描次数（NS）= 64，带宽 = 5,000 Hz，翻转角（FA）= 90°.</li>
		<li>选择 13C波谱校准序列（更多信息请参见Schulte） 等 2011)75 从脉冲序列库中选择。通过点击“Download”将脉冲序列从计算机下载至扫描仪。点击“Spectra Prescan”以运行波谱预扫描。在谱图幅值图中，调节来自 13将C校准模体置于扫描仪频率中心。将接收增益调至最大。点击“Start”开始运行 13C谱学校准序列。注意报告的发射增益和中心频率。</li>
		<li>设置 A 13C 化学位移成像（CSI）采集，覆盖所选解剖层面。采用以下参数：二维回波平面波谱成像（EPSI），轴向定位，12 × 12 中心编码，TR = 400 ms，层厚 = 5 mm，视野与解剖图像匹配，NS = 300，带宽 = 5,000 Hz。 
		注意：EPSI 在一次射频激发后，反复采样 k 空间中的单条线，以同时获取空间和光谱信息。有关采集技术的更多详情，请参见 Durst 的文章 等 201576.</li>
		<li>下载 13C CSI 序列并运行波谱预扫描。根据校准序列输出结果调整扫描仪频率和发射增益。</li>
		<li>超极化溶液注入收集瓶后，用注射器吸取约 3 mL，然后注入连接于导管的 体外 容器。开始采集。采集完成后，保存原始数据文件以供后续重建。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. 数据重建
<ol>
	<li>应用以下两种描述的动力学模型之一来分析所获得的数据。
	<ol>
		<li>在描述乳酸脱氢酶（LDH）动力学的第一种方法中，通过动力学值（k）将乳酸信号总和（MLAC）与所有超极化分子信号（Mx）进行比较21,77。 
		<img alt="化学动力学中动态平衡常数k的方程式，公式为k=M_LAC/ΣM_x。" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程2"></li>
		<li>在另一种方法中，随时间测量乳酸和丙酮酸的信号，并将其拟合至动力学模型17,25,71。为求解丙酮酸向乳酸转化的代谢交换速率kPA→LAC以及乳酸的有效信号衰减速率rLAC，可采用双位点交换微分模型下的以下线性微分方程，对乳酸而言表达如下： 
		 
		<img alt="生化过程的微分方程；描述随时间变化的速率；公式分析。" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程3"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
注意：有效的乳酸信号衰减速率 rLAC 取决于乳酸的纵向弛豫时间（T1,LAC）、乳酸向丙酮酸的逆向代谢交换速率 kLAC→PA、所施加的翻转角（FA）和重复时间（TR），以及丙酮酸（MPA）和乳酸（MLAC）的信号强度，同时需考虑每次连续激发后发生的不可逆信号衰减： 
 
<img alt="代谢速率方程，rLAC 公式；生化研究中的动力学分析。" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 4">
因此， r乳酸盐 导致信号衰减的单一不可分离项。由于可以对翻转角和重复时间进行校正，即使存在乳酸向丙酮酸的通量（LAC→PA），我们仍假设乳酸到丙酮酸的交换速率（kLAC→PA）无需纳入计算，依据 Harrison 的结果 等 201278他们的结果表明 kLAC→PA 并不像人们所假设的那样起着至关重要的作用。该模式允许 T1 乳酸的弛豫时间可被定量。该模型不依赖于丙酮酸的给药对测量的影响，在以下情况下尤其如此 体外 实验，不是关键因素，可以忽略。然而，它在以下情况中起着重要作用： 体内 测量79.

Rolf F. Schulte 和 Marion I. Menzel 任职于 GE 全球研究公司。

13使用超极化探针的CMRSI是一种有望实时监测代谢的前沿方法 体外 和 体内采用该实验流程时，一个非常重要的方面是适当的标准化，尤其是在以下方面 体外 实验。首先，样品的制备必须正确且一致，以确保每次实验中获得相同浓度的超极化材料。这需要精确称量待超极化样品和缓冲液。如果浓度不准确，溶液的最终pH值将不精确，这可能会影响T1 以及细胞的反应。尽可能均匀地处理细胞也至关重要。细胞的制备应始终确保从收获细胞到后续实验之间的延迟时间最短，以尽量减少细胞处于高浓度、低体积状态的时间。细胞制备流程中的任何变化，例如不同的制备时间或温度，都可能导致实验数据出现显著差异。样本与细胞的混合过程也应标准化。必须记录示踪剂加入细胞悬液至测量开始之间的时间间隔，因为该时间可能有所变化；在数据分析过程中应考虑这一因素。
正确选择数据分析方法和动力学建模对于解释所获得的数据至关重要。简单模型适用于具有恒定交换速率的两个代谢物之间的单向线性反应。如引言中所述，丙酮酸会经历多个酶促反应，更重要的是，它还会与丙酮酸...

目前，临床上最广泛用于多种癌症的肿瘤分期、再分期、治疗反应监测及复发检测的方法是[18F]-FDG PET1 然而，近年来出现了几种新颖且替代性的方法。其中一种方法是 13CMRSI。该技术涉及引入 13将C分子引入生物样本，随后通过微创MRI评估其代谢情况 体外 或 体内 实时。然而，最大的挑战在于 13CMRSI 与其他方法（如[18其信噪比较低。
核磁共振信号与极化程度成正比，极化程度是指两种能态下自旋½核的布居数之差与总布居数的比值图1A）。极化程度是核的旋磁比（γ）、外加磁场强度与温度之比的乘积。典型的极化度为 1H核在3 T条件下的浓度约为0.001%至0.005%，导致信噪比较低。当今先进的MRI技术之所以成为成功的成像方法，仅得益于H核的高丰度 1H 在生物样本中的含量及其高旋磁比 1H (γ1H = 42.576 MHz/T）。然而，观测其他原子核（如碳）则更具挑战性。唯一稳定的、具有磁活性的碳同位素是 13C，仅占所有碳原子的1.1%。此外，其陀磁比 13C (γ13C = 10.705 MHz/T）是前者的四分之一 1H，导致检测效率降低。总之，这种低 13碳丰度低且γ值低13C 引起热效应 13C 测量以达到 0.0176% 的灵敏度 1H-NMR 测定 体内.
动态核极化
一种克服相对较低灵敏度的方法 13碳测量中的DNP技术最初由Albert W. Overhauser于1953年在金属研究中提出。他在文章中指出：“如果传导电子的电子自旋共振被饱和，则原子核将被极化至与其具有电子自旋的旋磁比时相同的程度。”."2 同年晚些时候，卡弗和斯莱特通过实验验证了奥弗豪泽的假设31958年，Abragam和Proctor描述了液体中电子的这一效应，并将其命名为“固体效应”。在低于4 K的温度下，电子自旋极化度接近100%，比核自旋极化度高出三个数量级以上（图1B)4。这发生的原因在于电子的旋磁比（γe = 28024.944 MHz/T）比原子核的旋磁比高出三个数量级。电子与原子核之间的弱相互作用，如Overhauser效应、固体效应、交叉效应和热混合效应，使得通过微波辐照（频率接近相应的电子顺磁共振（EPR）频率）可将电子自旋的极化转移至核自旋5,6DNP 理论已进一步发展，涉及更多电子及热混合效应。然而迄今为止，尚未发表关于 DNP 的统一量化理论描述。7,8.
<img alt="超极化过程示意图；DNP对极化与温度的影响，比较自旋状态。" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：动态核极化与超极化的理解。A）热平衡极化态与超极化态中自旋布居的示意图比较。B）极化依赖于温度。电子（e-）的极化在低于1.4 K时可达100%。动态核极化（DNP）可将电子的极化转移至13C原子核，使其极化程度提高达105倍。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
将DNP引入生物系统研究中使用 13C核磁共振，随后必须开发快速样品溶解技术。在Overhauser假设提出50年后，Jan H. Ardenkjaer-Larsen 等 解决了将超极化冷冻样品转化为液态且超极化损失最小这一技术难题6溶解性DNP开辟了一个名为 13CMRSI，为研究和表征多种疾病状态提供了一种新方法9,10作为稳定携带未成对电子的载体，通常使用三苯甲基自由基三(8-羧基-2,2,6,6-四(羟乙基)-苯并[1,2-4,5]-双(1,3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲基钠盐（OX063）或(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧自由基（TEMPO）。这些物质需与目标物混合 13C标记的分子并暴露于频率接近相应EPR频率的微波辐射下。利用该技术，可实现极化 13C核的丰度可提高至37%11。这会产生一个105与热平衡极化相比，极化增强倍数11,12然而，一旦微波辐射停止和/或 13C分子转移到液态后，其极化度随纵向弛豫时间（T1的 13C核已被极化。因此，快速溶解技术的发明或任何后续缩短实验测量前时间的技术（即， 注射）在生物学应用中至关重要13.
候选分子若要取得成功，需满足三个主要条件 13CMRSI 研究。首先， 13目标碳核必须具有足够长的T1 (&gt; 10 秒）。选择的 13C标记至关重要。最佳候选核是那些不与氢直接相连的碳原子 1氢核 通过 一种化学键。它还必须在2-3个T内迅速被代谢1 多次重复后，导致下游代谢产物的化学位移与原始物质显著不同。样品混合物在固态时还必须形成无定形玻璃态，以使空间分布减小电子与 13C，从而实现极化的转移。如果候选分子本身不能自然形成无定形玻璃态，则需要在玻璃化试剂（如甘油或二甲基亚砜）中具有高溶解度。14这些要求导致符合条件的候选分子数量相对较少。然而，即使成功发现了一种合适的分子，开发出可行的超极化实验方案在技术上仍可能具有挑战性9,14,15.
近年来，多种底物已成功实现极化，例如[1-13C]丙酮酸12,16-36、[2-13C]丙酮酸37、[1-13C]丙酮酸乙酯38、[1-13C]乳酸39、[1-13C]延胡索酸40-43、13C-碳酸氢盐36,44,45、[1-13C]乙酸钠43,46-49、13C-尿素6,36,50,51、[5-13C]谷氨酰胺15,52,53、[1-13C]谷氨酸53,54、[1-13C]2-氧代戊二酸55、[1-13C]丙氨酸及其他底物14,56。其中一种特别有趣且常用的超极化底物是[1-13C]丙酮酸。它在临床前研究中被广泛用于探究多种疾病中的细胞能量代谢14,17,22。[1-13C]丙酮酸满足成功实现超极化的所有要求，包括相对较长的T1弛豫时间，以及在被代谢之前能够快速穿过细胞膜。目前，基于[1-13C]丙酮酸的临床前研究正逐步向临床应用转化57。
丙酮酸的代谢
众所周知，癌细胞DNA中的突变与其代谢通路的改变之间存在直接关联。早在20世纪20年代，Otto Warburg就发现，与正常组织相比，肿瘤组织中葡萄糖代谢增强，并伴有乳酸生成增加58-60。此后，人们相继描述了其他多种代谢通路的改变，例如磷酸戊糖途径、三羧酸循环、氧化磷酸化以及核苷酸和脂质的合成等。
丙酮酸是糖酵解的终产物。在肿瘤中，它在乳酸脱氢酶（LDH）的催化下进行无氧糖酵解。61 并与辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式发生反应 （NADH），生成乳酸和辅酶的氧化形式（NAD⁺）+）。或者，丙酮酸在丙氨酸转氨酶（ALT）的催化下与谷氨酸发生转氨反应生成丙氨酸。这两个反应均易于逆转。丙酮酸还可经丙酮酸脱氢酶（PDH）催化发生脱羧反应，生成二氧化碳和乙酰辅酶A，此步骤为不可逆反应。这些反应速率的变化可能与肿瘤代谢相关。17,21,22,25,62代谢途径总结如下 图2.
<img alt="超极化过程示意图；DNP对极化与温度的影响，比较自旋状态。" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：丙酮酸主要代谢反应示意图。 丙酮酸与乳酸之间的转化由LDH催化，丙酮酸与丙氨酸之间的转化由ALT催化。丙酮酸经PDH不可逆地转化为乙酰辅酶A和CO2，而CO2在pH依赖性条件下与碳酸氢根处于平衡状态80。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
既往研究已在大鼠心脏37,63-65、肝脏66、肌肉和肾脏62,67中实现了对超极化[1-13C]丙酮酸及其代谢产物的检测。一项研究显示，正常大鼠肝脏与禁食大鼠肝脏之间的乳酸/丙氨酸比值存在显著差异66，并在肝癌中观察到超极化[1-13C]乳酸水平显著升高68,69。有证据表明，在转基因小鼠前列腺癌模型（TRAMP）中，可利用超极化[1-13C]丙酮酸识别肿瘤分级22，且超极化乳酸水平与切除肿瘤的组织学分级具有高度相关性。此外，丙酮酸经丙氨酸转氨酶（ALT）催化生成的丙氨酸也被建议作为大鼠肝细胞癌的潜在有用标志物23。
检测丙酮酸-乳酸代谢通量已被用于监测动物模型中的缺血情况63,65,70，以及对细胞毒性化疗17,40、靶向药物24,25,41或放疗26治疗的响应。该方法还被用于检测磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂LY294002在胶质母细胞瘤和乳腺癌小鼠模型中的治疗响应25。在脑肿瘤26和前列腺癌24,71的治疗后，也观察到了丙酮酸代谢的变化。
前列腺癌
前列腺癌是老年男性中最常见的癌症，也是全球男性因癌症死亡的第二大原因72迄今为止，尚无可靠的无创方法可用于前列腺癌的早期诊断与特征分析73,74，强调了开发新型代谢成像技术以实现对患者进行严格检测和分期的迫切需求。本研究以前列腺癌为模型，展示了溶解态动态核极化（dissolution DNP）与 13患者中的 CMRSI57. 本研究在一项首次临床试验中得以延续，该试验采用了[1-13C]丙酮酸和 13用于前列腺癌成像的CMRSI最近已完成（NCT01229618）。
此项工作的目的在于更详细地向更广泛的受众展示该方法的应用 13在临床前细胞实验中应用CMRSI方法。检测LDH催化的[1-13C]丙酮酸钠到[1-13乳酸 体外 在PC3前列腺癌细胞系中, 我们展示了溶解态DNP的可能应用 体外 研究并解决实验过程中的关键步骤与挑战。

<table><tbody><tr><td>HyperSense DNP 极化仪</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>3.35 T 临床前 DNP 超极化仪</td></tr><tr><td>GE/Agilent MR901</td><td>GE Healthcare/Agilent Technologies</td><td></td><td>7 T 临床前 MRI 扫描仪，配备专为啮齿类动物实验设计的小孔径系统</td></tr><tr><td>Spinsolve Carbon</td><td>Magritek</td><td></td><td>采用永磁体的 1 T NMR 波谱仪</td></tr><tr><td>氧化氘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸 - &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Dotarem (0.5 mmol/L)</td><td>Guerbet</td><td></td><td>钆特酸葡胺&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三(8-羧基-2,2,6,6-四(羟乙基)-苯并[1,2&amp;ndash;4,5]-双(1,3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲基钠盐 (OX063)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>用作自由电子源的三苯甲基自由基</td></tr><tr><td>PC3 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL1435</td><td></td></tr><tr><td>F-12K 培养基&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液，1x</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>样品塑料杯</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013-MSDS</td><td></td></tr></tbody></table>

超极化13c代谢磁共振波谱与成像

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

在过去的几十年中，随着先进的正电子发射断层扫描技术的发展，多种癌症的肿瘤分期、再分期、治疗反应监测及复发检测的新方法相继出现 18F-氟脱氧葡萄糖（[18F]-FDG PET 13C磁共振波谱成像（13CMRSI 是一种微创成像方法，可实现对代谢的监测 体内 并且是实时的。与任何其他基于 13碳核磁共振（NMR）由于碳原子相对较低的旋磁比，面临热极化程度低以及随之而来的信噪比低的挑战。 13C及其在生物样本中较低的天然丰度。通过克服这些限制，近年来动态核极化（DNP）结合后续样品溶解技术，使得常规使用的核磁共振（NMR）和磁共振成像（MRI）系统能够测量、研究和成像多种生物系统中的关键代谢途径。一种特别有趣且具有前景的分子被用于 13CMRSI 是 [1-13C]丙酮酸，在过去十年中已被广泛用于 体外，临床前以及最近的临床研究，用于探究癌症及其他疾病的细胞能量代谢。本文中，我们概述了使用3.35 T临床前DNP超极化仪进行溶解态DNP的技术，并展示了其应用方法 体外 研究. 超极化的一种类似方案在很大程度上可被应用 体内 研究中也采用了乳酸脱氢酶（LDH），并催化了[1-13C]丙酮酸钠到[1-13C]乳酸在前列腺癌细胞系PC3中的研究 体外 使用 13CMRSI

“微波扫描”结果如图3所示。结果显示，对于该[1-13C]丙酮酸样品，在本地3.35 T的超极化装置中，最佳微波频率为94.156 GHz。所有后续的超极化实验（n = 14）均采用该微波频率，并以100 mW的功率进行。微波照射持续60至80分钟，获得的固态超极化度高于90%。结果如图4所示。将超极化的[13C]丙酮酸与5 × 106 (n = 2)、107 (n = 2)、2 × 107 (n = 1)、3 × 107 (n = 2)、4 × 107 (n = 1)、6 × 107 (n = 2)、8 × 107 (n = 2)以及108 (n = 1)个前列腺癌细胞系PC3混合。
结果数据总结于图5和图6中。具有光谱和时间分辨...

动态核极化结合后续样品溶解技术已实现对生物系统中代谢过程的实时研究。超极化[1-13C]丙酮酸用于研究前列腺癌细胞系中的乳酸脱氢酶活性 体外.

超极化13C代谢磁共振波谱与成像

在过去的几十年中，针对多种癌症的肿瘤分期、再分期、治疗反应监测以及复发检测的新方法已经……

本实验的主要目标是利用动态核极化技术对碳13标记的分子进行超极化，并通过碳13磁共振波谱成像技术在体外检测其酶促转化过程。该方法可将碳原子的共振信号增强10,000至100,000倍，从而能够区分底物化合物与其代谢产物，并通过成像手段在体内实现定位。与例如虚拟现实（VR）技术相比，该方法的主要优势在于能够实时观察活体生物体内天然物质的代谢过程。此外，该方法可用于研究癌症的代谢，且因其为体外实验，还可应用于动物模型和人类患者。该技术的应用范围超出了肿瘤定位。可用于发现和区分代谢性肿瘤亚型，并结合最先进的技术监测治疗效果。开始实验前，首先配制浓度为1毫摩尔的钆特酸葡胺溶液和浓缩的碳-13标记丙酮酸。向混合物中加入三苯甲基自由基OX063，使其终浓度达到15毫摩尔，并充分溶解。在 DNP 极化器软件中，单击“冷却”以降低变温插件（VTI）的温度至 1.4 开尔文以下。待 VTI 冷却后，将约八微升的碳-13标记样品溶液放入塑料样品杯中。将样品杯固定到样品插入杆上。在软件中，单击“插入样品”→“选择正常样品”，然后单击“下一步”。此时将升起样品杆并打开通往VTI的进样阀，以便插入样品。根据提示，使用进样杆将样品杯推入VTI中。取下样品杯，并小心地抽出进样杆。确认样品已从杆上脱落，并且在关闭过程中未被推出VTI。单击“下一步”以关闭阀门并将样品杯降入液氦中，然后单击“完成”。为找到最佳极化频率，首先启动RINMR软件。在配置界面中，单击“选择样品”和“进行微扫”，并创建用于存储数据的文件。切换回 DNP 极化仪软件。选择“校准”选项卡，设置微波扫描参数，然后启动微波扫描过程。微波扫描完成后，记录信号幅度最大的频率值。返回 RINMR 软件，选择“固体积累”（Solid Build Up）。然后，在 DNP 极化仪软件中，点击“极化”（Polarization），输入最佳微波频率和功率，点击“下一步”（Next）。启用“极化积累监测”（Polarization Buildup Monitoring），然后点击“完成”（Finish）。对样品进行足够长时间的极化，以实现超过 95% 的极化度。在极化过程中，将收集瓶连接至超极化仪样品排气管，并将其放置在波谱仪附近。使用13碳扫描系列，在间隔三秒的情况下，设置一个特斯拉的核磁共振波谱仪进行110度射频脉冲实验。在丙酮酸盐极化过程中，开始细胞培养的准备工作。从细胞培养瓶中移除细胞培养基。用约10毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞。向培养瓶中加入5毫升胰蛋白酶。在37摄氏度孵育3至5分钟，然后加入约5毫升含10%体积胎牛血清的F12K培养基以终止胰蛋白酶反应。然后，将含有所需数量细胞的细胞悬液转移至一个塑料离心管中。以1200 ×g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于足量含10%胎牛血清的F12K培养基中，终体积为800 µL。将悬浮液转移至1.5毫升微量离心管中，并将试管放入装有温水的塑料容器内。当细胞样本准备就绪且丙酮酸盐的极化度高于95%时，点击DNP极化仪软件中的“Run Dissolution”以开始通过碳13核磁共振波谱法采集数据。通过溶解室顶部的阀门加入指定体积的溶解剂。将溶解棒移至工作位置，点击“下一步”进行确认。待细胞样品准备好后，在DNP极化仪软件中点击“完成”以启动溶解过程。等待溶解过程结束。将200微升的超极化丙酮酸溶液加入800微升的细胞样品中。用移液器充分混匀，然后取约600微升混合液置于5毫米核磁共振（NMR）管中。将NMR管装入波谱仪，点击“Run”开始测量。然后，将带有附着样品杯的溶解棒移至清洗位置，并在 DNP 极化仪软件中点击“Finish”。开始碳-13磁共振成像前，在启动超极化过程后，用细胞数量至少为10的8次方的重悬细胞样品，转移800 µL至一个3 mL注射器中。将注射器连接到一根长导管，并将注射器放置在磁共振成像扫描床上。确保导管长度足以延伸至磁共振成像仪外部。将一个校准用模体放置在注射器旁，该模体含有十摩尔碳13标记的尿素及10%钆特酸葡胺。将碳13调谐的射频接收线圈置于注射器上。将扫描床插入扫描仪中，使感兴趣物体位于磁共振成像仪的等中心位置。将连接烧瓶连接至超极化仪样品排气管，并将其放置在导管末端附近。运行标准的三平面定位序列，并在必要时调整注射器位置。然后，设置并运行覆盖注射器定位区域的质子T2加权解剖序列。根据所得的解剖图像，选取包含碳13模体的目标区域连续五个层面。设置碳13波谱校准采集，并从脉冲序列库中选择2D方块Siegert校准序列。将脉冲序列下载到扫描仪，并运行波谱预扫描。在谱图幅度图中，将碳13校准体模的峰设置在扫描仪频率的中心位置。将接收增益设为最大，然后点击“Scan”以运行校准序列。记录报告的发射增益和中心频率。然后，针对选定的解剖切面设置碳13化学位移成像采集。选择二维回波平面波谱成像序列，并将脉冲序列下载至扫描仪。运行光谱预扫描，并根据校准值调整中心频率和发射增益，以完成磁共振波谱仪的设置。当丙酮酸盐达到95%极化度时，在DNP极化仪软件中点击“运行溶解”（Run Dissolution），并加入溶解剂。将溶解棒移至工作位置。单击“下一步”，然后单击“完成”。当溶解的超极化样品到达收集烧瓶后，用注射器吸取约1毫升超极化溶液，并将其注入导管，使200微升溶液到达细胞样品。单击“扫描”以开始实验数据的采集。数据采集完成后，将带有样品杯的溶解棒移至清洗位置，并在DNP NMR软件中单击“完成”。通过监测超极化乳酸和丙酮酸的碳-13核磁共振波谱信号强度随频率和时间的变化，研究了前列腺癌PC3细胞中丙酮酸向乳酸的代谢交换速率。乳酸动力学参数通过简单的比值模型和双位点交换微分模型进行评估，并归一化至细胞数量。在两种模型中，均观察到随着细胞数量增加，乳酸生成量呈下降趋势。这归因于较高的细胞浓度和样品更大的黏度。细胞数量低于2×10⁷的样品显示出非常小的乳酸信噪比，因此标准差值较大，表明样品中细胞数量至少应达到此水平才能获得有信息价值的数据。通过磁共振成像实现空间定位，并具有良好的谱分辨率，从而能够针对特定频率区域获取碳13图像。空间分布由原始数据确定。碳13图像还可与先前获得的质子图像进行共配准。一旦掌握并正确操作，该实验可在60分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何利用动态核极化技术对目标分子进行超极化，以及如何开展简单的核磁共振波谱和细胞成像实验。在进行该操作时，速度至关重要。请牢记，一旦超极化样品离开极化仪，您所获得的核磁共振信号将在不到两分钟内完全衰减。总之，溶解态DNP可用于多种应用，包括研究糖尿病等疾病，或观察各类癌症的代谢变化，以及测量组织pH值。

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癌症研究

超极化 13ç代谢磁共振波谱与成像

本文描述了通过自旋交换光泵浦（SEOP）方法制备超极化氙气的过程。该方法可使Xe-129的核自旋极化度提高约10000倍，在核磁共振波谱学和成像中具有广泛应用。文中给出了气相和溶液状态实验的示例。...

用于核磁共振与磁共振成像的超极化氙

本文旨在介绍一种将经颅直流电刺激（tDCS）与质子磁共振波谱（1H-MRS）测量相结合的基本实验方案，以研究双侧刺激对初级运动皮层代谢的影响。...

利用磁共振波谱作为测量双侧经颅电刺激对初级运动皮层代谢影响的工具

神经肌肉疾病通常表现出时间上动态变化、空间上异质性以及多方面的病理特征。本方案的目的是利用无创磁共振成像方法对这种病理特征进行表征。...

骨骼肌疾病的定量磁共振成像

通过溶解动态核极化（DNP）实现的灵敏度提升，使得利用核磁共振（NMR）和磁共振成像（MRI）实时追踪代谢过程成为可能。本文讨论了一种专用于研究酶促反应的溶解DNP装置的特性与性能。...

用于通过核磁共振实时测量酶反应速率的溶解动态核极化仪器装置

多室动态模体用于模拟使用超极化磁共振试剂进行代谢研究时感兴趣的某些生物学特性。...

使用多室动态单酶仿体研究超极化磁共振造影剂

一种新的电子顺磁共振（EPR）方法——快速扫描EPR（RS-EPR）被用于二维光谱空间成像，该方法优于传统的连续波（CW）技术，并为相关研究开辟了新的途径 体内 成像。结果在250...

快速扫描电子顺磁共振为生理重要参数的成像开辟了新途径 体内

我们介绍了一种利用快速变场弛豫测量法测定通过动态核极化实现超极化的13C富集化合物的自旋-晶格弛豫时间随磁场变化的实验方案。具体而言，我们以[1-13C]丙酮酸为例进行了演示，但该方案可推广至其他超极化底物。...

测量超极化[1-13C]丙酮酸的自旋-晶格弛豫磁化率随磁场的变化

我们描述了一种实验装置，可用于在持续灌注模式下向离体灌注的小鼠心脏输注超极化13C标记的代谢物。采用专门的13C核磁共振（NMR）采集方法，可实时定量测定代谢酶活性；同时通过多参数31P-NMR分析，测定组织中的ATP含量和pH值。...

使用超极化 [1-13C]丙酮酸及 13C/31P 核磁共振波谱法研究离体灌注小鼠心脏的代谢

该论文介绍了一种利用超极化氙-129化学交换饱和恢复（CSSR）技术追踪肺部气体交换、评估表观肺泡隔壁厚度以及测量表面体积比的详细实验方案。该方法有望用于肺部疾病的诊断与监测。...

通过超极化氙光谱法获得的肺结构与功能的定量测量

本方案将定制的生物反应器系统与超极化¹³C核磁共振波谱技术相结合，用于实时测量活细胞中的丙酮酸代谢，从而提高代谢研究和药物筛选应用中的可重复性和动力学准确性。...

使用超极化13C核磁共振对活细胞进行实时代谢检测

学习使用动态核极化技术对碳13标记分子进行超极化，并通过磁共振波谱实时监测前列腺癌细胞中的乳酸脱氢酶活性。该方法可显著增强代谢信号，为癌症代谢研究提供重要工具。

超极化¹³C代谢磁共振波谱与成像

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