Name: 混合式切割:用于顽拗植物组织样品的改进切法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 了解混合式切割技术，用于改善含硅质晶体和坚韧纤维的顽拗植物组织的切片完整性。该方法通过低温硬化石蜡块，减少晶体剪切问题，适用于原位杂交和FISH等研究。

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我们感谢洪贤兴女士、李敏正先生和吴易平先生提供的技术支持。同时感谢Miranda Loney在英文编辑方面的工作。

1. 固定与包埋
<ol>
	<li>试剂准备
	<ol>
		<li>10x 磷酸盐缓冲液（PBS）
		<ol>
			<li>在800 ml双蒸水（ddH2O）中加入80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na2HPO4和2.4 g KH2PO4，用HCl调节pH至7.4。用ddH2O定容至1 L，然后加入1,000 µl焦碳酸二乙酯（DEPC），剧烈振荡。将PBS在室温下储存过夜，次日于121 °C高压灭菌20分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>1x PBS
		<ol>
			<li>将储存的10x PBS用ddH2O按1:10比例稀释，得到终浓度为0.01 M Na2HPO4、0.002 M KH2PO4、0.003 M KCl和0.13 M NaCl的溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>多聚甲醛（PFA）固定液 
		注意：多聚甲醛具有毒性。应在通风橱中配制，佩戴手套操作。
		<ol>
			<li>配制250 ml PFA固定液时，将100 ml 1x PBS加热至70 - 80 °C，加入1,750 µl NaOH。然后加入10 g多聚甲醛，充分搅拌至完全溶解。将溶液置于冰上冷却后，用H2SO4调节pH至7.2（每100 ml约需260 - 270 µl）。</li>
			<li>用1x PBS将体积调至250 ml，加入625 µl戊二醛，使其终浓度为0.25%。加入250 µl Triton X-100和250 µl Tween 20，以促进固定液的渗透。 
			注：PFA固定液可在4 °C保存一个月而不丧失固定能力。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用DEPC处理水配制不同浓度的乙醇（30%、50%、70%、85%和95%）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>植物样品采集
	<ol>
		<li>腋芽
		<ol>
			<li>选用处于四叶期的成熟Phalaenopsis蝴蝶兰植株。用手沿中脉撕去叶片。</li>
			<li>用锋利的解剖刀小心地从单轴茎上第三或第四片叶基部切下腋芽。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>种子样品
		<ol>
			<li>在授粉后4个月采集成熟的兰花蒴果。用解剖刀纵向切开蒴果，轻轻摇动开口处，将干燥种子散落在滤纸上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>原球茎
		<ol>
			<li>将成熟的兰花种子播种于1/2x Murashige和Skoog琼脂平板上，在组织培养室中于12小时光照周期和25 °C恒温条件下培养。播种后7周取绿色原球茎作为样品。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>原球茎样体（PLBs）
		<ol>
			<li>将兰花PLBs接种于T2再生琼脂平板上，培养条件如前所述10，并置于与步骤1.2.3.1相同的生长环境中。采集高度为5 - 8 mm的10个PLBs。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>叶片样品
		<ol>
			<li>按照步骤1.2.1.1所述方法，从成熟Phalaenopsis蝴蝶兰植株上采集叶片组织。</li>
			<li>用锋利的解剖刀从第二片新生叶片上切下一小块组织（7 mm长 × 5 mm宽）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根样品
		<ol>
			<li>使用与步骤1.2.1.1中相同的植株，用锋利的解剖刀切取1 cm长的根尖组织。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>幼花序
		<ol>
			<li>用锋利的解剖刀从花梗顶端切取10 cm长的幼花序组织。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>花蕾
		<ol>
			<li>从兰花花梗上切下直径约5 mm的小花蕾，纵向切取部分花蕾组织（厚度约3 mm）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>禾本科作物的叶片和小穗组织
		<ol>
			<li>从水稻、小麦和玉米植株的第一片新生叶片上切取1 cm长的叶片组织。</li>
			<li>在开花前一天，从植株（水稻、小麦和玉米）上采集10个小穗。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定
	<ol>
		<li>立即将植物样品转移至含有15 ml冰冻PFA固定液的玻璃闪烁瓶中进行固定。</li>
		<li>在4 °C冷室中对植物样品施加真空（约720 mm Hg），维持15 - 20分钟（应有小气泡从样品中释放）。重复此步骤，直至大多数组织在解除真空后下沉。保持真空过夜，次日缓慢释放真空。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水 
	注：从固定到浸润步骤均使用同一容器。倾倒或用移液器移除前一步的溶液，并向瓶中加入15 ml新溶液。根据组织质地，质地较硬的组织（如兰花腋芽、种子、原球茎、PLB以及水稻、小麦和玉米的小穗）处理时间较长；质地较软的组织（如兰花花蕾、幼花序、叶片和根，以及水稻、小麦和玉米的叶片）处理时间较短。
	<ol>
		<li>固定后，将样品置于15 ml 1x PBS中，在冰上浸泡10分钟。
		<ol>
			<li>在室温下用15 ml系列乙醇对样品进行脱水处理，顺序如下：30%乙醇30分钟，50%乙醇30分钟，70%乙醇1小时，85%乙醇对较硬组织处理54分钟、对较软组织处理30分钟，95%乙醇对较硬组织处理54分钟、对较软组织处理30分钟，100%乙醇处理两次，每次对较硬组织54分钟、对较软组织30分钟。 
			注：植物样品可在4 °C的70%乙醇中保存数月。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>石蜡浸润
	<ol>
		<li>在室温下，用15 ml乙醇与二甲苯替代物的混合液对样品进行浸润处理，较硬组织每次54分钟，较软组织每次30分钟，顺序如下：乙醇/二甲苯替代物（2:1, v/v）、乙醇/二甲苯替代物（1:1, v/v）、乙醇/二甲苯替代物（1:2, v/v），纯二甲苯替代物两次。注意：二甲苯有毒，应在通风橱中操作。</li>
		<li>将样品置于含15 ml二甲苯替代物与石蜡混合液的容器中，在60 °C烘箱中浸润，较硬组织过夜，较软组织60分钟，顺序如下：二甲苯替代物/石蜡（2:1, v/v）、二甲苯替代物/石蜡（1:1, v/v）、二甲苯替代物/石蜡（1:2, v/v）。</li>
		<li>每天用15 ml纯石蜡浸润样品两次，并在60 °C烘箱中孵育。</li>
		<li>次日重复步骤1.5.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织包埋
	<ol>
		<li>在进行组织包埋前1小时开启组织包埋仪电源，以熔化石蜡储存槽中的石蜡。</li>
		<li>将金属模具（底面尺寸为3.3 cm长 × 2 cm宽）置于62 °C温控托盘上预热，并向模具底部倒入约13 ml熔化石蜡。</li>
		<li>用预热的镊子将步骤1.5.4中的一个组织样品转移至模具中，并调整至所需方向。</li>
		<li>小心将模具移至冷却板上，静置直至石蜡完全凝固。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织切片
<ol>
	<li>石蜡切片法
	<ol>
		<li>通过将包埋盒放置于模具（与1.6.2节中相同尺寸）顶部制备蜡基底，注入熔融石蜡，待石蜡凝固后移除模具。 
		注意：包埋盒将形成石蜡基底，用于固定样本的石蜡包埋块。</li>
		<li>将石蜡包埋块修整至适当形状和大小，取若干石蜡碎片置于平坦的刮刀上。用酒精灯加热刮刀，使石蜡熔化，然后将熔化的石蜡涂于2.1.1节中的石蜡底座上，以固定包埋块。将包埋块夹紧于切片机中。</li>
		<li>将新刀片安装到切片机上，并将角度调整为5度，以利于切片。</li>
		<li>将样品石蜡块切成薄片（10 µm），方法如前所述 11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交切割切片法
	<ol>
		<li>使用剃刀将步骤1.6.4中的石蜡包埋样本修整成适当大小的柱状，顶端呈梯形表面。</li>
		<li>在冷冻切片机载物台上中央位置加入适量最佳切割温度包埋剂（OCT）。将石蜡块固定于冷冻切片机载物台上，迅速将组织块调整至所需位置。</li>
		<li>将石蜡包埋块/载物台转移至冷冻切片机舱内。在-42 °C条件下，使OCT包埋剂在速冻台上固化10分钟。OCT固化期间，切勿移动组织块。图2C).</li>
		<li>将包埋蜡块/载台安装到冷冻切片机适配器之前，先让适配器和切片室温度分别冷却至 -20 °C 和 -16 °C。将组织切成 10 µm 厚的切片。</li>
		<li>用镊子夹取组织切片，将其漂浮于含有800 µl经DEPC处理的水的多孔板中-L-将载玻片转移至42 °C的加热板上。</li>
		<li>在42 °C的DEPC处理水中使切片展平，用滤纸从边缘吸去多余水分。</li>
		<li>将载玻片置于42 °C的加热板上过夜，以使组织贴附于载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 组织染色
<ol>
	<li>脱蜡
	<ol>
		<li>从加热板上取下玻片，放入染色架中。在通风橱内向染色缸中加入150 ml二甲苯，并将染色架浸入二甲苯中5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复水
	<ol>
		<li>用DEPC处理的水配制不同浓度的乙醇溶液（100%、95%、70%、50%和30%），分别向不同的染色缸中加入150 ml溶液。</li>
		<li>将样品依次通过浓度递减的乙醇溶液进行复水，每步在室温下进行3分钟。将染色架中的玻片从一个染色缸转移至另一个含有不同浓度乙醇的染色缸：100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇和30%乙醇。</li>
		<li>复水完成后，将标本浸入ddH2O中3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>苏木精染色
	<ol>
		<li>将组织切片浸入苏木精染液中染色1.5分钟。</li>
		<li>用含1–2滴12 N盐酸（HCl）的ddH2O短暂冲洗数秒，然后用ddH2O快速洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水
	<ol>
		<li>将样品依次通过浓度递增的乙醇溶液脱水，每步在室温下进行3分钟：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。在通风橱中用二甲苯透明处理5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封片
	<ol>
		<li>在玻片上滴加约600 μl以二甲苯为基质的封片剂。小心地将盖玻片覆盖在标本上，避免产生气泡，以获得高质量图像。</li>
		<li>让玻片在空气中过夜干燥。次日用显微镜观察标本。 
		注：根据标本大小，图像在25X至400X放大倍数下采集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 原位 杂交
<ol>
	<li>探针合成
	<ol>
		<li>克隆 蝴蝶兰肌动蛋白 使用引物 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3' 和 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC-3' 扩增基因特异性编码序列（获得 242 bp 的 PCR 扩增产物）并 CyclinB1;1 使用引物5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3'和5'-ATGAGCATGGCGCTAATACC-3'扩增基因特异性编码序列（得到327 bp的PCR扩增产物），方法如前所述 12.</li>
		<li>将特定编码序列连接至载体中（例如， pGEMT）按照制造商的说明书进行操作。</li>
		<li>使用SP6/T7 DIG RNA标记试剂盒，按照制造商说明书制备地高辛（DIG）标记的正义链和反义链探针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原位 杂交
	<ol>
		<li>切取 2nd 和 3rd 使用Hybrid-Cut法获取的腋芽组织切片（厚度10 µm），并将切片置于涂覆载玻片上。</li>
		<li>用二甲苯脱蜡组织切片（见3.1.1），再用梯度递减的乙醇溶液水化（见3.2.2），然后在37 °C下用2 mg/ml蛋白酶K消化30分钟。</li>
		<li>执行 原位 根据先前所述方案进行杂交 11,13 并作了一些修改， 即，杂交温度为 肌动蛋白 59 °C 和 60 °C CyclinB1;1 将载玻片与40 ng DIG标记的RNA探针杂交。</li>
		<li>使用硝基蓝四氮唑盐/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（NBT/BCIP）溶液检测杂交信号，方法如所述。 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

植物细胞具有坚硬的细胞壁、坚韧的纤维、晶体以及高含水量，这些特性在植物组织切片过程中容易导致组织撕裂。尽管石蜡切片法常用于植物组织，但内源性晶体在切片过程中往往会划伤植物组织（图1）。由于植物细胞本身含水量较高，使用冷冻切片机进行切片时常导致细胞破裂和组织切片开裂。
本研究建立了一种结合石蜡包埋与冷冻切片的技术，称为Hybrid-Cut，并成功获得了高质量的组织切片。该技术通过引入石蜡包埋解决了植物组织含水量高带来的问题，并在切片过程中通过低温使石蜡硬化，从而减少了切片撕裂现象（图3）。因此，与单纯的石蜡切片或冷冻切片相比，该改良方案在保持植物组织完整性的方面具有明显优势。
本文稿表明，Hybrid-Cut 方法可在多种组织中保持组织完整性 蝴蝶兰 兰花的腋芽、种子和原球茎（PLB） 等等。 含有高水平晶体的图示 3-4此外，该方案适用于水稻、玉米和小麦等含有高硅的谷类作物的生殖器官和叶片。图5-6）。该方案可能适用于纤维含量较高的木本植物。
通常情况下，充分固定组织对于 Hybrid-Cut 至关重要。我们发现，甲醛-酒精-冰醋酸（FAA）固定液在保持某些难处理组织（如顶芽、根）的组织完整性方面优于多聚甲醛（PFA）。 等等。 然而，PFA 在保持 RNA 完整性方面优于 FAA，因此建议使用 PFA 固定样本 原位 杂交（ISH）实验。此处描述的方案专为RNA原位杂交实验设计，因此所有试剂均经过DEPC处理以消除RNase污染，防止RNA降解。如果Hybrid-Cut切片用于解剖学研究，可使用常规的反渗透（RO）水及其配制的缓冲液或试剂。
将样本尺寸和厚度减小至3 mm以下有助于包埋渗透。此外，对于质地较硬的组织，需要延长脱水和渗透的浸渍时间。本方案的局限性可能源于样本固定、脱水或渗透不充分所导致的问题。因此，调整每一步骤的处理时间对于制备高质量的石蜡包埋块至关重要。通常情况下，质地越硬的组织所需的处理时间越长。
此外，我们证明了Hybrid-Cut与ISH联用可成功实现目标转录本的空间分布分析（图7综上所述，本实验方案适用于植物解剖学研究，并可提供所选基因的组织特异性RNA表达图谱。此外，该方法还可应用于其他分子生物学研究，如末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测、荧光标记 原位 杂交 (FISH）和免疫染色技术。总之，这一改进的组织切片方案对植物学研究领域的科研人员具有重要的实用价值和帮助。

石蜡包埋切片法是一种广泛用于解剖学研究的技术。完整组织结构的保存对于形态学和生物学研究至关重要。石蜡包埋切片技术具有优势，因为石蜡包埋能够很好地保持细胞和组织的形态。此外，石蜡块可方便地长期储存。然而，石蜡包埋切片不适用于含有细胞内晶体的植物组织。细胞内的晶体在切片过程中常常会撕裂石蜡带，破坏组织完整性。
与石蜡切片相比，冷冻切片速度相对较快，且无需固定、连续脱水或包埋介质渗透即可获得切片 1冷冻切片适用于多种应用，如免疫组织化学， 原位 杂交和酶组织化学。冷冻切片的另一个优点是，该方法无需经过高温和化学处理等可能导致变性的步骤，因此组织切片中的细胞分子得以良好保存。 2冷冻切片通常比石蜡切片更适用于动物组织研究。然而，在植物组织中，冷冻切片并非首选方法，因为冷冻温度有时会导致冰晶形成，从而影响切片完整性。尽管可通过渗透调节手段，如蔗糖溶液、聚乙二醇（PEG）或甘油处理 3 据报道可在冷冻条件下减少冰晶形成，但改善效果尚不理想。
为了适应不同的环境，不同植物通常具有独特的组织质地，植物细胞也进化出坚硬的细胞壁、坚韧的纤维和晶体4,5。例如，不溶性草酸钙晶体和硅质体在植物中较为常见6。已有研究报道，硅质体/晶体有助于维持禾本科植物的植株结构、直立性，并防止病害或虫害7-9。
盆栽兰花和切花兰花市场蓬勃发展，已成为一个不断增长的产业。 蝴蝶兰（Phalaenopsis aphrodite） （蝴蝶兰）是中国台湾最重要的出口观赏植物之一。为深入了解其开花过程中的形态和生理变化，已开展了大量研究工作。 蝴蝶兰 兰花。花序梗的 蝴蝶兰 兰花从叶基部的腋芽开始发育。在经历一段低温环境（约一个半月）后，腋芽膨大，打破休眠，并从叶基部突出，发育成幼嫩的花序。为了理解花序启动过程中的生理、细胞和分子机制，必须建立一种可靠的解剖学技术，以便及时观察组织或标记物。然而，由于兰花组织中普遍存在晶体，尤其是在腋芽中，这给解剖学研究带来了困难。
本研究旨在改进以往被认为在技术上具有挑战性的顽拗型植物组织的切片完整性。本文展示了一种名为 Hybrid-Cut 的改进方案。该方法是一种基于石蜡的切片技术，使用冷冻切片机进行操作。石蜡包埋可有效解决植物组织含水量高的问题。在低温条件下切片可使石蜡块硬化，减少晶体撕裂现象，显著提高组织完整性。该方案显著改善了顽拗型植物样品的组织完整性。

<table><tbody><tr><td>包埋中心模型 EC780-1</td><td>CSA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机模型 RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机模型 CM 1950</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Scope A1 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含维生素的 Murashige &amp; Skoog 培养基</td><td>Duchefa Biochemia</td><td>M0222.0050</td><td></td></tr><tr><td>无RNase表面去污剂</td><td>Apex</td><td>10-228</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Bio Basic Inc.&amp;nbsp;</td><td>D801154</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾晶体（KCl）</td><td>J.T. Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Showa</td><td>19430160</td><td></td></tr><tr><td>硫酸（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯20山梨醇单月桂酸酯（Tween 20）</td><td>J.T. Baker</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>辛基酚聚氧乙烯醚（Triton X100）</td><td>J.T. Baker</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>玻璃闪烁瓶</td><td>Newastar</td><td>DG60805-00020</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Violet Bioscience Inc.</td><td>TS-402030</td><td></td></tr><tr><td>旋片式真空泵 RZ2.5</td><td>Vacuubrand</td><td>36149406</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>J.T. Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Sub-X&amp;nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>3803670</td><td>二甲苯替代物</td></tr><tr><td>Paraplast Plus&amp;nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>39602004</td><td>组织包埋石蜡</td></tr><tr><td>SUPERFROST 显微载玻片</td><td>Matsunami</td><td>S7441</td><td></td></tr><tr><td>FSC 22 Clear&amp;nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>3801480</td><td>最佳切割温度化合物（OCT）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>纯化二甲苯</td><td>Leica Surgipath</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Merck</td><td>HX305311</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Micromount</td><td>Leica Surgipath</td><td>3801731</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>pGEM T-easy 载体</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>SP6/T7 DIG RNA标记试剂盒</td><td>Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP 储存液</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrid-cut：一种改进的难处理植物组织样本切片方法

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

保持植物切片的完整性对于在细胞、组织甚至器官水平上研究详细的解剖结构至关重要。然而，某些植物细胞具有坚硬的细胞壁、坚韧的纤维和晶体 草酸钙，二氧化硅 等等。），以及高含水量，这在植物组织切片过程中常常会破坏组织完整性。
本研究建立了一种简便的杂交切片（Hybrid-Cut）组织切片方法。该方案改良了基于石蜡的切片技术，显著提高了来自不同植物组织切片的完整性。植物组织在切片前先包埋于石蜡中，并在-16 °C的冷冻切片机中进行切片。低温条件下切片可硬化石蜡块，减少撕裂和划伤，从而显著改善组织完整性。该方法已成功应用于富含草酸钙晶体的蝴蝶兰（Phalaenopsis）组织，以及水稻、玉米和小麦等植物难以处理的生殖器官和叶片组织。此外，杂交切片法获得的高质量组织切片可与原位杂交（in situ hybridization, ISH）技术联用，用于揭示目标基因的空间表达模式。综上所述，该方案特别适用于含有高含量晶体或二氧化硅的难处理植物组织。高质量的组织切片有助于开展形态学及其他生物学研究。

Hybrid-Cut 可提高组织切片的完整性
了解兰花生殖花器官的解剖结构对于研究其花器官起始的潜在机制具有重要意义。然而，Phalaenopsis 兰花细胞内草酸钙晶体的积累使得此类研究极具挑战性。为避免切片过程中因晶体导致组织撕裂的问题（图1），我们开发了一种名为Hybrid-Cut的技术体系。该方案结合了传统的石蜡包埋与冷冻切片技术。我们首先在Phalaenopsis 兰花的腋芽中测试了Hybrid-Cut，因为其组织硬度高且晶体含量丰富，历来难以处理。腋芽组织使用4% PFA固定（见实验方案，步骤1.3）。经梯度乙醇脱水和石蜡渗透后，将腋芽包埋于石蜡块中。切片前将石蜡块修整至合适大小（图2A）。随后在冷冻切片机载物台中央加入少量OCT包埋剂（图2B），再将石蜡块通过OCT粘附于载物台上。将载物台置于冷冻切片机中孵育10分钟，使OCT完全凝固后进行切片（图2C），随后在-16 °C的环境中进行冷冻切片（图2D）。
作为对照，对含有蝴蝶兰Phalaenopsis腋芽的石蜡包埋块进行常规切片机切片。如图1A所示，切片后石蜡带出现严重撕裂现象，组织完整性和细胞结构也受到破坏（图1B）。而Hybrid-Cut方法则获得了完整的组织切片（图3A），且组织结构完整性得以保留（图3B）。
杂交切割法在 P. aphrodite 多种组织中的应用
为了进一步验证 Hybrid-Cut 方法的适用性，我们测试了蝴蝶兰（Phalaenopsis）兰科植物的不同组织。由于种子种皮硬化，通常难以获得组织完整性良好的种子切片。采用本方案后，种子的精细结构在切片后得以良好保留（图 4A）。如图 4A所示，常见的储存产物——蛋白体14，可被清晰识别。Hybrid-Cut 方法在一个月大的原球茎（由种子萌发形成的结构）的茎尖分生组织（图 4B）以及原球茎样体（PLBs，图 4C）中也成功应用，并展示了其精细结构。在 PLB 的切片中观察到细胞内晶体。蝴蝶兰（Phalaenopsis）具有厚而多汁的叶片，并进行景天酸代谢（Crassulacean acid metabolism, CAM）型光合作用15。叶片横切面显示，其含有较大的叶肉细胞以及包含木质部和韧皮部的维管束（图 4D）。在白天，叶片远轴面仅观察到少量气孔开口（图 4D）。事实上，CAM 植物在干旱条件下通过夜间开放气孔以最大化碳固定，同时最小化水分流失15,16。P. aphrodite 的根尖分生组织如图 4E所示。根尖细胞似乎含有大量晶体，且切片后晶体结构保存完好（图 4E）。幼嫩花序的纵切面提供了关于幼嫩花原基结构的信息（图 4F）。此外，在已完成分化的 5 mm 花蕾的纵切面中，可清晰识别萼片、花瓣、唇瓣和花粉块（图 4G）。值得注意的是，晶体在幼嫩花蕾的萼片中积累。总之，该方案能持续有效地维持组织完整性，获得完整的形态结构，适用于解剖学及潜在的细胞学研究。
杂交切割法在谷类作物中保持组织完整性
我们还在含有高硅含量的谷类作物（如水稻、小麦和玉米）上测试了 Hybrid-Cut 方法17,18。如图5所示，采用 Hybrid-Cut 方法后，水稻、小麦和玉米叶片横切面的组织完整性显著改善。水稻叶片切片中可清晰识别出木质部、韧皮部、叶肉细胞、气孔以及控制叶片卷曲以减少水分流失的泡状细胞。玉米叶片的花环结构（Kranz anatomy）、叶肉细胞和维管束19,20也清晰可辨。值得注意的是，玉米叶片的近轴面和远轴面均表现出高密度的气孔分布（图5）。此前已有报道指出，玉米叶片近轴面与远轴面气孔数量之比为0.721。此外，本方案还成功获得了水稻、小麦和玉米小穗的详细细胞形态（图6）。已知小穗中含有丰富的二氧化硅9，通常会导致组织切片困难。
原位 杂交
基因组学和转录组学方法常用于注释基因功能。在发育或环境背景下提供目的基因转录本的空间分布信息，有助于深入理解这些基因的潜在功能。 原位 原位杂交（ISH）已用于在组织水平上定位基因表达模式 11,22-25此外，原位杂交（ISH）可在多细胞生物中提供mRNA分布的细胞水平，甚至在某些情况下达到亚细胞水平的分辨率。 26在原位杂交（ISH）过程中，RNA和组织完整性对于获得所选转录本的可靠空间信息至关重要。我们采用Hybrid-Cut方案进行了ISH检测。 肌动蛋白 基因（PATC157348）使用引物 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3' 和 5'-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC-3' 进行克隆，获得 242 bp 的 PCR 扩增片段。 细胞周期蛋白 B1:1 (PATC146999) 基因特异性编码序列，使用引物 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3' 和 5'-ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' 扩增获得 327 bp 的 PCR 产物。ISH 后 肌动蛋白 和 细胞周期蛋白 B1:1 基因表达 在幼嫩和成熟的腋芽中进行了监测 (图7). 两个基因均在分生组织细胞中表达 2 的nd 和 3rd 腋芽，其中在3中检测到更强的信号rd 腋芽。这些结果表明，Hybrid-Cut 能够保持良好的解剖结构，并提供空间基因表达模式。
<img alt="切片过程；组织切片仪器与组织学组织结构对比。" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1： 传统石蜡切片导致组织严重撕裂。 含有蝴蝶兰（Phalaenopsis）腋芽的石蜡包埋块接受了常规切片机切片。传统切片机切片后，观察到石蜡带出现严重撕裂 （A）。组织完整性和细胞结构也受到破坏 （B）。箭头显示组织切片的严重撕裂部位，箭头指示晶体结构。比例尺为 100 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="聚合物复合样品制备与分析；包括粘合剂应用、安装、光学设置。" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 杂交切片法。 腋芽组织经PFA固定后，进行脱水、石蜡渗透并包埋于石蜡块中。将石蜡块修整至适当大小 (A)。将最佳切割温度化合物（OCT）涂抹于冷冻切片机载台中央 (B)。将石蜡块粘附至冷冻切片机载台上的OCT上。在低温条件下，石蜡块通过OCT固定于冷冻切片机载台上 (C)。在-16 °C条件下于冷冻切片机腔室内进行组织切片 (D)。比例尺表示0.5 cm (A) 和1 cm (B-D)。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="切片机切片（A）与植物组织示意图（B）；样品制备，显微镜分析" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： Hybrid-Cut 提高切片完整性。 含有腋芽的石蜡包埋块 蝴蝶兰 兰花 underwent Hybrid-Cut 切片处理 （A） Hybrid-Cut 法获得的切片具有良好的组织完整性 (B)箭头所示为嵌在腋芽组织中的内源晶体结构。比例尺 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的植物组织切片，横截面示意图突出显示维管束和叶肉。" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4： 杂交切割技术在多种组织切片中的应用 蝴蝶兰 兰花 不同兰花 采用杂交切割法对组织进行切片，例如成熟阶段的兰花种子纵切面 （A），原球茎纵切面 (B)，原球茎状体（PLB）的纵切面 (C)，叶片横切面 (D)，根的纵切面 (E)，幼嫩花序的纵切面 (F)以及幼嫩花蕾的纵切面 (G)组织切片经苏木精染色。SC，种皮；PB，蛋白体；M，分生组织；MP，母体原球茎；DP，子代原球茎；Ad，近轴叶面；Ab，远轴叶面；St，气孔；MC，叶肉细胞；VB，维管束；RC，根冠；fb，花蕾；Se，萼片；Pe，花瓣；La，唇瓣；Po，花粉块；Ro，蕊柱；Ca，胼胝体。箭头示晶体。比例尺表示 20 µm （A-E）以及 200 µm （F-G）。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="通过石蜡法与杂交切片法显示水稻、小麦、玉米的薄壁组织细胞横截面示意图" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：杂交切片法在多种谷类作物中保持叶片组织完整性。 使用传统石蜡法（左图）与本研究开发的杂交切片法（右图）对叶片组织进行比较。图像显示水稻、小麦和玉米的叶片横截面。MC，叶肉细胞；Ph，韧皮部；St，气孔；BC，泡状细胞。箭头指示组织切片撕裂处。箭头指示硅质体。蓝色虚线圆圈标示C4植物玉米的花环结构。比例尺为 20 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="水稻、小麦、玉米组织在石蜡包埋和杂交切片中的组织学比较；显微分析。" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6： Hybrid-Cut 法在多种谷类作物中保持小穗组织完整性。 传统石蜡切片法与 Hybrid-Cut 法在小穗组织切片完整性上的比较。箭头显示组织切片撕裂处，箭头头指示硅质体。比例尺为 20 µm（水稻）和 200 µm（小麦和玉米）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示肌动蛋白（Actin）和细胞周期蛋白B1;1（Cyclin B1;1）基因表达的腋芽组织切片，显微分析。" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7： 原位 杂交 肌动蛋白 和 CyclinB1;1 腋芽中的表达模式 蝴蝶兰 兰花 2 的组织切片nd 腋芽和3rd 使用杂交切割法（Hybrid-Cut method）制备腋芽。共使用40 ng的 肌动蛋白 和 CyclinB1;1 使用地高辛标记的探针进行杂交，正义探针作为阴性对照。箭头指示腋芽生殖分生组织。比例尺 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54754/54754fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种简单的杂交切片（Hybrid-Cut）组织切片方法，适用于难以处理的植物组织。高质量的组织切片可用于解剖学研究及其他生物学研究，包括原位杂交（in situ hybridization, ISH）。

Hybrid-Cut：一种改进的难处理植物组织样本切片方法

保持植物切片的完整性对于在细胞、组织甚至器官水平上研究详细的解剖结构至关重要。然而，某些……

杂交切片法的总体目标是提高难切植物组织的切片完整性，特别是那些含有坚韧纤维和硅晶体的组织，从而制备出适用于解剖学和生物学研究的合适组织样本。含有高水平晶体和二氧化硅的植物在切片过程中容易出现严重的石蜡撕裂问题。该方法显著改善了组织的完整性。该技术的主要优势在于，冷冻切片机中超低温条件下的切片过程可使石蜡包埋块硬化，从而显著减少晶体剪切问题。该技术的应用可扩展至原位杂交、荧光原位杂交（FISH）以及内部检测等多个领域。由于确保石蜡包埋块牢固粘附于载片上的操作步骤较难掌握，因此对该方法进行可视化演示至关重要。首先，选取处于五叶期的成熟蝴蝶兰植株。沿中脉小心撕去叶片。使用锋利的解剖刀，从单轴生长系统的第三或第四片叶基部仔细取出腋芽。立即将样品放入含有15毫升冰上预冷的PFA固定液的玻璃闪烁瓶中。在4°C条件下，对固定液中的样品施加真空处理15至20分钟。样品中将释放出微小气泡。重复此步骤，直至大多数样品在释放真空后下沉。最后，保持真空过夜，次日缓慢释放真空。随后，将固定后的样品浸入15毫升PBS中，置于冰上15分钟。将样品依次置于浓度递增的15毫升乙醇中进行脱水处理：30%、50%、70%、85%、95%，最后为100%。随后在室温下，用15毫升体积比为2:1的乙醇与二甲苯替代物混合液对样品进行浸透。继续依次将样品放入以下每种试剂各15毫升中进行后续浸透处理。体积比为1:1的乙醇与二甲苯替代物混合液，体积比为1:2的乙醇与二甲苯替代物混合液，最后使用纯的二甲苯替代物。随后将组织置于60摄氏度的烘箱中孵育。在60摄氏度条件下，用15毫升二甲苯替代物与石蜡的混合液对样品进行浸透处理。最后，在60摄氏度下，用15毫米纯石蜡浸透两次，每次12小时。次日重复此步骤。开始包埋前，先将金属模具预热至62摄氏度，然后向模具底部倒入约13毫升熔化石蜡。用预热的镊子将组织样本转移至模具中，并调整至所需位置。小心地将模具移至冷却板上，静置直至石蜡完全凝固。随后，使用刀片将石蜡包埋块修整成适当大小的柱状，顶部修成梯形表面。向冷冻切片机载物台中央加入 800 微升的包埋剂（OCT 化合物）。将石蜡块放置在载物台上，并迅速将组织块调整至所需位置。将石蜡块和载物台转移至冷冻切片机腔室中。将OCT在零下42摄氏度下快速冷冻10分钟。接着，将冷冻切片机适配器和腔室温度分别冷却至零下20摄氏度和零下16摄氏度。将样本块和载物台固定到冷冻切片机适配器上。现在将组织切成10微米厚的切片。用镊子夹取组织切片，将其放置于经多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，使其漂浮在800微升经DEPC处理的水中。将载玻片转移至设定为42摄氏度的加热板上。让切片展平，并用滤纸吸去边缘的水分。将样本置于42摄氏度的加热板上过夜，使组织牢固附着于载玻片上。为脱蜡样本，首先将已固定的组织切片放入染色架中。向染色缸中加入150毫升二甲苯，将载玻片架浸入其中5分钟。接着，将样本依次放入浓度递减的乙醇溶液中进行再水化，每次150毫升，室温下处理3分钟。最后，将样本浸入双蒸水中3分钟。将切片置于150毫升苏木精染液中染色1.5分钟。用含有1至2滴N盐酸的150毫升重蒸水中冲洗数秒，然后用重蒸水短暂洗涤切片。再使用一系列150毫升浓度递增的乙醇溶液，在室温下处理3分钟，对样本进行脱水。将样本浸入150毫升二甲苯中，持续5分钟。最后，通过在每张载玻片上轻轻加入600微升以二甲苯为基质的封片剂，然后在样本上覆盖盖玻片，完成封片。利用该方法，成功制备了蝴蝶兰组织切片，包括通常难以切片的、含有高水平晶体的腋芽。详细结构得以保留，可清晰观察到蛋白质体。杂交切片法还可实现对萌发种子茎尖分生组织的清晰切片观察。这些图像展示了利用传统石蜡切片法与杂交切片法对水稻和小麦植株叶片进行横切制备的过程。这些作物通常含有较高水平的二氧化硅，使其切片较为困难。杂交切割切片中的组织完整性显著改善，关键结构在石蜡切片中常出现扭曲或难以找到，而在杂交切割组织中则被完整保留。此外，撕裂现象仅在石蜡切片样本中观察到。此外，由于杂交切片技术能很好地保留组织解剖结构，因此适用于空间基因表达模式的研究。本文对蝴蝶兰第二和第三腋芽的杂交切片进行了肌动蛋白（Actin）和细胞周期蛋白B1:1（Cyclin B1:1）的原位杂交实验。改进后的组织解剖结构保存效果使得在第三腋芽发育中的分生组织细胞中检测到目标基因更高的表达水平。在进行该操作时，需保持零下16摄氏度的温度，以使石蜡块充分硬化，从而获得高质量的组织切片。我们最初提出该方法，是在多次尝试使用传统的石蜡切片或冰冻切片法对兰花组织进行切片失败后。 通过此操作流程，可进一步开展原位杂交和荧光原位杂交（FISH）等实验，以回答更多科学问题，包括基因空间定位与功能的研究。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对难处理的植物样品进行高质量的组织切片。

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本方案旨在利用扫描电子显微镜（SEM）对组织中特定细胞进行纳米级分辨率的成像。首先在光学显微镜下对来自树脂包埋生物样品的大量连续切片进行成像，以识别目标区域，随后以逐级放大的方式在扫描电子显微镜中进行成像。...

大体积样本中连续切片的多模态分层成像以定位特定细胞靶标

本文介绍了一种改进的石蜡切片技术。该方法结合了切片与漂片过程，使用一个简单的恒温舱，避免了传统方法中所需的转移步骤。结果显著提高了石蜡切片的效率和完整切片的数量。...

石蜡包埋组织切片的切割与漂浮法

我们采用地质学（钻孔）取样方法，从人类股骨前侧获取用于同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT）实验的、尺寸均一的皮质骨样本。该方法具有破坏性小、效率高的特点，所获得的圆柱形样本可最大限度减少因样本形状不规则导致的成像伪影，从而改善骨微结构的可视化效果与分析质量。...

高通量皮质骨样本制备与同步辐射显微CT分析的切片、取芯及图像处理指南

本文介绍了一种植物组织激光显微切割（LCM）的实验方案。LCM是一种用于无污染地分离特定组织区域的显微技术。该操作流程包括组织固定、石蜡包埋、切片、激光显微切割以及RNA提取。所获得的RNA可用于后续组织特异性、时间分辨的转录组分析。...

激光捕获显微切割结合RNA测序用于植物时空特异性组织基因表达分析

该技术可快速、简便地制备整粒种子大小的树脂切片，用于观察和分析种子不同区域的细胞、淀粉粒和蛋白体。...

一种简易的干切法获取整粒种子大小的树脂切片及其应用

采用自动组织切割的数字注释为低肿瘤含量样本中富集肿瘤细胞提供了创新性方法，且适用于石蜡和冷冻两种组织类型。所述工作流程可提高准确性、可重复性和通量，可广泛应用于科研和临床环境。...

低肿瘤含量组织中肿瘤富集的自动化解剖方案

本方案介绍了一种提高甲醛固定石蜡包埋组织样本中肿瘤含量百分比的方法。...

通过肿瘤大体解剖富集肿瘤成分

本实验方案旨在提供收集、固定和保存菌异养植物样品的详细步骤，并应用多种显微技术（如扫描电镜、透射电镜、光学显微镜、共聚焦显微镜和荧光显微镜），以研究菌根真菌在植物组织及经菌根真菌接种萌发的种子中的定殖情况。...

用于解读菌根异养植物组织中真菌定植及种子共生萌发的显微技术

评估C3和C4植物叶片横切面之间的解剖学差异有助于理解光合作用效率。本文介绍了小麦（Triticum aestivum）和玉米（Zea...

评估利用徒手切片和半薄切片技术对小麦（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）中C3与C4光合作用差异的结构特征

了解混合式切割技术，用于改善含硅质晶体和坚韧纤维的顽拗植物组织的切片完整性。该方法通过低温硬化石蜡块，减少晶体剪切问题，适用于原位杂交和FISH等研究。

Hybrid-Cut：一种改进的难处理植物组织样本切片方法

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