Hybrid-Cut：一种改进的难处理植物组织样本切片方法

杂交切片法的总体目标是提高难切植物组织的切片完整性，特别是那些含有坚韧纤维和硅晶体的组织，从而制备出适用于解剖学和生物学研究的合适组织样本。含有高水平晶体和二氧化硅的植物在切片过程中容易出现严重的石蜡撕裂问题。该方法显著改善了组织的完整性。

该技术的主要优势在于，冷冻切片机中的超低温切片可使石蜡包埋块硬化，显著减少晶体剪切问题。该技术的应用可扩展至原位杂交、荧光原位杂交（FISH）以及内部检测等多个领域。由于确保石蜡包埋块牢固粘附于载片上的操作步骤较难掌握，因此对该方法进行可视化演示至关重要。

首先，选取处于五叶期的成熟蝴蝶兰植株。沿中脉小心撕去叶片。使用锋利的解剖刀，从单轴生长系统的第三或第四片叶基部仔细取出腋芽。

立即将样品放入含有15毫升冰上预冷的PFA固定液的玻璃闪烁瓶中。在4°C条件下，对固定液中的样品施加真空处理15至20分钟。样品中会释放出小气泡。

重复此步骤，直至大多数样品在解除真空后能够下沉。最后，保持真空过夜，并于次日缓慢释放真空。接着，将固定的样品浸入15毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于冰上15分钟。

将样品依次用15毫升浓度递增的乙醇进行脱水处理：30%、50%、70%、85%、95%，最后用100%乙醇。在室温下，用15毫升体积比为2:1的乙醇与二甲苯替代物混合液对样品进行浸透。随后，将样品依次放入以下每种试剂各15毫升中，继续完成浸透过程。

按一体积对一体积的比例混合乙醇与二甲苯替代物，按一体积对两体积的比例混合乙醇与二甲苯替代物，最后使用纯的二甲苯替代物。随后将组织置于60摄氏度的烘箱中孵育。在60摄氏度条件下，用15毫升二甲苯替代物与石蜡的混合液对样品进行浸润。

最后，在60摄氏度下，用15毫米纯石蜡浸透两次，每次12小时。次日重复此步骤。开始包埋前，先将金属模具预热至62摄氏度，然后向模具底部倒入约13毫升熔融石蜡。

用预热的镊子将组织样本转移至模具中，并调整至所需位置。小心地将模具移至冷却板上，静置直至石蜡完全凝固。随后，使用剃刀刀片将石蜡包埋块修整成适当大小的柱状，顶部呈梯形表面。

向冷冻切片机载物台中央加入 800 微升的包埋剂（OCT 化合物）。将石蜡块放置在载物台上，并迅速将组织块调整至所需位置。将石蜡块和载物台转移至冷冻切片机冷室中。

将OCT在零下42摄氏度下快速冷冻10分钟。接着，将冷冻切片机适配器和腔室温度分别冷却至零下20摄氏度和零下16摄氏度。将样本块和载物台固定到冷冻切片机适配器上。

现在将组织切成10微米厚度。用镊子夹起组织切片，将其放置于经多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上800微升经DEPC处理的水中，使其漂浮。将载玻片转移至设定为42摄氏度的加热板上。

让切片展平，并用滤纸吸去边缘的水分。将样本置于42摄氏度的加热板上过夜，使组织牢固贴附于载玻片上。为脱蜡样本，首先将贴附有组织的载玻片放入染色架中。

向染色缸中加入150毫升二甲苯，将载玻片架浸入其中5分钟。接着，将载玻片依次放入浓度递减的乙醇溶液中进行再水化，每种浓度乙醇溶液各150毫升，室温下每次浸泡3分钟。最后，将标本浸入双蒸水中3分钟。

将切片置于150毫升苏木精染液中染色1.5分钟。用含1至2滴N盐酸的150毫升重蒸水冲洗数秒，然后用重蒸水短暂洗涤切片。再使用一系列150毫升浓度递增的乙醇溶液，在室温下处理3分钟，对样本进行脱水。

将标本浸入150毫升二甲苯中5分钟。最后，通过在每张载玻片上轻轻加入600微升以二甲苯为基质的封片剂，然后在标本上覆盖盖玻片，完成封片。利用该方法，成功制备了蝴蝶兰组织切片，包括通常难以切片的含有高水平晶体的腋芽。

精细结构得以保留，可清晰观察到蛋白质体。杂交切法还实现了对萌发种子茎尖分生组织的清晰切片观察。这些图像展示了利用传统石蜡切片法与杂交切片法对水稻和小麦植株叶片进行横切制备的过程。

这些作物通常含有较高水平的二氧化硅，使其切片较为困难。杂交切片中的组织完整性显著改善，一些在石蜡切片中常发生扭曲或难以辨认的关键结构，在杂交切片组织中得以完整保存。此外，撕裂现象仅出现在石蜡切片样本中。

此外，由于解剖结构的强保留性，杂交切片组织适用于空间基因表达模式的研究。本研究中，对蝴蝶兰第二和第三腋芽的杂交切片进行了肌动蛋白（Actin）和细胞周期蛋白B1:1（Cyclin B1:1）的原位杂交实验。改进后的解剖结构保存效果使得在第三腋芽发育中的分生组织细胞中检测到目标基因更高的表达水平。

在进行该操作时，需保持零下16摄氏度的温度，以使石蜡块充分硬化，从而获得高质量的组织切片。我们最初提出该方法的构想，是在多次尝试使用传统的石蜡切片或冰冻切片法对兰花组织进行切片失败之后。

通过该实验流程，可以开展原位杂交和荧光原位杂交（FISH）等后续实验，以回答更多科学问题，包括基因空间定位及其功能研究。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对难处理的植物样品进行高质量的组织切片。