利用荧光相关光谱法测定原代淋巴细胞质膜中的分子扩散

本实验方案的总体目标是利用荧光相关光谱法测定标记蛋白在原代免疫细胞膜中的扩散速率。该方法有助于解答免疫学和细胞生物学领域的一些关键问题，例如识别具有更活跃膜受体动力学的自然杀伤细胞。该技术的主要优势在于其适用于活细胞，因此能够真实反映分子在天然状态下的运动情况。

如果将不同自然杀伤细胞的特性（例如分子扩散）与其功能相关联，从而更准确地预测其效率，则该技术的应用前景可拓展至癌症免疫治疗领域。尽管该方法可为免疫细胞中的分子运动提供洞察，但也可应用于任何学科中的其他原代细胞和细胞系。以专家模式打开软件，并选择“扫描新图像”选项。

在共聚焦激光扫描显微镜上选择40倍水镜。在“采集”选项卡下，按下“配置”和“扫描”按钮，以打开配置控制和扫描控制界面。在ConfoCor选项卡下，按下“测量”以打开测量窗口。

接下来，创建一个文件夹以保存FCS测量数据。在“文件”选项卡下点击“新建”以创建一个新的图像数据库。打开卤素灯。

使用激光按钮，开启用于激发荧光染料的相关激光器。然后在配置控制窗口中设定图像采集的参数，包括激发激光、激发和发射滤光片、光路以及所使用的探测器。

类似地，进入测量窗口，在系统配置选项卡下调整FCS设置。通过切换Ch 1启用绿色通道，切换Ch 2启用红色通道，以激活FCS记录的检测通道。在激光器稳定过程中（可能需要长达30分钟），调整针孔。

首先，将 50 微升染料液滴置于经多聚-L-赖氨酸包被的八孔腔室盖玻片的一个孔中央。相邻的孔用于进行细胞测量，因为校准依赖于具体载玻片。在 40 倍水镜镜头上滴加一滴蒸馏水，并放置载玻片。

然后按 Vis 以选择可见光源，并聚焦于荧光团液滴的中心位置。在软件的“Measurement”窗口中，选择“Acquisition”选项卡，然后在“Positions”下切换当前位置。接着返回同一窗口中的“System Configuration”选项卡，并为绿色激光器设置高功率或饱和功率。

为了测试信号的稳定性，按下“开始”按钮以打开一个新窗口，显示时间轨迹和自相关曲线。检查荧光信号是否强且稳定，并确认 y 轴显示的波动在千赫兹范围内。较低的数值可能是由于聚焦不准确或染料降解所致。

接下来，在测量窗口中选择 O 调整按钮。然后选择正确的检测通道并点击自动调整 X。如果所得曲线的上限缺失或未居中，请勾选粗调选项，再次点击自动调整 X。在完成 X 方向的调整后，通过点击自动调整 Y 对 Y 方向进行相同操作。取消勾选粗调选项，交替点击自动调整 X 和 Y，直至 X 与 Y 方向均呈现清晰的峰值和稳定的数值。

如果使用两种不同的荧光染料标记细胞，向相邻的腔室中加入一滴红色荧光染料溶液，然后校准第二个通道。将红色激光设置为高功率，并重复稳定性校准程序。

接下来，我们测量自由扩散的荧光分子通过焦点的停留时间。然后利用物镜台来计算位于焦点内的细胞膜面积。开始时，通过仔细执行调节步骤，将焦点对准一滴溶液。

然后转到测量窗口中的“采集”选项卡，将采集时间设置为30秒，重复三次。将激光功率设置为接近饱和，然后按“开始”进行测量。测量完成后，记录每分子计数（CPM）。

然后在逐步降低激光功率的情况下进行新的测量，进行迭代式调整。在此功率范围内，应包含即将进行的细胞测量所预期的功率值。接下来检查CPM值是否随激光功率呈线性变化。

如果量程的其余部分呈线性，则最高功率下的饱和是可接受的。首次使用新偶联的荧光抗体时，应进行游离扩散抗体的FCS测量，以量化预期的CPM值。并且重要的是，应使用涂覆有PEG聚-L-赖氨酸的孔板来处理游离抗体。

进行此操作时，用 200 微升聚乙二醇修饰的多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine grafted to polyethylene glycol）包被玻片腔室，在室温下孵育 1 小时。储备液可在冰箱中保存最多两周。

粉末储备液应保存在冷冻柜中。随后，移除液体并使腔室自然风干。在显微镜下，将抗体用 PBS 稀释至每毫升含 1 至 10 微克。

按照之前测定游离荧光团的方法，继续测定游离抗体的通过时间。在细胞中进行测定时，从抗体标记的细胞悬液中加入125微升含1%FCS的PBS细胞悬液，以及150微升透明的Roswell Park Memorial Institute 1640培养基至PLL包被玻片的空孔中。

在继续操作前，将细胞置于检测温度下避光孵育至少20分钟，以使细胞充分贴壁并达到平衡状态。开始成像时，先进行快速的XY扫描，以确定观察细胞所需的最低激光功率。然后将图像中心对准一个亮度适中、细胞膜轮廓清晰的圆形细胞。

细胞质中不得存在荧光信号。放大至细胞占据图像大部分区域，然后聚焦于细胞膜顶部。

从细胞中心开始向上移动，直到图像中心显示一个荧光均匀的小圆形区域。准确的聚焦位置至关重要。如果焦点未对准细胞膜，所检测到的荧光将不会来自荧光标记的膜受体。

因此，结果将无法反映其真实行为。现在，在“测量”窗口的“采集”选项卡下，通过激活十字准线选择进行FCS测量的位置。然后将重复次数设置为6到10次，每次测量时间设置为10秒。

现在返回到“测量”窗口的系统配置选项卡，将FCS测量的激光功率降低至1至10微瓦之间。然后点击“开始”。如果在前10秒内荧光强度下降超过30%，则表明细胞已被过度漂白，必须选择另一个细胞并在更低的功率下进行测量。

如果信号丢失，请调整Z方向的焦距并重新开始测量。测量完成后，在扫描控制窗口中检查细胞是否仍处于中心位置，以确认其膜已被测量。如果细胞发生移动，则舍弃该数据。

现在转到自相关窗口，手动删除包含缩放操作、漂白、大簇或其他伪影的单个重复数据。使用右键单击并选择“删除”以移除伪影。准确识别实际伪影需要一定经验。

去除重复项是一个简单的过程，但需要正确评估重复项，以确定哪些应被去除，哪些不应去除。然后将最终文件保存为FCS格式。在去除异常值后，仅保留至少含有四个重复项的细胞用于进一步分析。

典型的膜受体自相关曲线平滑，其穿越时间范围为10至400毫秒。设置拟合区间时，应包含代表扩散过程的最陡斜率部分的起始点和终点。采用二维自由扩散模型对数据进行拟合时，需重点关注曲线上斜率最陡的部分。

在残差中观察到的、在 tau 尺度上接近或约为一秒的微小波动是可以接受的。如果曲线拟合效果不佳，但细胞本身无明显问题（例如移动、漂白或聚集），则可能需要调整模型的初始值或参数的上下限。当模型与自相关曲线良好拟合后，提取变量参数的数值。

内源性表达蛋白每平方微米所含分子数可在0.5至约200之间。请确认细胞测量所得的CPM值至少达到游离扩散抗体所记录值的33%。观看本视频后，您应能充分理解如何利用荧光相关光谱技术测量蛋白质的扩散速率。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在五到六小时内完成。在进行该实验过程中，重要的是将细胞保持在冰上，直至测量开始前约20分钟。任何样品的测量均不得超过两小时。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如成像）来回答更多问题，例如扩散速率与某种特定蛋白质表达水平之间的相关性。该技术一经建立，便为分子生物学和免疫学领域的研究人员探索活细胞中蛋白质动态变化提供了重要途径。