Name: 由荧光相关光谱测量的一次淋巴细胞的细胞膜分子扩散 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 了解如何使用荧光相关光谱技术测量原代免疫细胞膜中蛋白质的扩散速率。该方法利用活细胞成像揭示膜受体动态，为免疫学和细胞生物学研究提供关键见解，并可应用于癌症免疫治疗策略的开发。

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我们感谢卡罗林斯卡学院分子医学中心的 Vladana Vukojević 博士对蔡司 Confocor 3 仪器的维护以及在细胞测量方面的有益建议。&#160;本研究由瑞典研究理事会（Vetenskapsrådet，资助号 2012-1629）、Magnus Bergvalls 基金会以及 Claes Groschinskys 纪念基金会资助。

1. FCS 染色
<ol>
	<li>采用磁珠标记法，按照制造商说明书从脾脏淋巴细胞中分离小鼠NK细胞16. 使用 2-3 x 105 每个样品的细胞数用于后续步骤。 
	注意：使用阴性筛选富集目标细胞群体，使目标细胞保持未受干扰状态，从而可仅使用一抗对细胞进行标记。参见参考文献2 有关从小鼠中分离细胞的更详细信息2.</li>
	<li>对于表达 Fc 受体的小鼠细胞，使用抗体克隆 2.4G2 封闭 Fc 受体 5 µg/µl 在 25 μl 每份样品加入磷酸盐缓冲液（PBS）和1%胎牛血清（FBS）。室温孵育15分钟。</li>
	<li>抗体混合物的制备
	<ol>
		<li>使用直接偶联光稳定荧光染料的抗体。若同时使用两种针对不同蛋白的抗体，应选择发射光谱分离良好的荧光染料，以最大限度减少串色干扰例如， 由488和633激光器激发2，后续方案中分别称为“绿色”和“红色”激光及荧光染料。 
		注意：如果所选生物标志物没有 commercially available（商品化）且标记有光稳定荧光染料的抗体，可根据制造商说明书将未标记抗体与荧光染料进行偶联。参见 材料表 本研究中所用抗体。</li>
		<li>用 PBS + 1% FBS 稀释针对目标蛋白的荧光标记抗体，配制抗体混合液。将抗体混合液加入各样品中，使终体积达到 50 μl 每样品。冰上避光孵育45分钟。 
		注意：预先优化抗体浓度，以确保抗体在饱和浓度下使用，通常为 1-10 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育后，通过加入缓冲液洗涤细胞 250 μl 加入 PBS，于 150 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 1.4。</li>
	<li>将细胞重悬于 200 μl 含1% FBS的PBS。置于冰上并避光，直至上机检测。 
	注意：小鼠NK细胞可在冰上保存长达10小时。</li>
</ol>
2. 显微镜腔室盖玻片的制备
注意：使用带腔室的盖玻片载玻片或培养皿时，应选择显微镜已优化适配的盖玻片厚度，通常为 #1 或 #1.5。若显微镜未针对特定厚度进行校准，或厚度未知，则需要调整显微镜的物镜校正环，以匹配当前所用盖玻片的厚度17。
<ol>
	<li>按1:10的比例将聚-L-赖氨酸用蒸馏水稀释。向培养腔中加入200 μl稀释后的聚-L-赖氨酸，孵育20分钟。</li>
	<li>用抽吸法去除聚-L-赖氨酸，敞盖置于室温下晾干至少20–30分钟。</li>
</ol>
3. 启动FCS系统
注意：本方案涉及特定的显微镜系统和软件（参见材料/试剂表），尽管也可使用其他显微镜装置和软件包。
<ol>
	<li>开启配备FCS相关器的共聚焦激光扫描显微镜，以“专家模式”打开软件，选择40倍水浸物镜。</li>
	<li>在“采集”选项卡下，点击“配置”和“扫描”按钮，打开“配置控制”窗口和“扫描控制”窗口（分别对应图1中的窗口A和B）；在“Confocor”选项卡下，点击“测量”按钮以打开“测量”窗口（对应图1中的窗口C）。</li>
	<li>创建一个文件夹用于保存FCS测量数据。在“文件”选项卡下点击“新建”，创建一个新的图像数据库。</li>
	<li>使用“激光”按钮，打开卤素灯以及用于激发荧光染料的相关激光器（例如，488 nm用于“绿色”激发激光，633 nm用于“红色”激发激光）。</li>
	<li>选择合适的激发和发射滤光片，并激活相应的探测器。
	<ol>
		<li>在“配置控制”窗口中设置图像采集参数，包括激发激光、激发和发射滤光片、光路以及将要使用的探测器。</li>
		<li>同样，在“测量”窗口的“系统配置”选项卡下，设置FCS测量的相应参数。成像与FCS测量应尽可能使用相同的设置。</li>
		<li>在“测量”窗口中，勾选“Ch1”框以激活绿色通道，勾选“Ch2”框以激活红色通道，用于FCS记录。 
		注意：设置应针对所使用的荧光染料进行优化，如同标准共聚焦成像实验中的做法。在后续实验中，可通过用户界面顶部的“Confocor”下拉菜单选择“打开文件”，打开之前的FCS文件，然后在弹出的采集窗口中点击“重用”，即可重复使用相同的FCS设置。类似地，通过打开已保存的图像并点击“重用”，可加载图像采集设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行FCS测量前，需等待激光器稳定。气体激光器可能需要长达30分钟才能稳定，而二极管激光器稳定时间较短。等待期间可调整针孔大小。</li>
</ol>
4. 针孔调节
<ol>
	<li>制备 0.2-0.5 μM 对应于抗体标记物激发和发射光谱的荧光团或荧光染料溶液。荧光团必须具有已知的扩散系数18,19.</li>
	<li>放置一个 50 μl 在腔室盖玻片的孔中央加入一滴含有荧光染料的溶液，并用绿色激光激发。在40倍水镜上滴加一滴蒸馏水，放置玻片。按下“Vis”按钮以开启可见光，通过目镜定位并聚焦荧光染料液滴。 
	注意：请使用与后续细胞测量相同的载玻片，因为不同载玻片之间玻璃厚度可能存在细微差异，从而影响显微镜的对焦与校准。</li>
	<li>将焦点置于液滴内部（10-100 μm 从底部开始）。</li>
	<li>在“测量”窗口中，选择“采集”选项卡。在“位置”下方（窗口 C）点击“当前位置” 图1).</li>
	<li>返回同一窗口中的“系统配置”选项卡。将绿色激光器的功率设置为较高值。 
	注意：高激光功率指的是饱和功率（即， 荧光信号不会随激光功率的进一步增加而线性增强。系统设置功率约为1 mW，或最大激光功率的5-10%，通常已足够。</li>
	<li>通过点击“Start”来测试信号的稳定性。这将打开一个独立窗口，显示当前测量的时间轨迹和自相关曲线。检查荧光信号是否强度高、随时间保持稳定，并且波动频率处于kHz范围而非Hz范围。</li>
	<li>在“测量”窗口中选择“O 调整”按钮。检查是否已选择正确的检测通道（Ch1 或 Ch2）。按下“AutoAdjust X”。如果得到的曲线未显示清晰的峰值，或峰值位于边缘位置，请勾选“coarse”选项，然后再次按下“AutoAdjust X”。当 X 方向的调整完成后，按下“AutoAdjust Y”，对 Y 方向执行相同操作。</li>
	<li>取消选择“粗调”，然后交替调节X和Y，每次按下“AutoAdjust”，直至两者均出现清晰的峰值，且测量值在连续测量间不再变化。</li>
	<li>如果细胞用两种不同的荧光染料标记，则转移至已加入红色荧光染料溶液的腔室。选择较高的红色激光功率，并对红色激发和检测通道重复步骤4.6–4.8。 
	注意：在仅使用一个针孔同时检测两个通道的系统中，如果X和Y值在各通道间存在偏差，请选择中间值并点击“确定”以接受更改。此处，488 nm激光的最大值位于X = 79、Y = 189，633 nm激光的最大值位于X = 80、Y = 188，因此选定X = 80、Y = 189。选用488 nm和633 nm激光共同激发两种分别标记了可被488 nm或633 nm激发的荧光染料的抗体是一种理想选择，因为当发射光谱无重叠时，串扰风险最小2.</li>
</ol>
5. 测定游离荧光染料的通过时间
注意：通过测定已知扩散系数的荧光分子穿过焦点区域的停留时间（TauD），可计算出检测体积的大小，进而确定处于焦点范围内的细胞膜区域面积。TauD 的计算方法见步骤 7.2。
<ol>
	<li>使用用于针孔调整的相同溶液，在“测量”窗口的“采集”选项卡下，将采集时间设置为30秒×2次重复图1，窗口 C）。</li>
	<li>在“测量”窗口中点击“开始”以启动测量（图1，窗口B）。
	<ol>
		<li>对每种激发激光及其对应的溶液中荧光染料，执行一系列激光功率实验，起始功率为达到或接近饱和功率，之后每次测量时将激光功率减半。在“测量”窗口的“系统配置”选项卡中调整激光功率。图1，窗口 C）。按下“开始”按钮以启动测量。 
		注意：在接下来的细胞测量中，激光功率应包含较低范围的设置（例如， 在 16、8、4 和 2 μW 功率（位于物镜之前）20系统激光设置通常高于输出激发光强度，具体数值因显微镜型号及光路准直质量的不同而有较大差异。在本系统中，上述功率范围对应约为60-500 μW 系统设置中的功率。首次使用新的显微镜时，建议使用功率计在物镜前测量输出功率。“测量”窗口的“信息”按钮下可查看激光器当前的最大功率。</li>
		<li>记录每次激光功率测量中每分子的计数（CPM，单位：kHZ）。</li>
		<li>若使用两个检测通道，需检查自相关曲线显示窗口是否存在串扰。使用仅含绿色荧光染料的溶液测量红色检测通道中的FCS自相关信号，使用仅含红色荧光染料的溶液评估绿色检测通道中的检测信号。一般原则是，来自“错误”荧光染料的每分钟计数（CPM）应低于正确荧光染料特异性信号的5%。</li>
		<li>检查数值是否随所用激光功率呈线性变化。在最高激光功率下，CPM 出现饱和现象（即， 略低于线性关系预期值的情况是可以接受的。 
		注意：对于几乎所有显微镜系统和常见荧光染料，在最高激光功率下，每秒计数（CPM）应远高于10；对于灵敏度较高的系统，CPM值可显著更高。首次使用新标记的荧光抗体时，应对其在溶液中自由扩散的状态进行荧光相关光谱（FCS）测量，以量化预期的CPM值。测量前，需用相应材料包被测量腔室 200 μl 聚-L-赖氨酸接枝聚乙二醇（用PBS稀释至0.5 mg/ml）室温孵育1小时。用移液器吸除液体，使腔室自然风干。将储备液保存于冰箱中（最多2周），粉末储备液保存于冷冻箱中。在显微镜下，将抗体稀释至1-10 µg/ml 在 PBS 中。遵循本方案中的步骤 4.2–4.4 和 6.7。如果表面未涂覆防粘附溶液，抗体将与玻璃表面相互作用，并迅速从溶液中耗尽。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 细胞测量
<ol>
	<li>从抗体标记的细胞悬液（步骤 1.5）中取 125 μl 细胞（溶于 PBS + 1% FCS），加入 150 μl 透明的 RPMI 1640 培养基（Roswell Park Memorial Institute medium 1640），混匀后加入 8 孔腔室载玻片的一个孔中。在开始 FCS 测量前，将细胞置于测量温度下避光孵育至少 20 分钟。 
	注意：此步骤旨在使细胞沉降并贴附于孔底，同时使细胞和溶液达到测量温度的平衡状态。</li>
	<li>在“扫描控制”窗口（图 1，窗口 B）中设置放大倍数为 1，按下“快速 XY”按钮开始快速 X-Y 扫描。调节激光功率，使其尽可能低的同时仍能清晰观察到细胞。将图像中心对准一个亮度适中、呈圆形且细胞膜边界清晰、胞质内无荧光信号的细胞。逐步放大，直至细胞占据图像的大部分区域。</li>
	<li>若当前细胞正在移动，或出现丝状突起、膜突或异常亮斑，则应更换新的细胞。同一实验中所有细胞的放大倍数和激光功率应保持一致。 
	注意：细胞膜皱褶也可能是即将发生凋亡的征兆。</li>
	<li>将焦点对准细胞膜顶部。在“测量”窗口的“采集”选项卡中（图 1，窗口 C），通过激活“十字线”功能选择 FCS 测量位置。或者，切换至“LSM 图像”选项卡，在 LSM 图像中标记所需的测量点，然后点击“添加位置”。 
	注意：细胞膜顶部不会受到非特异性结合于聚-L-赖氨酸的荧光抗体或荧光染料的影响。但必须确保测量过程中细胞未发生移动（参见结果部分）。</li>
	<li>在“测量”窗口的“采集”选项卡中（图 1，窗口 C），设置重复次数为 6–10 次，每次“测量时间”设为 10 秒。</li>
	<li>返回“测量”窗口的“系统配置”选项卡。在“激光”按钮下调整 FCS 测量所用的激光功率。物镜前的激光功率应保持较低，用于细胞测量时建议在 1–10 μW20 范围内。 
	注意：推荐值是在信号检测能力与细胞光损伤之间权衡的结果。参见步骤 5.2.1，并记录这些功率值对应的激光功率百分比。</li>
	<li>在“测量”窗口（窗口 C）中点击“开始”按钮启动 FCS 测量。若在测量初期细胞发生明显漂白，表现为前 10 秒内荧光强度下降超过 30%（如 图 3A 下图所示），则应更换细胞，并在后续测量中降低激光功率。
	<ol>
		<li>若信号丢失，需在 Z 方向上重新调整焦距。测量完成后，使用“扫描控制”窗口（图 1，窗口 B）检查细胞是否仍居中，以及是否正确测量了细胞膜区域。若细胞已移动，则舍弃该次测量数据。</li>
		<li>在显示测量结果的自相关窗口中，手动删除包含缩放操作、漂白、大颗粒聚集体或其他伪影的单次重复数据（参见 图 3 中示例）。方法为选中对应数据，右键点击并选择“删除”。将最终文件保存为 .fcs 格式，每个细胞至少保留四次有效重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选步骤：使用“扫描控制”窗口获取细胞中段平面的图像（应能完整观察到细胞膜周长）。为避免漂白，应在 FCS 测量完成后进行成像。点击“单次”按钮开始图像采集。</li>
	<li>若使用“添加位置”功能进行 FCS 焦点定位，在切换至下一个细胞前，请先点击“移除位置”。</li>
	<li>为保持细胞在整个实验过程中的活性，每次测量持续时间最长不超过 2 小时，之后应更换新的细胞悬液等分试样。</li>
</ol>
7. FCS 分析
<ol>
	<li>使用具有曲线拟合功能的软件打开 .fcs 文件（参见 材料/试剂表 用于本实验方案的软件）。 
	注意：显微镜配套的FCS软件是熟悉基本拟合操作的良好起点，但拟合二维膜扩散需要使用额外的软件。</li>
	<li>首先，通过分析游离荧光团的测量结果来确定激发体积的大小。将三维自由扩散曲线拟合到自相关曲线上21. 
	<img alt="共聚焦荧光相关光谱（FCS）方程；动态猝灭分析" src="/files/ftp_upload/54756/54756eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程"> （公式 1） 
	注意：参数定义：N：焦体积内荧光单元的平均数量，τ（Tau）：相关时间，τD （TauD）：分子在焦点体积内的平均停留时间， T1：荧光分子处于三重态的概率，τT：单重态-三重态跃迁的弛豫时间，S：焦体积的高度与宽度直径之比。
	<ol>
		<li>提取 TauD，即分子转移焦点所需的通过时间。</li>
		<li>利用观测到的TauD值以及用于校准的荧光染料的已发表扩散系数（D）18,19 用于计算针孔半径（ω）。 
		<img alt="旋转扩散方程；ω=√(观测到的τD/4*D)；示意图，科学分析" src="/files/ftp_upload/54756/54756eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程"> (公式 2)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞膜上自相关曲线的分析
	<ol>
		<li>为了可视化代表分子扩散的曲线部分，选择自相关曲线最陡斜率之前开始、并在曲线收敛于1之后结束的时间段例如， 0.001 至 5 秒，用于小鼠表面受体；参见 图4).</li>
		<li>生成步骤 6.7.2 中保存的各个重复序列的平均自相关曲线。</li>
		<li>使用公式3对每个平均自相关曲线拟合二维膜扩散曲线3. 
		<img alt="静态平衡公式；G2D(t) 方程分析，时间依赖性过程示意图。" src="/files/ftp_upload/54756/54756eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程">(公式 3) 
		注意：重要的输出参数如下：N 是指位于激发膜区域内的分子平均数量。需重新计算为密度（N/μm2τD （TauD）：分子在焦点区域的平均停留时间，受膜的二维性限制（单位：s）。将平均停留时间重新计算为扩散系数μm2通过已确定的针孔半径（ω）和公式2计算（/sec）。T1是荧光分子处于三重态的概率。亮度（CPM）通过将测量的平均总强度除以N得到。</li>
		<li>如果首次尝试未能获得良好拟合，请调整变量的初始值和/或上下限，直至达到良好拟合。 
		注意：原代细胞膜中蛋白质扩散速率的典型上下限为：TauD 的范围是 10–500 毫秒，T1 的范围是 0–100%，TauT1 的范围是 0.1–5 毫秒。拟合时的初始值应选择这些区间中的中间值。由扩散引起的荧光波动所对应的曲线部分通常位于 1 毫秒至 1 秒之间（参见 图4）。根据荧光团的不同，有时可能存在第二个过程，导致在比扩散参数更短的时间尺度上出现自相关。这是由瞬时暗态（三重态）或闪烁现象引起的（荧光蛋白中常出现此类情况）。方程3已将三重态考虑在内，因此在这些情况下，所提出模型也应能提供良好的拟合结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该FCS方案可用于评估各类免疫细胞（小鼠、人或其他物种）表面分子的分子动力学。FCS能够在活细胞中以单分子分辨率测量分子的空间-时间动力学。通过自相关曲线，可提取目标蛋白的分子密度、扩散速率以及聚集动力学等参数。
荧光标记对于成功的荧光相关光谱（FCS）实验至关重要。传统上，细胞膜上目标蛋白的标记采用抗体，而对于未经处理的免疫细胞表面蛋白，抗体通常是最为便捷的选择。未标记的抗体必须直接与光稳定性好、分子亮度高的荧光染料进行偶联。选择用于抗体偶联的荧光染料对测量质量具有重要影响。由于易发生快速漂白，不推荐使用流式细胞术中常用的标记物，如荧光素和藻红蛋白类染料。目前多家公司可提供适用于直接偶联抗体的光稳定染料。制造商通常会提供较为完善的偶联及纯化操作方案，整个过程可在数小时内完成。也可使用荧光蛋白进行FCS实验，但需特别注意尽量降低激光功率，因为荧光蛋白通常比最稳定的化学荧光染料更容易发生漂白。根据以往经验，蛋白的过表达常因空间拥挤效应导致扩散速率显著下降，因此不适合使用荧光蛋白标记。
在测量前进行针孔校准也是一个关键步骤。用于确...

许多免疫细胞的功能依赖于膜内分子的扩散及其相互作用。生物膜结构复杂，多种可能对免疫细胞功能具有重要意义的因素均会影响细胞膜内蛋白质平移扩散的速度1。我们近期研究表明，属于先天免疫系统的淋巴细胞——自然杀伤（NK）细胞，在细胞膜上两种被研究蛋白质的扩散行为会因NK细胞激活状态的不同而有所差异2。
荧光相关光谱法（FCS）是一种能够定量测定生物膜中分子扩散速率的技术。该技术可报告在固定体积内（通常为共聚焦显微镜的焦点）荧光标记分子的平均扩散速率，其原理基于检测处于稳态系统中分子运动所引起的荧光信号波动。FCS 已被广泛用于研究荧光染料和蛋白质在溶液及脂质膜中的扩散行为。此外，其他影响扩散速率的参数也可通过此方法间接进行研究。例如， 蛋白质的构象变化或细胞膜上分子间的相互作用3,4与其他技术相比，FCS 具有高灵敏度，能够实现单分子检测。该技术适用于纳摩尔至毫摩尔浓度范围内的分子检测，这一浓度范围恰好对应大多数蛋白质内源性表达水平的典型范围。5此外，FCS 可以估算研究体积内蛋白质的绝对数量，而大多数其他技术仅能提供有关蛋白质表达水平的相对信息。测量膜内分子扩散速率的其他方法包括光漂白后荧光恢复（FRAP）、单粒子追踪（SPT）、多针孔 FCS 和图像相关方法。FRAP 和图像相关方法属于集合测量技术，通常无法提供有关分子绝对数量的信息。10与单粒子追踪（SPT）相比，荧光相关光谱（FCS）在表征群体平均特性方面具有更高的通量。其分析要求也较低，因为测量的是激光焦点区域内分子的平均扩散速率，而非单个分子的扩散速率。此外，除非具备专用显微镜11SPT 无法提供关于浓度的信息，因为标准的 SPT 标记必须非常稀疏，以便识别单个分子。另一方面，FCS 要求被研究的分子具有移动性，因此它完全无法检测任何可能存在的不移动组分或移动极其缓慢的分子。在焦点中停留时间超过约十分之一采集时间的分子，其扩散速率在 FCS 测量中将无法被准确反映。3,12因此，FCS测得的扩散系数通常比FRAP和SPT等技术报告的扩散速率更快，因为后者同时考虑了接近静止和极慢扩散的组分。此外，SPT相较于FCS能更详细地描述分子群体内扩散速率的变异性。
FCS通过测量激发体积内荧光强度随时间的波动来对其进行量化。在膜测量的情况下，这对应于膜的被照明区域。本文利用了这样一个事实：此类波动由表现出布朗扩散的分子引起，这些分子不断进出激发体积。此外，荧光信号的波动还可能来源于其他多种因素，例如荧光团的闪烁或三重态的存在、环境效应、配体的结合与解离，或整个细胞膜的运动。在设计FCS实验时，必须考虑这些潜在的误差来源，以便准确解读实验结果12,13。通常情况下，由于拥挤效应以及膜蛋白之间、蛋白质与细胞骨架之间的相互作用，生物膜中的侧向扩散速率较低。历史上，FCS在膜研究中的应用一直受到缺乏光稳定荧光团的限制，因为在较长的通过激发焦点的时间内必须避免光漂白14。然而，如今已有大量适合的光稳定染料可供选择。探测器及其他硬件的显著改进也使得能够检测亮度较低的荧光蛋白和染料。本文描述了一种使用小鼠原代淋巴细胞进行FCS分析的基本实验方案，其中目标蛋白通过荧光标记抗体进行标记。同时展示了拟合自相关曲线以提取扩散系数和分子密度的方法。本方案旨在为无分子扩散研究技术经验的免疫学家提供易于遵循的操作流程。但要求使用者具备共聚焦显微镜的基本知识（如需获得此基础知识，请参见参考文献15）。该方案可相对容易地适用于其他悬浮细胞，包括细胞系和原代细胞。对于经验更丰富的FCS使用者，存在更为精细的分析方法，其中一些将在讨论部分中介绍。

<table><tbody><tr><td>MACS NK细胞分离试剂盒 小鼠II</td><td>Miltenyi Biotec Norden&lt;sup&gt;AB&lt;/sup&gt;</td><td>130-096-892</td><td>NK细胞的阴性筛选</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>-</td><td>-</td><td>实验室自制&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640培养基</td><td>PAA The Cell Culture Company&amp;nbsp;</td><td>E15-848</td><td>透明培养基</td></tr><tr><td>抗体克隆2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>用于阻断Fc受体</td></tr><tr><td>抗Ly49A抗体&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>实验室自制单克隆抗体，并在实验室中与Alexa fluor 647偶联</td></tr><tr><td>克隆JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗H-2Dd抗体&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>在实验室中与MFP488偶联</td></tr><tr><td>克隆34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>用于抗体偶联的荧光染料</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>用蒸馏水稀释（1.10）</td></tr><tr><td>聚乙二醇（2 kDa）接枝的聚-L-赖氨酸（20 kDa）</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td>用PBS（pH 7.4）稀释至0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>罗丹明110氯化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>已知扩散系数：3.3 &amp;times; 10&lt;sup&gt;&amp;minus;10&lt;/sup&gt; m&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/sec &lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A20006</td><td>已知扩散系数：4.4 &amp;times; 10&lt;sup&gt;&amp;minus;10&lt;/sup&gt; m&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/sec &lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>软件：Confocor 3</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>软件：Matlab（含曲线拟合工具箱）</td><td>Matlab</td><td>版本 R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 细胞培养腔室盖玻片</td><td>Thermo-scientific&amp;nbsp;</td><td>155411</td><td>8孔，1.0硼硅酸盐底面</td></tr></tbody></table>

利用荧光相关光谱法测定原代淋巴细胞质膜中的分子扩散

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

荧光相关光谱法（FCS）是一种强大的技术，可用于高空间和时间分辨率下研究生物膜内分子的扩散行为。FCS能够定量测定细胞膜中荧光标记分子的分子浓度和扩散系数。该技术可用于探究免疫细胞质膜中分子在稳态条件下的分子扩散特性即， 无需担心在实际测量期间发生影响结果的干扰过程）。FCS适用于研究表达水平接近大多数内源性蛋白质的蛋白质扩散行为。本文展示了一种直接且稳健的方法，用于测定原代淋巴细胞细胞膜蛋白的扩散速率。文中描述了对经抗体标记的活细胞进行测量的有效方法，以及数据采集后常见的观察结果。近年来光稳定性荧光染料的发展成果可被充分利用，即将目标抗体与合适的荧光染料偶联，以确保测量过程中染料不易发生明显漂白。此外，该方法还可用于检测扩散较慢的分子实体，这在细胞膜表达的蛋白质中较为常见。本文重点介绍了从获得的自相关曲线中提取分子浓度和扩散参数的分析流程。总之，本文提供了一个FCS测量的基本实验方案，可供具备共聚焦显微镜知识但无分子扩散速率等动态参数测量技术经验的免疫学研究人员参考和实施。

典型结果将生成一条自相关曲线，膜蛋白的停留时间范围为10毫秒至400毫秒。每个检测区域内的分子数量可介于0.5到约200之间 μm2 对于内源性表达的蛋白质，需仔细检查每分钟计数（CPM）是否不低于预期值。CPM过低可能提示背景信号存在干扰。经验上，在相同激光功率下，用于分析的细胞表面信号的CPM值不应低于游离扩散抗体CPM值的33%。CPM应随激光功率呈线性变化。原代免疫细胞表面受体的自相关曲线应平滑，其最陡部分通常出现在0.001至1秒之间。参见 图2 用于代表性的自相关曲线及其时间轨迹。
如引言中简要提及，由于其他来源的荧光波动会影响信号，导致结果混淆，在某些情况下，荧光相关光谱（FCS）不适用于测量分子扩散。图3展示了应舍弃特定细胞或测量重复的几种示例情况。前文已提到，信号极低（CPM值非常低）是舍弃该细胞的原因之一。另一个舍弃单个细胞的原因是细胞发生移动...

本文介绍了一种利用荧光相关光谱法（FCS）测量原代免疫细胞膜中蛋白质扩散的方法。文中以抗体进行荧光标记的应用为例进行了说明。

荧光相关光谱法（FCS）是一种强大的技术，可用于高空间分辨率下研究分子在生物膜中的扩散行为...

本实验方案的总体目标是利用荧光相关光谱法测定标记蛋白在原代免疫细胞膜中的扩散速率。该方法有助于解答免疫学和细胞生物学领域的一些关键问题，例如识别具有更活跃膜受体动力学的自然杀伤细胞。该技术的主要优势在于其适用于活细胞，因此能够真实反映分子在天然状态下的运动情况。如果将不同自然杀伤细胞的特性（例如分子扩散）与其功能相关联，从而更准确地预测其效率，则该技术的应用前景可拓展至癌症免疫治疗领域。尽管该方法可为免疫细胞中的分子运动提供洞察，但也可应用于任何学科中的其他原代细胞和细胞系。以专家模式打开软件，并选择“扫描新图像”选项。在共聚焦激光扫描显微镜上选择40倍水镜。在“采集”选项卡下，按下“配置”和“扫描”按钮，以打开配置控制和扫描控制界面。在ConfoCor选项卡下，按下“测量”以打开测量窗口。接下来，创建一个文件夹以保存FCS测量数据。在“文件”选项卡下点击“新建”以创建一个新的图像数据库。打开卤素灯。使用激光按钮，开启用于激发荧光染料的相关激光器。然后在配置控制窗口中设定图像采集的参数，包括激发激光、激发和发射滤光片、光路以及所使用的探测器。类似地，进入测量窗口，在系统配置选项卡下调整FCS设置。通过切换Ch 1启用绿色通道，切换Ch 2启用红色通道，以激活FCS记录的检测通道。在激光器稳定过程中（可能需要长达30分钟），调整针孔。首先，将 50 微升染料液滴置于经多聚-L-赖氨酸包被的八孔腔室盖玻片的一个孔中央。相邻的孔用于进行细胞测量，因为校准依赖于具体载玻片。在 40 倍水镜镜头上滴加一滴蒸馏水，并放置载玻片。 然后按 Vis 以选择可见光源，并聚焦于荧光团液滴的中心位置。在软件的“Measurement”窗口中，选择“Acquisition”选项卡，然后在“Positions”下切换当前位置。接着返回同一窗口中的“System Configuration”选项卡，并为绿色激光器设置高功率或饱和功率。为了测试信号的稳定性，按下“开始”按钮以打开一个新窗口，显示时间轨迹和自相关曲线。检查荧光信号是否强且稳定，并确认 y 轴显示的波动在千赫兹范围内。较低的数值可能是由于聚焦不准确或染料降解所致。接下来，在测量窗口中选择 O 调整按钮。然后选择正确的检测通道并点击自动调整 X。如果所得曲线的上限缺失或未居中，请勾选粗调选项，再次点击自动调整 X。在完成 X 方向的调整后，通过点击自动调整 Y 对 Y 方向进行相同操作。取消勾选粗调选项，交替点击自动调整 X 和 Y，直至 X 与 Y 方向均呈现清晰的峰值和稳定的数值。如果使用两种不同的荧光染料标记细胞，向相邻的腔室中加入一滴红色荧光染料溶液，然后校准第二个通道。将红色激光设置为高功率，并重复稳定性校准程序。接下来，我们测量自由扩散的荧光分子通过焦点的停留时间。然后利用物镜台来计算位于焦点内的细胞膜面积。开始时，通过仔细执行调节步骤，将焦点对准一滴溶液。然后转到测量窗口中的“采集”选项卡，将采集时间设置为30秒，重复三次。将激光功率设置为接近饱和，然后按“开始”进行测量。测量完成后，记录每分子计数（CPM）。然后在逐步降低激光功率的情况下进行新的测量，进行迭代式调整。在此功率范围内，应包含即将进行的细胞测量所预期的功率值。接下来检查CPM值是否随激光功率呈线性变化。如果量程的其余部分呈线性，则最高功率下的饱和是可接受的。首次使用新偶联的荧光抗体时，应进行游离扩散抗体的FCS测量，以量化预期的CPM值。并且重要的是，应使用涂覆有PEG聚-L-赖氨酸的孔板来处理游离抗体。进行此操作时，用 200 微升聚乙二醇修饰的多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine grafted to polyethylene glycol）包被玻片腔室，在室温下孵育 1 小时。储备液可在冰箱中保存最多两周。粉末储备液应保存在冷冻柜中。随后，移除液体并使腔室自然风干。在显微镜下，将抗体用 PBS 稀释至每毫升含 1 至 10 微克。按照之前测定游离荧光团的方法，继续测定游离抗体的通过时间。在细胞中进行测定时，从抗体标记的细胞悬液中加入125微升含1%FCS的PBS细胞悬液，以及150微升透明的Roswell Park Memorial Institute 1640培养基至PLL包被玻片的空孔中。在继续操作前，将细胞置于检测温度下避光孵育至少20分钟，以使细胞充分贴壁并达到平衡状态。开始成像时，先进行快速的XY扫描，以确定观察细胞所需的最低激光功率。然后将图像中心对准一个亮度适中、细胞膜轮廓清晰的圆形细胞。细胞质中不得存在荧光信号。放大至细胞占据图像大部分区域，然后聚焦于细胞膜顶部。从细胞中心开始向上移动，直到图像中心显示一个荧光均匀的小圆形区域。准确的聚焦位置至关重要。如果焦点未对准细胞膜，所检测到的荧光将不会来自荧光标记的膜受体。因此，结果将无法反映其真实行为。现在，在“测量”窗口的“采集”选项卡下，通过激活十字准线选择进行FCS测量的位置。然后将重复次数设置为6到10次，每次测量时间设置为10秒。现在返回到“测量”窗口的系统配置选项卡，将FCS测量的激光功率降低至1至10微瓦之间。然后点击“开始”。如果在前10秒内荧光强度下降超过30%，则表明细胞已被过度漂白，必须选择另一个细胞并在更低的功率下进行测量。如果信号丢失，请调整Z方向的焦距并重新开始测量。测量完成后，在扫描控制窗口中检查细胞是否仍处于中心位置，以确认其膜已被测量。如果细胞发生移动，则舍弃该数据。现在转到自相关窗口，手动删除包含缩放操作、漂白、大簇或其他伪影的单个重复数据。使用右键单击并选择“删除”以移除伪影。准确识别实际伪影需要一定经验。去除重复项是一个简单的过程，但需要正确评估重复项，以确定哪些应被去除，哪些不应去除。然后将最终文件保存为FCS格式。在去除异常值后，仅保留至少含有四个重复项的细胞用于进一步分析。典型的膜受体自相关曲线平滑，其穿越时间范围为10至400毫秒。设置拟合区间时，应包含代表扩散过程的最陡斜率部分的起始点和终点。采用二维自由扩散模型对数据进行拟合时，需重点关注曲线上斜率最陡的部分。在残差中观察到的、在 tau 尺度上接近或约为一秒的微小波动是可以接受的。如果曲线拟合效果不佳，但细胞本身无明显问题（例如移动、漂白或聚集），则可能需要调整模型的初始值或参数的上下限。当模型与自相关曲线良好拟合后，提取变量参数的数值。内源性表达蛋白每平方微米所含分子数可在0.5至约200之间。请确认细胞测量所得的CPM值至少达到游离扩散抗体所记录值的33%。观看本视频后，您应能充分理解如何利用荧光相关光谱技术测量蛋白质的扩散速率。一旦掌握，该技术若操作得当，可在五到六小时内完成。在进行该实验过程中，重要的是将细胞保持在冰上，直至测量开始前约20分钟。任何样品的测量均不得超过两小时。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如成像）来回答更多问题，例如扩散速率与某种特定蛋白质表达水平之间的相关性。该技术一经建立，便为分子生物学和免疫学领域的研究人员探索活细胞中蛋白质动态变化提供了重要途径。

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科研

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Immunology and Infection

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