Name: 兹卡病毒感染细胞培养系统和体外干扰素的预防作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 了解利用Vero细胞建立寨卡病毒体外培养系统的详细方法，用于研究病毒复制机制和致病机理。该技术支持大规模病毒生产，为疫苗和药物研发提供重要平台。

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我们感谢美国疾病控制与预防中心（CDC）的 Aaron Brault 博士和 Brandy Russell 博士提供寨卡病毒 PRVABC59 毒株。感谢耶鲁大学的 Nicholas Ten 对本手稿进行文字编辑。本研究由 Cedars-Sinai 医学中心机构研究项目奖资助，授予 V.A.。

注：工作流程的示意图见图1。
1. 细胞
<ol>
	<li>使用Vero细胞进行寨卡病毒的生产及病毒复制周期的分析。</li>
	<li>配制含有10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（100单位/毫升）、链霉素（100单位/毫升）和10 mM HEPES的完全生长培养基。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，使用指定的完全生长培养基培养Vero细胞。</li>
</ol>
2. 寨卡病毒的制备
<ol>
	<li>在 T-75 培养瓶中使用 0.25% 胰蛋白酶收获细胞密度为 80% 的 Vero 细胞，并进行细胞计数。
	<ol>
		<li>吸除 T-75 培养瓶中的培养基，并用 2 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞。</li>
		<li>加入 2 ml 0.25% 胰蛋白酶，将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入 8 ml 含血清的生长培养基以中和胰蛋白酶活性。用移液器反复吹打使细胞悬浮，然后将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。</li>
		<li>取 10 µl 细胞悬液，与等体积的 0.4% 台盼蓝混合。将制备好的混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪获取活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将总计 700 万个细胞以 30 ml 体积接种至 T-160 培养瓶中。</li>
	<li>次日，每瓶用 10 ml 无血清培养基配制适当感染复数（0.01 至 0.1 MOI）的寨卡病毒接种液。</li>
	<li>吸除 T-160 培养瓶中的旧培养基，加入新配制的病毒接种液（10 ml）。</li>
	<li>将接种后的培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4–6 小时。每隔 1 小时轻轻倾斜培养瓶，使接种液均匀分布。</li>
	<li>孵育结束后，每瓶更换为 30 ml 预热的含血清生长培养基，继续培养病毒 96 小时。</li>
	<li>通过相差显微镜观察细胞单层上病毒蚀斑的形成情况，监测感染进程，并根据需要在 40X 和 200X 放大倍数下拍照记录（图 2）。</li>
</ol>
<img alt="40倍和200倍放大下的细胞分化过程，显微镜图像，细胞生物学研究。" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：寨卡病毒在Vero细胞单层上形成的蚀斑。不同放大倍数的明场图像显示了感染后48小时（48 hpi）的寨卡病毒蚀斑。注意单层上出现的圆形细胞病灶。（比例尺 = 50 µm）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<ol start="8">
	<li>在96小时时间点收集细胞培养上清液，并于4 °C下以300 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。</li>
	<li>小心吸取上清液，避免扰动沉淀的碎片，转移至15 ml离心管中。可选择在24,000 × g条件下进行超速离心，以浓缩病毒颗粒（可选步骤）。</li>
	<li>将病毒培养上清液分装成多份，于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 通过噬斑实验测定寨卡病毒滴度
<ol>
	<li>使用12孔板，以每孔2 ml体积将Vero细胞以每孔1×105个细胞的密度接种。</li>
	<li>次日，用无血清培养基对从T-160培养瓶收集的病毒培养上清液进行10倍系列稀释。吸弃各孔中的旧培养基，每孔加入400 µl已稀释的病毒接种液，设三个重复孔。</li>
	<li>将接种后的培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育4–6小时。每隔1小时轻轻倾斜培养板，使接种液均匀分布。</li>
	<li>孵育结束后，弃去接种液，每孔加入含血清的培养基（2 ml/孔）。</li>
	<li>接种后48小时，使用相差显微镜计数病毒病灶，并以每毫升空斑形成单位（PFU）计算病毒滴度。空斑实验示意图参见图3。</li>
	<li>使用含20%乙醇的4%甲醛和0.1%结晶紫溶液对细胞进行固定和染色，以便清晰观察空斑。</li>
</ol>
4. 寨卡病毒基因组复制检测
<ol>
	<li>使用12孔板，以每孔2 ml体积接种初始Vero细胞，密度为每孔1 × 105 个细胞。次日，用无血清培养基制备低滴度和高滴度的病毒接种物（MOI分别为0.01和0.1；每孔400 µl），设三个重复。对于模拟感染组，仅使用无血清培养基（每孔400 µl）。</li>
	<li>重复步骤3.2至3.4。</li>
	<li>在48小时和96小时时间点，收集样本用于RNA提取和免疫细胞化学（ICC）检测。
	<ol>
		<li>收集RNA样本时，吸除培养基，然后直接向每孔加入400 µl裂解液，并收集裂解产物。</li>
		<li>进行ICC检测时，吸除培养基，然后向每孔加入1 ml甲醇固定细胞，并将培养板在4 °C孵育30分钟。</li>
		<li>从细胞裂解液中，按照试剂盒制造商说明书使用RNA提取试剂盒分离总RNA。使用分光光度计对RNA进行定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行两步法反转录定量PCR（RT-qPCR），以测定所提取RNA中的ZIKV基因组含量。
	<ol>
		<li>进行RNA反转录时，首先在0.2 ml离心管中配制13 µl反应体系，包含5 µg提取的RNA、1 µl dNTPs（10 mM）和1 µl随机六聚体引物（250 ng）。将反应管在65 °C孵育5分钟，随后置于冰上1分钟。接着向反应体系中加入1 µl反转录酶、4 µl 5×第一链合成缓冲液、1 µl 0.1 M二硫苏糖醇（DTT）和1 µl RNase抑制剂。先在25 °C孵育5分钟，再在50 °C孵育60分钟，最后在70 °C加热15分钟以终止反应。</li>
		<li>使用1 µl上述获得的cDNA，在25 µl反应体系中进行qPCR，反应体系包含12.5 µl 2×绿色染料预混液（含DNA聚合酶）和1 µl 10 mM特异性引物，引物针对寨卡病毒[Zika病毒泛基因型引物（正向：5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3'；反向：5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3'），Zika病毒亚洲基因型PRVABC59株引物（正向：5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'；反向：5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3'）]、丙型肝炎病毒（JFH RTQ F: 5'-CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3；JFH RTQ R: 5'-CCTATCAGGCAGTACCACA-3'）或细胞看家基因GAPDH（正向：5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3'；反向：5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3'）。</li>
		<li>在实时荧光定量PCR系统中，按照以下程序运行PCR：95 °C 15秒，60 °C 30秒，共40个循环。</li>
		<li>根据循环阈值（Ct）对GAPDH表达水平进行归一化，以校正Zika病毒基因组的检测值。计算Zika基因组相对于GAPDH的ΔCt值，并获得2ΔCt值。然后通过计算感染组与未感染组细胞在指定时间点归一化后的Zika基因组含量比值，得出倍数变化。ZIKV基因组复制结果见图4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用甲醇固定的细胞进行免疫细胞化学（ICC）检测。
	<ol>
		<li>用1× PBS洗涤固定后的细胞三次，并用ICC封闭缓冲液（含3%山羊血清、3% BSA和0.1% Triton X-100的PBS溶液）进行封闭。</li>
		<li>将小鼠单克隆抗双链RNA抗体J2（1 µg/ml）按1:100比例溶于封闭缓冲液中，加入后于4 °C孵育过夜。</li>
		<li>用1× PBS洗涤细胞，然后加入二抗——山羊抗小鼠IgG-594（1 µg/ml），按1:1,000比例溶于封闭缓冲液，室温孵育1小时。</li>
		<li>用1× PBS洗涤细胞，使用Hoechst染料对细胞核进行染色，并在荧光显微镜下以100倍放大倍数观察细胞（图4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 针对寨卡病毒感染的细胞因子文库筛选
<ol>
	<li>使用12孔板，以每孔1 x 105个细胞的密度接种 naive Vero 细胞。待细胞贴壁后（接种后6小时），在每个孔中加入不同浓度的细胞因子，设两个生物学重复（每孔2 ml）。设置仅含载体（PBS）的对照组。</li>
	<li>处理后12小时，进行寨卡病毒（Zika virus）感染（每孔400 µl，MOI为0.1）。设置未感染病毒的阴性对照孔（mock）。</li>
	<li>感染后4小时，将病毒接种液更换为含细胞因子的培养基（2 ml），继续在37 °C 培养44小时。</li>
	<li>感染后48小时，使用相差显微镜计数病毒蚀斑，并在40倍放大倍数下拍摄感染细胞的代表性图像（图5）。</li>
</ol>

<ol><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li>
<li>Lucey, D. R., Gostin, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Zika+Pandemic%3A+Enhancing+Preparedness%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness.</a> JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).</li>
<li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li>
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<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic%2C+Yap+State%2C+Micronesia%2C+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).</li>
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<li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).</li>
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<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+detection+of+Zika+virus+and+evaluation+with+field-caught+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes.</a> Virol J. 10, 311(2013).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy%3A+effects+on+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Perinat+Med%22%5BJournal%5D)">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li>
<li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处提供了一种简化的寨卡病毒培养方案 体外 介绍了关键步骤，包括确定病毒培养扩增的最佳终点、滴度测定以及基因组复制的定量。寨卡病毒是一种人类病原体，因此在操作传染性病原时必须严格遵守生物安全操作规程。实验中使用了猴肾细胞系Vero来演示多种病毒学检测方法。寨卡病毒在不同组织和物种来源的细胞中其复制动力学可能存在差异。其他细胞系也可参照先前描述的方法使用。15寨卡病毒已从受感染胎儿的脑组织中分离出来3 并已被证实可感染皮层神经前体细胞14因此，评估寨卡病毒（ZIKV）感染在神经元细胞中的病理生理学特征，可提供更具细胞特异性的深入见解。利用该感染性培养系统，可进一步研究非洲型和亚洲型基因型在神经毒力表型上的差异。本文所述的病毒制备方法同样适用于高滴度病毒的生产。 体内 在非人灵长类或啮齿类动物模型系统中的致病性研究。
尽管本研究仅限于使用Vero细胞，但也可测试来源于人类和蚊子的高滴度生产细胞系。在病毒生产过程中，若第3天仅观察到10-30%的细胞出现细胞病变效应（CPE），可将感染细...

寨卡病毒（ZIKV）是一种与小头症及不良妊娠结局相关的重要人类病原体1,4。ZIKV 属于一组具有医学意义的黄病毒，这类病毒可引起登革热、西尼罗河病毒和圣路易斯脑炎病毒等神经系统缺陷。病毒主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）媒介传播，此外也有性传播的报道5,6。由于媒介蚊虫的地理分布不断扩展，且 ZIKV 与出生缺陷之间存在强烈关联，该病毒已成为全球重要的公共卫生问题。ZIKV 最早于 1947 年从乌干达寨卡森林的一只哨兵恒河猴体内分离获得，首例人类病例于 1952 年报道7,8。感染 ZIKV 的个体通常表现为轻度症状，如发热、皮疹、头痛、结膜炎以及肌肉/关节疼痛。感染 ZIKV 的孕妇可将病毒传播给发育中的胎儿1。ZIKV 感染还被发现与吉兰-巴雷综合征相关，后者是一种周围神经的自身免疫性脱髓鞘疾病9。
寨卡病毒基因组由一条正义单链RNA分子组成，长度约为10.8千碱基。其基因组结构排列为5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR，两端为非编码区（NCR），中间为编码蛋白质的区域6。该基因组翻译产生一条单一的多聚蛋白（3,419个氨基酸），随后在翻译过程中及翻译后被切割成10个较小的肽段。5'NCR和3'NCR的RNA茎环结构在病毒基因组翻译和复制的起始过程中发挥关键作用。基因组的结构蛋白包括衣壳蛋白、膜蛋白和包膜蛋白。非结构蛋白则对基因组复制至关重要。
目前，寨卡病毒毒株分为三种主要基因型：西非型、东非型和亚洲型6,10-13。有研究提出，东非谱系曾传播至西非和亚洲，并在这些地区进一步演化12。当前在美洲暴发的疫情由亚洲基因型引起。寨卡病毒可在蚊子细胞和哺乳动物细胞中培养。皮肤成纤维细胞、未成熟树突状细胞、皮层神经前体细胞以及Vero细胞均易受寨卡病毒感染10,14,15。Ⅰ型和Ⅱ型干扰素均已被证明可抑制皮肤成纤维细胞中寨卡病毒的增殖15。本研究的目的是提供一个逐步详尽的实验方案，用于在哺乳动物细胞培养系统中生产并检测亚洲基因型寨卡病毒毒株PRVABC59，并展示该感染性培养系统作为药物研发平台的应用价值。该资源有望显著促进寨卡病毒及神经科学研究领域，进一步阐明其病毒致病机制以及毒力进化的规律。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>Sigma生命科学</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶，10 倍浓度，无酚红&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染色液</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>库尔斯 &amp;ndash; 自动细胞计数仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数&amp;nbsp; 腔室载玻片</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗双链RNA抗体 J2&amp;nbsp;</td><td>英文 &amp;amp; 科学咨询有限公司</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III 逆转录酶&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR 超级混合液（含 ROX）</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero 细胞系&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>寨卡病毒株 PRVABC59</td><td>美国疾病控制与预防中心（CDC）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1α&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>200-01A&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-α</td><td>Peprotech</td><td>300-01A&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>干扰素αA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>干扰素β</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>干扰素γ</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>尼康Eclipse Ti免疫荧光显微镜，配备尼康Intensilight C-HGFI</td><td>尼康</td><td>访问尼康以获取申请</td><td></td></tr></tbody></table>

寨卡病毒感染性细胞培养系统及 体外 干扰素的预防作用

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

寨卡病毒（ZIKV）是一种新发传染病病原体，与胎儿发育异常相关，如小头畸形、眼部缺陷和生长受限。ZIKV 是一种属于黄病毒科的RNA病毒 黄病毒科 家族。ZIKV 主要通过蚊子传播，但也可能通过母婴垂直传播以及性接触传播。迄今为止，尚无可靠的治疗方法或疫苗可用于保护病毒感染者。建立可重复且有效的寨卡病毒（ZIKV）感染性细胞培养系统，对于研究 ZIKV 复制的分子机制以及药物和疫苗的开发至关重要。在这方面，本文描述了一种基于哺乳动物细胞的 体外 寨卡病毒培养系统用于病毒的增殖与生长分析，本文报道了寨卡病毒在细胞单层上形成蚀斑的详细过程，以及用于测定病毒滴度的蚀斑试验方法。同时，对病毒基因组复制动力学及双链RNA基因组复制中间体进行了检测。该培养平台被用于筛选一组小型细胞因子文库，结果鉴定出干扰素-α（IFN-α）、IFN-β和IFN-γ为抑制寨卡病毒生长的强效因子。综上所述，一个 体外 本研究展示了具有感染性的寨卡病毒培养系统及多种病毒学检测方法，有望为科研界进一步阐明病毒致病机制和病毒毒力进化提供重要支持。此外，抗病毒干扰素-α可进一步评估用于高风险人群（包括感染寨卡病毒的孕妇）的预防、暴露后预防及治疗方案。

本研究采用了一种亚洲基因型的寨卡病毒毒株（PRVABC59；GenBank 登录号 KU501215）12. 用于研究的 Vero 细胞应达到 80% 融合度 从头合成 寨卡病毒感染。为了病毒的制备及后续的病毒学表征，实验采用早期传代（P3代）的寨卡病毒。感染后第二天可观察到病毒蚀斑。最初感染细胞释放的寨卡病毒子代可扩散至邻近细胞，从而在单层细胞培养中形成可见的蚀斑。图2）。寨卡病毒感染的细胞病变效应（CPE）表现为细胞形态改变，如细胞变圆、脱落以及溶细胞死亡。
为测定病毒滴度，将从T-160培养瓶收获的含病毒无细胞上清液进行10倍系列稀释，并接种至12孔板中的Vero细胞单层（图3）。以接种后48小时作为终点，以避免计入继发感染产生的噬斑。选择含有30–100个噬斑的孔进行计数，以获得准确的滴度。
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寨卡病毒（ZIKV）是一种新发传染病病原体，与胎儿发育异常及小头症相关。建立有效的感染性细胞培养系统对于研究ZIKV复制以及疫苗和药物开发至关重要。本研究展示并讨论了与ZIKV相关的多种病毒学检测方法。

寨卡病毒（ZIKV）是一种新发传染病病原体，与胎儿发育异常相关，如小头畸形、眼部缺陷和生长受限。ZIKV ...

本研究的总体目标是建立一种基于哺乳动物细胞的体外寨卡病毒感染性培养系统，用于研究寨卡病毒的复制过程，并利用该体外平台进行药物开发。这一逐步详述的寨卡病毒感染性细胞培养系统操作方案，有助于阐明寨卡病毒介导的疾病发病机制及病毒毒力的演化机制。该技术的主要优势在于能够实现寨卡病毒的大规模生产，从而服务于药物和疫苗的研发。首先，在T75培养瓶中当Vero细胞密度达到80%时，吸除培养瓶中的培养基，并用2毫升磷酸盐缓冲液冲洗细胞。加入2毫升0.25%胰蛋白酶，于37摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，加入8毫升含血清的生长培养基以中和胰蛋白酶活性。随后将细胞转移至15毫升离心管中。取10微升细胞悬液，与等体积的0.4%台盼蓝混合。将制备好的混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定活细胞数量。将总计七百万个细胞以30毫升培养体积接种至T160培养瓶中。次日，每瓶用10毫升无血清培养基配制适当感染复数的寨卡病毒接种液。 安全操作病毒对于防止感染传播至关重要。从T160培养瓶中移除用过的培养基，然后加入全部10毫升新鲜配制的病毒接种物。将接种后的培养瓶置于37摄氏度、5%CO2条件下孵育4至6小时。在孵育期间，每隔1小时轻轻将培养瓶侧向倾斜，以使接种物均匀分布。孵育结束后，用30毫升温热的含血清补充成分的生长培养基替换接种物。随后，继续培养病毒96小时。四天后，使用相差显微镜观察细胞单层上病毒蚀斑的形成情况，以确认感染进展。根据需要，在40倍和200倍放大倍数下拍摄图像。 在96小时时间点收集细胞培养上清液，并在4摄氏度下以300 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。离心后，小心移除上清液，避免扰动沉淀的碎片，并将其转移至15毫升离心管中。将病毒培养上清液分装成多份，于负80摄氏度保存。 为了滴定病毒，首先将 naive Vero 细胞以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度接种到 12 孔板中，每孔体积为 2 mL。次日，使用无血清培养基对从 T160 培养瓶收集的病毒培养上清液进行 10 倍系列稀释。在制备用于滴度测定的病毒培养上清液系列稀释液时，务必安全操作病毒，以防止感染。 接下来，从含有Vero细胞的12孔板的每个孔中移除用过的培养基，并向Vero细胞中加入400微升稀释后的接种物，每组设三个重复孔。将接种后的培养板置于组织培养孵育箱中孵育4至6小时。孵育结束后，将接种物更换为每孔 2 毫升含血清培养基。接种后 48 小时，在适当稀释度下使用相差显微镜对病毒病灶进行计数。以每毫升空斑形成单位计算病毒滴度。在将高滴度和低滴度的寨卡病毒接种至12孔板中的Vero细胞，并分别培养48小时和96小时后，通过定量PCR检测寨卡病毒基因组的表达，以及通过免疫细胞化学检测双链RNA，以评估基因组复制情况。 进行免疫细胞化学染色时，从12孔板的各孔中移除培养基，每孔加入1毫升甲醇。将细胞置于4摄氏度下固定30分钟。随后，用1×PBS洗涤固定后的细胞3次。然后加入封闭缓冲液，在室温下孵育1小时。将小鼠单克隆抗双链RNA抗体J2用封闭缓冲液按1:100比例稀释，加入细胞中，并在4摄氏度下于该溶液中过夜孵育。次日，将 goat anti-mouse IgG-594 二抗用封闭缓冲液按1:1,000比例稀释，在用1×PBS洗涤细胞后，加入此二抗溶液，室温孵育1小时。再次用1×PBS洗涤细胞后，使用Hoechst染料对细胞核进行染色，并在荧光显微镜下以100倍放大倍数观察细胞。在12孔板中接种 naive Vero 细胞后6小时，按前述方法加入感兴趣细胞因子，浓度按指示设置，每个处理设两个生物学重复。处理后12小时进行寨卡病毒感染，并设置未感染的阴性对照孔。感染后4小时，将病毒接种液更换为含细胞因子的培养基，随后将细胞在37摄氏度继续孵育44小时。感染后48小时，使用相差显微镜计数病毒蚀斑，并在40倍放大倍数下获取感染细胞的代表性图像。该图显示了通过RT-qPCR检测的寨卡病毒基因组含量。泛基因型引物和PRVABC-59毒株引物表现出相同的灵敏度和特异性。与预期一致，丙型肝炎病毒引物未扩增出任何产物。此处展示了在指定时间点，低滴度和高滴度感染细胞中寨卡病毒的生长动力学，与未感染的模拟对照组相比的结果。免疫细胞化学检测结果显示，在感染后48小时，感染细胞呈少数簇状分布；而在感染后96小时，大多数细胞已被感染。该图表显示了与载体对照组相比，多种细胞因子对寨卡病毒生长的调节作用。这些相差显微图像显示了经细胞因子处理或未经处理的寨卡病毒感染细胞。感染细胞形成的病毒蚀斑可见为病灶状聚集。请注意，经干扰素处理的孔中未出现病毒蚀斑。通过该实验流程，还可开展其他方法，例如对寨卡病毒进行高分辨率结构域定位，以研究其在蚊子和人类细胞中的病毒蛋白定位与复制，从而回答更多科学问题，如阐明疾病致病机制以及病毒毒力的演化过程。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立基于哺乳动物细胞的体外寨卡病毒感染培养系统，用于研究寨卡病毒的复制机制，以及如何利用该体外平台进行药物和疫苗的研发。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

兹卡病毒感染细胞培养系统和<em&gt;体外</em&gt;干扰素的预防作用

本视频演示了一种利用寨卡病毒恢复期血清检测登革病毒感染的抗体依赖性增强（ADE）的实验方法。该实验采用编码绿色荧光蛋白的登革病毒报告病毒颗粒（RVPs）。针对寨卡病毒的血清抗体与RVPs发生交叉反应，形成复合物。结合的抗体可增强表达Fc受体的细胞对RVPs的摄取，通过流式细胞术检测该过程。...

一种用于检测病毒抗体依赖性增强感染的体外实验方法

一种用于筛选强效抑制寨卡病毒生长的干扰素的体外检测方法

本视频展示了一种用寨卡病毒感染人类胎儿神经干细胞的操作流程。感染后的细胞可用于进一步的研究。...

寨卡病毒感染胎儿神经干细胞

本方案描述了从双质粒感染性cDNA克隆中回收具有感染性的寨卡病毒的方法。...

从一种新型寨卡病毒感染性克隆中拯救与鉴定重组病毒

本文介绍了一种在小鼠中建立寨卡病毒诱导的小头畸形模型的方法。该方案包括在胚胎期、新生期和成年期对小鼠进行脑内接种寨卡病毒的技术。...

建立寨卡病毒诱导的神经系统疾病小鼠模型：采用脑内注射策略的胚胎期、新生期及成年期研究

胚胎期、新生期、成年期、脑内注射、寨卡病毒、神经系统疾病、小鼠模型

本文详细介绍了在体外培养中扩增人类胎儿脑神经干细胞的方法，以及如何将这些细胞分化为多种神经元亚型和星形胶质细胞，重点阐述了利用神经干细胞研究寨卡病毒感染的应用。...

寨卡病毒感染培养的人类胎儿脑神经干细胞用于免疫细胞化学分析

本文描述了一种用于评估Zika病毒（ZIKV）感染的Ifnar1-/-小鼠模型中免疫豁免器官内抗原特异性T细胞反应的实验方案。该方法对于研究ZIKV疫苗的细胞保护机制和免疫病理发生机制至关重要，同时也可用于评估疫苗的有效性。...

评估感染寨卡病毒的Ifnar1-/-小鼠免疫豁免器官中病毒特异性T细胞应答

我们描述了一种利用人血清、原代人细胞以及实时定量聚合酶链式反应进行感染定量的方法，用于评估针对登革病毒的预存免疫对寨卡病毒感染的影响。...

寨卡病毒在原代人细胞中抗体依赖性增强作用的定量分析

本实验方案的目的是通过从感染小鼠的多个器官中分离和定量寨卡病毒，展示研究病毒性疾病的常用技术。...

从小鼠多个器官中分离与定量寨卡病毒

在本研究中，我们描述了基于复制子和病毒酶的检测方法所采用的实验方案，用于以高通量筛选形式筛选寨卡病毒复制的抑制剂。...

高通量抗病毒检测用于筛选寨卡病毒复制抑制剂

本文展示了细胞电学阻抗（CEI）技术作为一种极为简便直接的方法，用于实时研究寨卡病毒在人细胞中的感染与复制过程。此外，CEI检测法还可用于抗病毒化合物的评估。...

基于细胞的电学阻抗平台实时评估寨卡病毒抑制剂

了解利用Vero细胞建立寨卡病毒体外培养系统的详细方法，用于研究病毒复制机制和致病机理。该技术支持大规模病毒生产，为疫苗和药物研发提供重要平台。

寨卡病毒感染性细胞培养系统及体外干扰素的预防作用

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寨卡病毒感染性细胞培养系统及 体外 干扰素的预防作用

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