寨卡病毒感染性细胞培养系统及 体外 干扰素的预防作用

本研究的总体目标是建立一种基于哺乳动物细胞的体外寨卡病毒感染性培养系统，用于研究寨卡病毒的复制过程，并利用该体外平台进行药物开发。这一逐步详述的寨卡病毒感染性细胞培养系统操作方案，有助于阐明寨卡病毒介导的疾病发病机制及病毒毒力的演化机制。该技术的主要优势在于能够实现寨卡病毒的大规模生产，从而服务于药物和疫苗的研发。

首先，在T75培养瓶中当Vero细胞密度达到80%时，吸除培养瓶中的培养基，并用2毫升磷酸盐缓冲液冲洗细胞。加入2毫升0.25%胰蛋白酶，于37摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，加入8毫升含血清的生长培养基以中和胰蛋白酶活性。随后将细胞转移至15毫升离心管中。取10微升细胞悬液，与等体积的0.4%台盼蓝混合。将制备好的混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪测定活细胞数量。将总计七百万个细胞以30毫升培养体积接种至T160培养瓶中。次日，每瓶用10毫升无血清培养基配制适当感染复数的寨卡病毒接种液。

安全操作病毒对于防止感染传播至关重要。

从T160培养瓶中移除用过的培养基，然后加入全部10毫升新鲜配制的病毒接种物。将接种后的培养瓶置于37摄氏度、5%CO2条件下孵育4至6小时。在孵育期间，每隔1小时轻轻将培养瓶侧向倾斜，以使接种物均匀分布。孵育结束后，用30毫升温热的含血清补充成分的生长培养基替换接种物。随后，继续培养病毒96小时。四天后，使用相差显微镜观察细胞单层上病毒蚀斑的形成情况，以确认感染进展。根据需要，在40倍和200倍放大倍数下拍摄图像。

在96小时时间点收集细胞培养上清液，并在4摄氏度下以300 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。离心后，小心移除上清液，避免扰动沉淀的碎片，并将其转移至15毫升离心管中。

将病毒培养上清液分装成多份，于负80摄氏度保存。

为了滴定病毒，首先将 naive Vero 细胞以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度接种到 12 孔板中，每孔体积为 2 mL。次日，使用无血清培养基对从 T160 培养瓶收集的病毒培养上清液进行 10 倍系列稀释。

在制备用于滴度测定的病毒培养上清液系列稀释液时，务必安全操作病毒，以防止感染。

接下来，从含有Vero细胞的12孔板的每个孔中移除用过的培养基，并向Vero细胞中加入400微升稀释后的接种物，每组设三个重复孔。将接种后的培养板置于组织培养孵育箱中孵育4至6小时。

孵育结束后，将接种物更换为每孔 2 毫升含血清培养基。接种后 48 小时，在适当稀释度下使用相差显微镜对病毒病灶进行计数。以每毫升空斑形成单位计算病毒滴度。

在将高滴度和低滴度的寨卡病毒接种至12孔板中的Vero细胞，并分别培养48小时和96小时后，通过定量PCR检测寨卡病毒基因组的表达，以及通过免疫细胞化学检测双链RNA，以评估基因组复制情况。

进行免疫细胞化学染色时，从12孔板的各孔中移除培养基，每孔加入1毫升甲醇。将细胞置于4摄氏度下固定30分钟。随后，用1×PBS洗涤固定后的细胞3次。然后加入封闭缓冲液，在室温下孵育1小时。将小鼠单克隆抗双链RNA抗体J2用封闭缓冲液按1:100比例稀释，加入细胞中，并在4摄氏度下于该溶液中过夜孵育。次日，将 goat anti-mouse IgG-594 二抗用封闭缓冲液按1:1,000比例稀释，在用1×PBS洗涤细胞后，加入此二抗溶液，室温孵育1小时。再次用1×PBS洗涤细胞后，使用Hoechst染料对细胞核进行染色，并在荧光显微镜下以100倍放大倍数观察细胞。

在12孔板中接种 naive Vero 细胞后6小时，按前述方法加入感兴趣细胞因子，浓度按指示设置，每个处理设两个生物学重复。处理后12小时进行寨卡病毒感染，并设置未感染的阴性对照孔。感染后4小时，将病毒接种液更换为含细胞因子的培养基，随后将细胞在37摄氏度继续孵育44小时。感染后48小时，使用相差显微镜计数病毒蚀斑，并在40倍放大倍数下获取感染细胞的代表性图像。

该图显示了通过RT-qPCR检测的寨卡病毒基因组含量。泛基因型引物和PRVABC-59毒株引物表现出相同的灵敏度和特异性。与预期一致，丙型肝炎病毒引物未扩增出任何产物。

此处展示了在指定时间点，低滴度和高滴度感染细胞中寨卡病毒的生长动力学，与未感染的模拟对照组相比的结果。免疫细胞化学检测结果显示，在感染后48小时，感染细胞呈少数簇状分布；而在感染后96小时，大多数细胞已被感染。该图表显示了与载体对照组相比，多种细胞因子对寨卡病毒生长的调节作用。

这些相差显微图像显示了经细胞因子处理或未经处理的寨卡病毒感染细胞。感染细胞形成的病毒蚀斑可见为病灶状聚集。请注意，经干扰素处理的孔中未出现病毒蚀斑。

通过该实验流程，还可开展其他方法，例如对寨卡病毒进行高分辨率结构域定位，以研究其在蚊子和人类细胞中的病毒蛋白定位与复制，从而回答更多科学问题，如阐明疾病致病机制以及病毒毒力的演化过程。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立基于哺乳动物细胞的体外寨卡病毒感染培养系统，用于研究寨卡病毒的复制机制，以及如何利用该体外平台进行药物和疫苗的研发。