用于微胶囊化应用的植物基胶囊提取

本实验的总体目标是建立一种高效的流程，用于提取孢粉素外壁胶囊（Sporopollenin Exine Capsules，简称SECs），以应用于微胶囊化。该方法能够快速获得洁净的微载体，适用于食品和医疗健康领域。该技术的主要优势在于，可显著缩短SECs的提取时间，从而制备出洁净且结构完整的SECs。

尽管该方法可用于深入了解简化的SEC提取过程以及逐步的详尽表征，也可用于探索不同植物源性生物材料的基本微观结构与形貌评价。通常，初次接触该方法的人员会因传统的8至10天提取过程而遇到困难，该过程涉及在高温下使用强腐蚀性酸。开始此操作前，需在通风橱中搭建回流装置，包括玻璃冷凝管、水循环系统和水浴锅。

由于SEC提取过程涉及使用强腐蚀性酸和有机溶剂，因此应佩戴适当的个人防护装备（如护目镜、实验服、面罩和手套），并进行危险警示。小心称取100克L. clavatum孢子，避免产生粉尘，并远离任何点火源。然后，将孢子缓慢转移至一个装有磁力搅拌子的一升PTFE圆底烧瓶中。

向孢子中加入 500 毫升丙酮，轻轻摇动烧瓶以形成均匀的悬浮液。将烧瓶置于设定为 50 摄氏度并连接回流冷凝器的水浴中。在 200 转/分钟搅拌条件下，加热悬浮液回流 6 小时。

将悬浮液在室温下冷却后，使用滤纸在减压条件下进行过滤，并将脱脂后的孢子收集到大型玻璃培养皿中。用带有小孔的铝箔覆盖培养皿，使溶剂挥发，于室温下干燥孢子。将干燥后的脱脂孢子转移至1升的聚四氟乙烯（PTFE）烧瓶中，加入500毫升85%的磷酸溶液。

将烧瓶置于70摄氏度的水浴中，并连接回流冷凝管。在搅拌下加热悬浮液回流30小时。待悬浮液冷却至室温后，加入500毫升温热的去离子水稀释，通过滤纸抽滤收集SECs。

随后，将SECs转移至一个三升玻璃烧杯中，进行一系列洗涤。在通风橱中，向SECs中加入800毫升热的去离子水，轻轻搅拌10分钟。然后，在真空条件下使用滤纸过滤该悬浮液。

将SECs转移至一个洁净的三升玻璃烧杯中。重复前述步骤五次后，向SECs中加入600毫升热丙酮，轻轻搅拌10分钟。通过真空过滤收集SECs，并将其转移至另一个洁净的三升玻璃烧杯中。

用适当的溶剂重复前述步骤后，将清洁的 SEC 转移至六个大的玻璃培养皿中，在室温下于通风橱内干燥 24 小时，以彻底去除水分。接着，在真空度为 1 毫巴、温度为 60 摄氏度的真空烘箱中干燥 SEC 10 小时，或直至恒重。然后，将干燥后的 SEC 转移至聚丙烯瓶中，于干燥柜中保存。

在去离子水中配制 1.2 毫升牛血清白蛋白（BSA）溶液，并转移至 50 毫升聚丙烯管中。向 BSA 溶液中加入 150 毫克 SECs。涡旋振荡混合物 10 分钟，以形成均一溶液。

用滤纸覆盖试管后，将其转移至冷冻干燥瓶中，在1毫巴真空条件下干燥4小时。待负载BSA的SEC干燥后，使用研钵和研杵去除团聚物。随后将负载BSA的SEC转移至50毫升离心管中，并加入2毫升去离子水以去除残留的BSA。

通过离心收集SECs，4,704 ×g 离心5分钟。离心结束后，弃去上清液。用去离子水重复洗涤。

随后，用滤纸覆盖装有BSA的SEC管。然后将SEC转移至冷冻机中冷冻1小时。将SEC冷冻干燥24小时。

将SECs储存于冰箱中，直至进一步表征。取五毫克载有BSA的SECs放入一个两毫升的聚丙烯管中，加入1.4毫升PBS，涡旋振荡五分钟。

随后，以40%的振幅对悬浮液进行探头超声处理，每次10秒，共3个循环。完成后，使用0.45微米聚醚砜滤膜过滤溶液。在对空白SECs完成上述步骤后，以空白SECs作为对照，于280纳米处测定BSA载药SECs的吸光度。

最后，使用PBS中的BSA标准曲线定量包封的BSA含量。扫描电镜图像显示完整的孢子具有独特的微结构，横截面图像中可观察到加工前的微米级孢原质细胞器。经过孢子脱脂和碱处理后，未观察到形态学和结构上的变化。

酸解后的扫描电镜图像显示，完整的孢子外壁细胞（SECs）中缺乏孢质材料。通过CHN分析发现，脱脂及碱处理的SECs中未观察到大量蛋白质类物质的去除。大部分蛋白质类物质在酸解过程中被去除。

DIPA 分析显示，SEC 经酸解长达 30 小时后仍具有均匀的尺寸分布。随着酸解时间延长，SEC 的结构完整性下降。SEM 和 DIPA 数据表明，在脱脂步骤后，酸解可产生结构完整且尺寸分布均匀的 SEC。

CLSM 数据显示，未经处理的 SECs 因孢子腔内孢质成分的存在而表现出自发荧光。仅经过酸解处理后，所有孢质内容物均被去除。在包封 FITC-BSA 后，可在 SECs 内部观察到绿色荧光。

扫描电镜图像显示，在载入 BSA 后，微柱结构保持完整。将 BSA 载入 SEC 后，其直径、圆形度和长径比未观察到显著变化。对包封 SEC 中的 BSA 进行定量分析，证实微胶囊化过程具有一致性，每克 SEC 可载入 0.170 ± 0.01 克 BSA。

一旦掌握，若操作得当，这种简化的SEC提取过程可在48小时内完成。在对不同植物孢子和花粉尝试该方法时，需牢记逐步进行结构、形态及元素分析，以获得完整且洁净的囊体。在此基础上，可进一步采用涉及碱性酶的其他提取方法，以验证优化后流程在多种植物源性囊体提取中的可行性。

该技术发展之后，为从事微胶囊化、药物递送和组织工程领域的研究人员探索多种基于植物的孢粉素微胶囊（SECs）作为新一代生物材料铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从植物孢子和花粉颗粒中提取并表征SECs，以及如何将药物和生物大分子封装到SECs中。