A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

该方案的总体目标是使用显微镜分析丝状菌丝上细菌生物膜的形成。这种方法可以帮助回答微生物学领域的关键问题，例如细菌生物膜是如何在菌丝上形成的，它们的特异性如何，以及它们是由什么组成的。该技术的主要优点是它允许在从纳米到厘米范围的多个尺度上研究真菌菌丝上细菌生物膜的形成。

我实验室的 Cora Miquel Guennoc 和 INRA PTEF 平台的电子显微镜工程师 Christophe Rose 将演示该程序。首先，准备与培养皿直径相同的玻璃纸膜，然后将它们放入沸腾的 EDTA 中 30 分钟。然后用去离子水冲洗床单并高压灭菌两次。

为了制备真菌预培养物，将真菌接种在琼脂培养基上，用 EDTA 预处理的玻璃纸膜覆盖。在最佳温度下孵育培养物，以获得直径约为 1 厘米的菌落。从预培养物中，用手术刀轻轻刮擦预培养菌落的外部区域，然后将菌丝转移到琼脂平板上，接种适当的琼脂培养基培养皿，上面覆盖着 EDTA 玻璃纸膜，然后将菌丝转移到琼脂平板上。

在最佳温度下孵育板，直到菌落直径约为 1 厘米。为了制备细菌培养物，例如 P.fluorescens BBc6，使用无菌环从琼脂培养基中收集 2 到 3 个单独的细菌菌落，并接种 25 毫升 LB。将培养物在最佳温度下孵育过夜。细菌生长过夜后，将培养物以 5， 000 次 g 离心 3 分钟。

然后将沉淀悬浮在 25 毫升无菌 0.1 摩尔磷酸钾缓冲液中。重复离心后，使用相同的缓冲液将最终细菌浓度调节至每毫升 10 至第 9 个细胞。用 5 毫升细菌悬浮液填充六孔微孔板。

使用无菌剃须刀片将真菌培养物的玻璃纸膜切成正方形，每个膜上有一个菌落。然后，用镊子小心地从固体培养基中取出含有菌丝的玻璃纸方块，并将它们转移到细菌悬浮液的各个孔中。轻轻摇动微孔板，直到真菌菌落从玻璃纸上分离。

然后去除玻璃纸片，将真菌菌落留在板中。将微孔板在 20 摄氏度下轻轻搅拌孵育一段时间，具体取决于所使用的菌株和要分析的阶段。对于荧光假单胞菌 BBc6 RA 双色乳杆菌，将培养物孵育 30 分钟以获得早期生物膜，对于成熟生物膜，孵育长达 16 小时。

要去除浮游细菌和静电附着在菌丝上的细菌，请将其转移到装有强盐溶液的新六孔微孔板中，以冲洗真菌。轻轻摇晃板 1 分钟。将真菌转移到含有 5 毫升无菌 0.1 摩尔磷酸钾缓冲液的新 6 孔微孔板中。

轻轻摇动板 2 分钟，然后将真菌转移到新鲜缓冲液中。在保持真菌菌落处于缓冲状态的同时，用手术刀将菌落大约切成两半。将一半待染色的菌落转移到含有 1 毫升无菌水的培养皿中，并补充适当的荧光染料以观察真菌网络，例如与 Alexa Fluor 633 偶联的小麦胚芽凝集素。

然后在黑暗中孵育样品。染色后，将样品转移到装有 10 mL 无菌 0.1 摩尔磷酸钾缓冲液的培养皿盖上，冲洗样品，然后轻轻摇晃 1 分钟。将载玻片半浸入培养皿盖中，然后小心地将切割部分置于载玻片上方。

然后慢慢地从缓冲溶液中提起载玻片，让样品轻轻地沉淀在载玻片上。最精细的方面是样品在载玻片上的位置。为避免生物膜描述，在定位样品时必须浸入样品和载玻片，并且在成像前不得再移动样品。

最后，向样品中加入 10 微升防褪色封固剂，并用玻璃盖玻片盖住。在具有 10 倍或 40 倍物镜的共聚焦激光显微镜下检查载玻片。使用平铺扫描和 Z 轴堆栈功能的组合来获得真菌菌落和生物膜的全局 3D 视图。

为了进行电子显微镜检查，像以前一样在强盐溶液中冲洗真菌后，将真菌转移到无菌水而不是缓冲液中，以防止在脱水步骤中形成盐晶体。将生物膜转移到样品架上，并去除多余的水。然后，将样品转移到变压扫描电子显微镜的腔室中。

在 Peltier 冷却台上，将样品冷冻至负 50 摄氏度，使其直接在 SEM 室中缓慢冷冻干燥，设置 100 帕斯卡的可变压力 15 小时。取回样品并将其转移到高真空薄膜沉积系统中。然后在氩等离子体下用 2 纳米铂包被样品。

用扫描电子显微镜观察涂层样品，使用高分辨率镜头内检测器的场发射枪和 1 kV 的电子高压。这种生物膜的中观尺度分析表明，绿色的荧光假单胞菌 BBc6 的生物膜在双色 L.bicolor S238N 的菌丝上呈异质分布，以红色显示。该分析还使追踪生物膜随时间的形成成为可能，从只有一些 GFP 标记的细菌附着在菌丝上的早期步骤（以红色显示）到形成厚而成熟的生物膜。

如图所示，高分辨率的中尺度图像也被用于进行微观分析，以获得菌落结构。此外，在 3D 共聚焦图像的高分辨率 2D 最大强度投影中，使用 SYPRO Ruby 进行特异性标记（以红色显示）表示基质中存在蛋白质，GFP 标记的 BBc6 细菌和 FUN-1 标记的真菌为深绿色。对同一样品进行脱水和编码后，通过 SEM 成像获得生物膜结构的更多细节。

绿色箭头指向生物膜中的细菌细胞，黄色箭头指向真菌菌丝。一旦掌握，这项技术可以在大约两个半小时内完成一个样品，这还不包括生物膜形成和微生物培养的孵育时间。在尝试此过程时，重要的是要记住，该方法的成功在很大程度上取决于获得非常薄的真菌菌落的能力，这些菌落仅由几层菌丝组成。

在此程序之后，其他方法（例如诱变或原位杂交）可用于回答其他问题，例如生物膜的功能或化学表征，或研究多物种生物膜。开发后，这项技术为医学、环境科学、食品工业等多个领域的研究人员探索真菌细菌相互作用过程中生物膜的形成铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何在真菌菌丝上生长和分析细菌生物膜的形成有一个很好的了解。