Name: 三维超F-微丝高分辨率显微镜通过干涉光敏定位显微镜（iPALM） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学习使用干涉光敏定位显微镜（iPALM）技术对贴壁哺乳动物细胞中的肌动蛋白细胞骨架进行三维超分辨率成像。该方法可实现纳米级分辨率的细胞超微结构可视化，为细胞生物学研究提供高特异性标记的详细实验方案。

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YW 和 PK 感谢新加坡国家研究基金会为 PK 提供的资金支持（NRF-NRFF-2011-04 和 NRF2012NRF-CRP001-084）。我们还感谢 MBI 开放实验室和显微镜核心设施在基础设施方面提供的支持。

1. 成像样本制备
<ol>
	<li>由于背景荧光信号会干扰荧光标记物的荧光信号，首先用去离子水（ddH2O）冲洗盖玻片，然后使用压缩空气吹干。随后在等离子清洗机中进行等离子刻蚀处理15秒，必要时可延长处理时间。</li>
	<li>为实现漂移校正和iPALM校准，请使用嵌有荧光纳米颗粒的#1.5圆形（直径22 mm）预清洁盖玻片作为定位标记，这些荧光纳米颗粒可作为高度光稳定的参照标记，用于可靠的校准和漂移校正。由于需要较长的采集时间以积累足够的荧光分子密度（&#62; 15–30分钟），样品漂移不可避免。</li>
	<li>将每片带标记的盖玻片放入6孔组织培养板中，在超净工作台中用紫外线（UV）照射15分钟进行灭菌。</li>
	<li>在无菌超净工作台中，通过将1 mg/ml的纤连蛋白储备液用无菌的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释至终浓度为2–10 µg/ml，制备用于包被盖玻片的纤连蛋白溶液。每片盖玻片用DPBS冲洗三次，加入2 ml纤连蛋白溶液，于4 °C孵育过夜。随后吸除纤连蛋白溶液，并用DPBS冲洗一次。</li>
	<li>用DPBS短暂冲洗细胞。加入1–2 ml胰蛋白酶，在37 °C孵育数分钟，直至细胞脱落，然后加入约10 ml含新鲜血清的细胞培养基终止反应。例如，对于人脐静脉内皮细胞（HUVEC），使用添加了大血管内皮因子以及青霉素或链霉素的大血管内皮细胞培养基。
	<ol>
		<li>将细胞重新接种至纤连蛋白包被的盖玻片上（若需低密度接种，每片盖玻片接种&#60; 50,000个细胞），并在设定为95%湿度、5% CO2、37 °C的培养箱中继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为有效保存F-肌动蛋白细胞骨架的精细结构，应使用基于Good's缓冲试剂的缓冲液27。
	<ol>
		<li>例如，配制PHEM缓冲液作为2倍储备液（120 mM PIPES、50 mM HEPES、20 mM EGTA、4 mM MgCl2，用KOH调节pH至7.0）：将6.5 g HEPES、3.8 g EGTA和190 mg MgCl2溶解于约300 ml ddH2O中，逐滴加入浓KOH溶液调节pH至7.0；然后加ddH2O定容至500 ml。使用0.22 µm滤器过滤除菌，4 °C保存，使用前用ddH2O按1:1稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为实现F-肌动蛋白的高密度标记最佳效果，建议使用与有机荧光染料（如Alexa Fluor 647）偶联的鬼笔环肽。在细胞重铺后的目标时间点，按以下步骤固定细胞：
	<ol>
		<li>吸除含细胞样本的培养孔中的培养基。迅速而轻柔地加入2 ml预热（37 °C）的提取固定液（含0.25%戊二醛和0.25% Triton X-100的PHEM缓冲液），室温孵育1–2分钟。后续步骤中，每片盖玻片使用2 ml固定液或淬灭缓冲液，除非另有说明。</li>
		<li>将提取固定液替换为含2.5%戊二醛的PHEM缓冲液，样本继续孵育10–12分钟。此步骤及后续所有步骤均在室温下进行。</li>
		<li>吸除固定液，轻柔地替换为PHEM缓冲液。倾斜并轻轻摇晃，再用PHEM缓冲液清洗一次。重复两次。</li>
		<li>为淬灭戊二醛引起的自体荧光（该荧光可能掩盖目标荧光信号），将样本与新鲜配制的含0.1%质量浓度NaBH4的PHEM淬灭缓冲液孵育。此时会观察到大量气泡。可偶尔轻敲样品皿以去除气泡。孵育5–10分钟。</li>
		<li>吸除淬灭缓冲液，轻柔地替换为PHEM缓冲液。多次冲洗以清除气泡。加入2 ml PHEM缓冲液，避光孵育5分钟。重复两次，完成后让样本保留在PHEM缓冲液中。</li>
		<li>使用一个较大的塑料培养皿制备用于鬼笔环肽孵育的湿盒：在皿底垫一张滤纸，并用5–10 ml ddH2O充分润湿，然后在湿润滤纸上放置一张干净的Parafilm膜。</li>
		<li>由于标记的鬼笔环肽成本较高，每份标记应使用较小体积。为实现高密度标记，起始浓度建议为0.3 µM。使用鬼笔环肽-Alexa Fluor 647溶于PHEM缓冲液中，每片盖玻片准备约60 µl。</li>
		<li>将55–60 µl鬼笔环肽溶液滴加至湿盒内的Parafilm膜上。使用精细镊子轻柔取出样本盖玻片，注意辨认含细胞的一面。</li>
		<li>用折叠的柔软吸水纸轻触盖玻片边缘，快速而轻柔地吸除多余缓冲液，然后将盖玻片细胞面朝下放置于Parafilm膜上的鬼笔环肽液滴上，确保盖玻片下无气泡残留。</li>
		<li>盖上湿盒盖子，用铝箔包裹以避光，于4 °C孵育过夜。样本可在该条件下保存数天。若计划长期储存，需确保湿盒保持湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像前，将盖玻片细胞面朝上轻柔地放入新的6孔板中，每孔加入2 ml PHEM缓冲液。</li>
	<li>使用以下储备液配制除氧的巯基成像缓冲液：1 M葡萄糖、1 M半胱胺、100倍葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶酶混合液（将4 mg过氧化氢酶和10 mg葡萄糖氧化酶溶于100 µl PHEM缓冲液中，充分涡旋混匀）28。成像前，取75 µl 1 M葡萄糖溶液、30 µl 1 M半胱胺溶液和3 µl 100倍酶混合储备液混合，用PHEM缓冲液定容至300 µl，混匀后立即用于样本封片。</li>
	<li>对于iPALM成像，使用预清洁的#1.5盖玻片（直径22 mm）制备成像样本。
	<ol>
		<li>或者，若使用基于像散的3D-STORM12技术，可使用载玻片（3&#34; × 1&#34;）并配合双面粘性间隔片以辅助组装。</li>
		<li>组装成像样本时，使用精细镊子从缓冲液孔中轻柔取出样本盖玻片，然后用折叠的吸水纸轻触边缘，快速而轻柔地吸除多余缓冲液。</li>
		<li>将盖玻片细胞面朝上放置于一张干净的镜头纸上。通过在样本上滴加30–50 µl成像缓冲液进行冲洗，并通过倾斜和轻拍吸水纸去除多余液体。</li>
		<li>重复冲洗数次后，在样本上滴加30–50 µl成像缓冲液。用吸水纸吸干盖玻片边缘，然后在干燥区域点加数个极小的快干环氧树脂点。</li>
		<li>缓慢将另一片预清洁的#1.5盖玻片（无涂层圆形盖玻片，直径18 mm）中心对准含细胞的22 mm盖玻片中心放下，使成像缓冲液通过毛细作用浸润两片盖玻片。快干环氧树脂的小点应同时粘附于两片盖玻片。</li>
		<li>用折叠的吸水纸轻压组装好的样本，使压力均匀分布。施加足够压力使样本厚度均匀且极薄（&#60; 15 µm），但避免压碎细胞。通过观察牛顿环图案判断合适厚度。同时，操作应轻柔以尽量减少气泡产生。必要时，可先用空白盖玻片多次练习。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用熔化的凡士林-羊毛脂-石蜡混合物（VALAP，储备液由各100 g的凡士林、羊毛脂和石蜡共同熔化制得）密封样本29，用ddH2O冲洗密封后的样本，并用压缩空气吹干。样本现已准备好用于显微镜成像。</li>
</ol>
2. 样品放置与iPALM对准
<ol>
	<li>移动弹簧加载的顶部物镜向上，以便取出样品 holder。将步骤 1.10 中制备好的密封样品放置在样品 holder 上，并用若干小块稀土磁铁固定。在成像样品的两侧涂抹浸油。将样品 holder 重新放回光路中，并缓慢放下顶部物镜。</li>
	<li>打开激发激光器。以帧转移模式启动电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机。
	<ol>
		<li>旋入合适的发射滤光片。激活机械快门以阻断顶部光路（图 1A），并打开底部光路。通过压电驱动器以微小步进移动，使底部物镜聚焦。</li>
		<li>当定位标记（fiducial）清晰聚焦后，打开顶部光路，同时阻断底部光路，并以类似方式调节顶部物镜至聚焦状态。通过计算机显示屏监测定位标记的宽度，以获得最佳聚焦效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为实现准确居中，同时打开顶部和底部光路。在保持底部物镜位置不变的前提下，使用一对微调固定螺钉手动调节顶部物镜，直至两个物镜的定位标记图像尽可能重叠，理想情况下应在一个 EMCCD 像素范围内。
	<ol>
		<li>随后进行精细调节，使步骤 2.3 中的定位标记图像重叠误差控制在 EMCCD 像素的十分之一以内。在保持两个物镜及底部反射镜位置不变的前提下，通过控制软件调节顶部的二维压电驱动反射镜。通过计算机显示屏比对顶部与底部物镜视图中定位标记的中心位置，以指导调节过程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. iPALM 装置的校准
注意：由于荧光发射是非相干的，为了在iPALM中观察到干涉现象，通过顶部和底部物镜的光程必须非常接近，差异需控制在几微米以内。可通过以下方式实现：
<ol>
	<li>打开激光器，相机持续成像，同时保持上下光路开放，通过控制软件生成的正弦电压波形驱动样品台z轴压电陶瓷，使样品在z轴方向持续振荡，振幅为400 nm。</li>
	<li>利用信标光强在非最佳对准状态下随振荡变化较小的特点，手动上下平移电动分束器组件，直至信标光强因期望的单光子干涉效应而出现振荡。这表明光程长度已接近匹配。峰谷比为 &#62; 在理想情况下可达到10（图1D).</li>
	<li>为确保每个表面的振幅和相位在视场内尽可能均匀，需逐步微调分束器组件的底部反射镜，以精确调节间隙和倾斜角度。通过在800 nm范围内以8 nm的z步长移动样品，完成分束器的精细对准。
	<ol>
		<li>监测相机 #1 至 #3 之间的基准标记强度。微调分束器组件中底部反射镜的高度、位置和倾斜角度，使相机 #1 相对于相机 #2 的振荡相位达到最大，理想情况下为 120°（图1B-D).</li>
		<li>初始对齐完成后，移动样品以寻找包含待成像细胞及附近多个基准标记的合适视野。在系统周围放置遮光罩，以屏蔽杂散光和环境干扰。找到成像区域后，再次执行步骤3.4中的操作，并使用以下命令记录校准曲线，用于后续的z坐标提取 &#34;获取校准扫描与样品压电位置的关系&#34; 在主界面中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据采集
<ol>
	<li>找到目标区域并获得校准曲线后，将相应的文件名输入软件中。打开上光路和下光路。将642 nm激光的激发功率调至最大。对于Alexa Fluor 647，可能需要一段初始的荧光分子关闭期（图2A）。
	<ol>
		<li>使用642 nm激光持续激发5分钟，或根据需要更长时间，直至观察到单分子闪烁现象（图2B）。软件可在采集过程中自动增加405 nm光激活强度。通常需要采集大量帧数，才能使丝状结构清晰可见（&#62; 50,000帧）。准备就绪后，在主界面中使用“&#34;开始iPALM采集&#34;”命令，启动原始图像集的采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集过程中，通过调节405 nm激光的强度，优化光激活水平，以维持适当的闪烁分子密度（参见图2B中的示例）。 
	注意：采集完成后，软件将自动把图像文件转换为正确的二进制格式。计算服务器中的数据存储库以网络驱动器形式挂载，可直接将数据复制至此处，用于后续处理。</li>
</ol>
5. 数据处理与分析
<ol>
	<li>使用自主开发的软件进行定位分析，以提取所有单分子及定位标记物的最佳拟合参数11,15,23这不仅可得到x、y坐标，还可获得用于校准曲线分析的强度值。
	<ol>
		<li>使用以下命令导入步骤 3.5 中获取的原始校准数据 &#34;提取多个标签的峰&#34; 在……之下 &#34;文件&#34; 菜单执行单分子定位。初始定位分析完成后，相机#1至#3获得的坐标分别显示在红色、绿色和蓝色通道中，可使用以下命令保存以供进一步分析 &#34;保存为 IDL (.sav) 格式&#34; 在……之下 &#34;文件&#34; 菜单</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用盖玻片上嵌入的荧光标记物将相机#1 - 3的图像数据进行配准，选择多个明亮的标记物以覆盖中央图像区域例如， 图1B）使用命令 &#34;锚定基准点&#34; 在……之下 &#34;图像变换&#34; 菜单。使用步骤5.1中从相机#1至#3获取的亮标记点的三组定位坐标，计算旋转与缩放矩阵，使相机#1和#3与相机#2对齐。当标记点数量足够多时，可进行高阶多项式扭曲校正以获得更优的配准效果。</li>
	<li>一旦计算出变换矩阵，将相机#1至#3的原始数据共同变换，得到叠加后的原始数据。再进行一轮定位分析，以获得更精确的x、y坐标，并确定每个相机通道对叠加原始数据的相对贡献；使用以下命令 &#34;转换原始数据，保存并保存总和（.dat）&#34; 在……之下 &#34;图像变换&#34; 菜单。该强度比值包含 z 坐标信息。</li>
	<li>选择一个明亮的参考标记，并使用该函数进行z轴校准拟合 &#34;测试风点 3D&#34; 在弹出的对话框中单击 &#34;Z坐标操作&#34; 在……之下 &#34;特殊功能&#34; 菜单。该功能将对三个相机通道的强度拟合三正弦函数，以确定校准曲线。校准文件随后将被保存，供后续在主数据集上使用。</li>
	<li>为检验校准曲线的质量，按照之前所述方法进行 z 坐标提取23对于性能良好的标记点和校准良好的系统，z 坐标应呈线性变化，因为校准数据集是在 z 位置线性扫描下采集的。此外，所有标记点的 z 位置应具有相似的斜率。</li>
	<li>一旦获得满意的校准结果，对第4步中获取的原始图像数据集执行定位和变换分析，操作流程与5.1–5.3步骤中所述相同。完成后，加载第5.4步中的校准文件，并使用相应函数进行z坐标提取 &#34;选择 WND 文件&#34; 和 &#34;提取Z坐标&#34; 在弹出的对话框中单击 &#34;Z坐标操作&#34; 在……之下 &#34;特殊功能&#34; 菜单 
	注意： 由于采集时间是 &#62; 15 分钟内，可预期发生机械漂移。</li>
	<li>为进行x、y方向的漂移校正，需从定位坐标中选择一个明亮的参照标记点，该标记点应在所有帧中均存在。随后，利用该参照标记点在x、y坐标上的漂移量，将同一帧中所有其他坐标重新对齐至匹配位置。图3A-B) 使用该函数 &#34;测试/写入导星&#34; 在……之下 &#34;图像变换&#34; 菜单。通过访问菜单，可以类似地执行Z坐标配准。 &#34;测试导星&#34; 和 &#34;撰写指南星&#34; 单击弹出对话框中的功能 &#34;Z坐标操作&#34; 在……之下 &#34;特殊功能&#34; 菜单</li>
	<li>由于样品可能存在轻微倾斜，需通过提供定义应调平平面的3个参考点的x、y、z坐标，使用该函数进行倾斜校正 &#34;移除 XYZ 倾斜&#34; 在弹出的对话框中单击 &#34;Z坐标操作&#34; 在……之下 &#34;特殊功能&#34; 菜单</li>
	<li>在完成漂移和倾斜校正后，保存定位坐标。重建超分辨率图像以进行后续分析（图4A-D）通过使用 &#34;渲染&#34; 在主界面上执行命令。颜色可用于表示 z 坐标。此外，也可渲染所选区域的侧视图。定位坐标可导出为文本文件以进行进一步量化，或保存重构图像为 .tif 文件。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

iPALM 的光学系统基于一种 4-π 双对置物镜设计，如图 1A所示。该装置由定制加工和商用的光学机械部件构成，具体如前文所述23，并列于表 1中。除本装置外，霍华德·休斯医学研究所（HHMI）在珍利亚研究园区的先进成像中心也设有可供科学界使用的系统。如需完整的机械图纸、控制示意图和软件，建议读者向 HHMI 的哈拉尔德·黑斯（Harald Hess）进一步咨询。使用 iPALM 及其他单分子定位显微技术对 F-肌动蛋白进行成像的一个主要优势在于，与电子显微镜（EM）技术相比，样品制备相对简便；EM 技术通常需要剧烈的样品处理、繁琐的制备流程以及经验丰富的操作人员3,23。此外，荧光天然适用于多通道成像，而这一点在 EM 中仍难以实现。然而，如下文将进一步阐述的，该方法在样品制备和成像过程方面仍存在若干当前局限性。首先，与 EM 样品制备类似，必须注意确保样品超微结构的良好保存35，因为适用于衍射极限分辨率水平的实验方案可能在纳米尺度上引起严重扰动。对于肌动蛋白成像而言，细胞的适当固定是影响样品质量的重...

复杂细胞结构的可视化长期以来一直是生物学认知与发现的重要组成部分。尽管荧光显微镜能够以高分子特异性对细胞进行成像，但其分辨率受衍射限制，在成像平面（x、y 或横向维度）约为 200 nm，沿光轴方向（z 或轴向维度）则小于&#62; 500 nm1,2。因此，超微结构特征的观察在历史上仅限于电子显微镜（EM）。幸运的是，近年来超分辨率显微技术的发展突破了这一限制，实现了 10 - 100 nm 范围的空间分辨率1-6。特别是基于单分子定位的超分辨率方法，其缩写包括 PALM（光激活定位显微镜）4、FPALM（荧光光激活定位显微镜）5、(d)STORM（直接随机光学重建显微镜）6,7、PAINT（用于成像纳米级形貌的点累积技术）8、GSDIM（基态耗尽显微镜后接单分子返回）9 和 SMACM（单分子主动控制显微镜）10，以及它们的三维（3D）实现形式，如干涉 PALM（iPALM）11 或 3D-STORM12，在揭示多种生物结构的纳米级组织方面提供了重要的新见解，包括神经元轴突和突触13、黏着斑14,15、细胞间连接16、核孔17 和中心体18-20 等。
细胞中另一个可能适用于超分辨率显微镜研究的超微结构是肌动蛋白细胞骨架。细胞皮层中复杂的丝状（f-）肌动蛋白网状结构在调控细胞形态和机械特性方面发挥着至关重要的作用21。f-肌动蛋白的组织结构受到多种调控蛋白的主动且动态的调节，这些蛋白显著影响肌动蛋白的聚合、交联、周转、稳定性以及网络拓扑结构22。然而，尽管对f-肌动蛋白网状结构的表征对于深入理解多种细胞过程的机制至关重要，但由于f-肌动蛋白丝的尺寸较小（约8 nm），传统受衍射极限限制的光学显微镜难以对其进行观察；因此，肌动蛋白精细结构的可视化迄今主要依赖电子显微镜（EM）来完成。本文中，我们描述了利用iPALM超分辨率显微技术在贴壁哺乳动物细胞中可视化f-肌动蛋白细胞骨架的实验方案，以充分利用其在三维空间中的极高定位精度11,23。尽管iPALM仪器高度专业化，但近期已有文献详细介绍了该仪器的搭建方法23，同时霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）提供的iPALM显微镜也已向科研界开放使用，且使用成本极低。此外，本文所述的样品制备方法可直接适用于其他更为广泛可用的三维超分辨率成像技术，例如基于点扩散函数（PSF）的散光离焦方法12或双平面探测技术24。
通常，基于单分子定位的超分辨率显微镜技术的一个必要条件是使用可光转换荧光染料25，它能够满足该技术的三个关键要求：i）单分子的亮度和对比度相对于背景信号足够高；ii）在给定图像帧中单分子呈稀疏分布；iii）标记具有足够高的空间密度，以准确捕捉底层结构的形态特征（也称为奈奎斯特-香农采样准则）26。因此，为了获得满意的结果，必须同等重视样品的适当制备（以优化荧光染料的光转换性能并保持底层超微结构的完整性）以及实验中的仪器设置和数据采集环节。

<table><tbody><tr><td>光学平台</td><td>Newport, CA</td><td>RS4000</td><td>iPALM，安装在4个Newport Stabilizer减振器上</td></tr><tr><td>光学平台用减振器</td><td>Newport, CA</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>642 nm激光器</td><td>Newport, CA</td><td>1185055</td><td>输出功率=100 mW</td></tr><tr><td>561 nm激光器</td><td>Newport, CA</td><td>1168931</td><td>输出功率=200 mW</td></tr><tr><td>488 nm激光器</td><td>Newport, CA</td><td>1137970</td><td>输出功率=200 mW</td></tr><tr><td>405 nm激光器</td><td>Newport, CA</td><td>1142279</td><td>输出功率=100 mW</td></tr><tr><td>宽带介质镜</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>BB1-E02</td><td>激光合束器</td></tr><tr><td>二向色分光镜</td><td>Semrock, NY</td><td>LM01-427-25</td><td></td></tr><tr><td>声光可调滤波器</td><td>AA Opto-Electronic, France</td><td>AOTFnC-VIS-TN</td><td></td></tr><tr><td>线性偏振片</td><td>Newport, CA</td><td>05LP-VIS-B</td><td></td></tr><tr><td>基板</td><td>本地车间</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>转向镜（22.5&amp;deg;）</td><td>Reynard Corpporation, CA</td><td>定制</td><td>22.5&amp;deg;反射镜</td></tr><tr><td>电动光学支架</td><td>New Focus, CA</td><td>8816</td><td></td></tr><tr><td>电动XYZ平移台</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>MT3/M-Z6</td><td>样品支架</td></tr><tr><td>T-Cube直流伺服电机控制器</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>TDC001</td><td></td></tr><tr><td>压电相位移位器</td><td>Physik Instrumente, Germany</td><td>S-303.CD</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Nikon, Japan</td><td>MRD01691</td><td>物镜，Apo TIRF 60X/1.49 油浸</td></tr><tr><td>平移台</td><td>New Focus, CA</td><td>9062-COM-M</td><td></td></tr><tr><td>皮秒电机执行器</td><td>New Focus, CA</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>旋转电磁阀/快门</td><td>DACO Instruments, CT</td><td>5423-458</td><td></td></tr><tr><td>三分束器</td><td>Rocky Mountain Instruments, CO</td><td>定制</td><td>分束器</td></tr><tr><td>压电Z/倾斜/偏转扫描器</td><td>Physik Instrumente, Germany</td><td>S-316.10</td><td></td></tr><tr><td>电动五轴倾斜对准器</td><td>New Focus, CA</td><td>8081</td><td></td></tr><tr><td>Picmotor以太网控制器</td><td>New Focus, CA</td><td>8752</td><td></td></tr><tr><td>压电控制器/放大器/数字操作模块</td><td>Physik Instrumente, Germany</td><td>E-509/E-503/E-517</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-523/20</td><td>滤光片</td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-588/21</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-607/30</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-676/37</td><td></td></tr><tr><td>陷波滤光片</td><td>Semrock, NY</td><td>NF01-405/488/561/635</td><td></td></tr><tr><td>带控制器的电动滤光轮</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>FW103H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>Andor, UK</td><td>DU-897U-CSO-#BV</td><td>3套</td></tr><tr><td>用于控制相机和同步的台式计算机</td><td>Dell</td><td>Precision T3500</td><td>PC，4套</td></tr><tr><td>带定位标记的盖玻片</td><td>Hestzig, VA</td><td>600-100AuF</td><td>样品制备，提供不同密度和光谱的定位标记</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Millipore, MT</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences, PA</td><td>15710</td><td>固定剂，16%</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences, PA</td><td>16220</td><td>25%</td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC细胞</td><td>Life Technologies, CA</td><td>C-015-10C</td><td></td></tr><tr><td>Medium 200培养基</td><td>Life Technologies, CA</td><td>M-200-500</td><td></td></tr><tr><td>大血管内皮细胞生长因子</td><td>Life Technologies, CA</td><td>A14608-01</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td></td><td>14190367</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td></td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life Technologies, CA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>P1851</td><td>PHEM缓冲液组分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>1st base, Malaysia</td><td>BIO-1825</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore, MT</td><td>5985</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647鬼笔环肽</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A22287</td><td>染色</td></tr><tr><td>硼氢化钠（NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>480886</td><td>淬灭</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>1st base, Malaysia</td><td>BIO-1101</td><td>成像缓冲液组分</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>半胱胺</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>G14250</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>16415</td><td>样品封片</td></tr><tr><td>羊毛脂</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>Electron Microscopy Sciences, PA</td><td>16915-04</td><td>成像，Cargille HF型</td></tr></tbody></table>

通过干涉光激活定位显微镜（ipalm）对f-actin丝进行三维超分辨率成像

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

荧光显微镜能够直接观察细胞内特定的生物分子。然而，传统的荧光显微镜受衍射限制，其成像平面内的空间分辨率约为 200 nm，沿光轴方向则低于 &#62; 500 nm。因此，长期以来荧光显微镜在观察细胞内超微结构特征方面受到严重限制。近年来发展的超分辨率显微技术已克服了这一限制。特别是光可切换荧光染料的出现，使得基于定位的超分辨率显微成像成为可能，其分辨能力接近分子尺度。本文介绍了基于单分子定位显微术和多相干涉测量法的一种三维超分辨率显微技术，即干涉式光激活定位显微术（iPALM）。该方法在三个维度上均能实现约 20 nm 的近各向同性分辨率。文中描述了用于观察丝状肌动蛋白细胞骨架的实验方案，包括样品制备和 iPALM 仪器操作步骤。这些方案也可方便地调整和应用于细胞中其他超微结构特征的研究。

iPALM 的关键要求包括光学系统的对准、配准和校准。这些步骤对于确保三路分束器内实现适当的干涉至关重要，而这种干涉是提取 z 坐标所必需的。为了实现持续监测，需要稳定的荧光点光源。这可以通过使用荧光金（Au）或双金属纳米颗粒来实现23，其光致发光来源于局域表面等离子体共振（LSPR）。这些纳米颗粒在激发下表现为稳定的单偶极子，通常可实现 5 - 10 nm 的定位精度。这些 commercially available 纳米颗粒的发光亮度处于大多数单分子荧光染料的范围内，因此荧光染料和定位标记物均可在 EMCCD 相机上使用相似的激发强度和增益设置成像，而不会发生饱和（图 1B）。此外，这些定位标记物还有助于精确聚焦，因为在调整焦距时可以监测标记物表观宽度的变化。同时，还必须对盖玻片表面进行严格清洗，例如通过 Piranha 蚀刻或等离子清洗，因为未清洗或清洗不充分的盖玻片会产生杂散背景荧光，容易掩盖单分子信号，如前所述。
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本文介绍了一种干涉光激活定位显微镜（iPALM）的技术方案，该方法是一种基于单分子定位的三维超分辨率显微成像技术，用于贴壁哺乳动物细胞中肌动蛋白细胞骨架的成像。该技术能够通过光学手段实现纳米尺度结构特征的可视化，而这些结构在传统受衍射极限限制的光学显微镜下无法分辨。

通过干涉光激活定位显微镜（iPALM）对F-actin丝进行三维超分辨率成像

荧光显微镜技术能够实现细胞内特定生物分子的直接可视化。然而，对于传统荧光显微镜而言，其空间分辨率受限于……

本实验的总体目标是利用一种名为iPALM的三维超分辨率显微成像技术，在超微结构水平上观察贴壁哺乳动物细胞中的肌动蛋白细胞骨架。iPALM成像可在三个维度上实现亚衍射极限的纳米级空间分辨率，从而能够利用荧光探针对超微结构进行可视化观察，并实现高特异性的标记。本视频中介绍的方法可快速适应并用于通过单分子定位超分辨显微镜技术可视化细胞中其他超微结构特征。首先在六孔板中的盖玻片上培养细胞以准备样品。组装成像样本时，使用精细镊子轻轻将载有样本的盖玻片从缓冲液孔中取出。然后用折叠的吸水纸轻轻接触盖玻片边缘，迅速而轻柔地吸去多余的缓冲液。将盖玻片细胞面朝上放置于一张洁净的镜头纸上。向样本上加入30至50微升成像缓冲液，冲洗样本。用折叠的吸水纸倾斜并轻拍以去除多余的缓冲液。重复洗涤步骤数次后，向样品上加入30至50微升成像缓冲液。用吸水纸吸干盖玻片边缘，然后在干燥区域滴加数个极小的快干环氧树脂点。缓慢地将另一片预先清洁的1.5号盖玻片置于含有22毫米盖玻片的细胞中心位置。通过毛细作用使成像缓冲液润湿两片盖玻片。快干环氧树脂的小点应粘附在两片盖玻片上。使用折叠的吸水纸轻轻按压组装好的样品，以使压力均匀分布。施加足够的压力使样品池变得薄而均匀，但切勿过度按压导致细胞破碎。通过观察牛顿环图案来判断合适的厚度。务必轻柔操作此步骤，以尽量减少气泡产生。如有需要，可预先用空白盖玻片多次练习。接着，用熔化的凡士林羊毛脂石蜡密封样品。然后用去离子水冲洗密封的样品。用压缩空气吹干样品，以备安装到显微镜上。将弹簧加载的上方物镜向上移动，以便取出样品 holder。将密封的样品放置在样品台上，并用数个小的稀土磁铁固定。在成像样品的两侧涂抹浸油。将样品台重新放回光路中，并轻轻放下顶部物镜。打开激发激光器。同时以帧转移模式启动EMCCD相机。随后，旋转至合适的发射滤光片。激活机械快门以阻断上光路并打开下光路。通过压电驱动器以微小步进平移的方式将下物镜调至焦点。当下标记物清晰聚焦后，打开上光路并同时阻断下光路，以类似方式调节上物镜至焦点。在计算机显示器上监测定位标记的宽度以获得最佳焦距。为实现正确居中，同时打开上方和下方的光路。在保持下方物镜固定的同时，使用一对微调螺钉手动调节上方物镜，直至定位标记的图像尽可能重叠，理想情况下在1个像素范围内。随后进行精细调节，使标志物图像重叠在EMCCD像素的十分之一范围内。在保持两个物镜和底部反射镜位置不变的情况下，通过控制软件调节安装在压电平台上的顶部两个轴向的反射镜。通过计算机显示屏比对顶部和底部物镜视野中标志物的中心位置，以指导调节过程。打开激光器，相机持续成像，同时保持上下两路光束路径畅通，通过控制软件生成的正弦电压波形驱动样品台Z向压电陶瓷，使其在Z轴方向持续振荡，振幅为400纳米。手动上下移动电动光束分束器组件，直至基准标记的光强出现振荡。由于期望实现单光子干涉效应，此现象表明两条光路的光程长度已接近匹配。在理想情况下，可实现大于10的峰谷比。为确保每个表面的振幅和相位在视场内尽可能均匀，需以微小步长调节分束器组件的底部镜片，以精细调整间隙和倾斜角度。通过在800纳米范围内以8纳米的Z向步长移动样品，完成分束器的精细对准。监测第一至第三台相机之间的基准标记强度。通过微调分束器组件中底部反射镜的高度、位置和倾斜角度，使第一台相机相对于第二台相机的振荡相位达到最大，理想情况下为120度。初始对准完成后，移动样品以扫描合适的视野，该视野应包含待成像的两个细胞以及附近多个基准标记。在系统周围放置一个遮光罩，以阻挡杂散光和环境干扰。找到成像区域后，再次移动样品，并记录校准曲线，用于后续的 Z 坐标提取。在主界面中使用命令“采集随样品压电位移变化的校准扫描”。找到目标区域并获得校准曲线后，将相应的文件名输入软件。打开上、下两路光束，然后将642纳米激光器的激发功率调至最大。对于Alexa Fluor 647，可能需要一段初始的Fluor-4关闭期。使用642纳米的恒定激发光照射五分钟，或根据需要更长时间，直至观察到单分子闪烁现象。软件可在采集过程中自动增加405纳米的光活化。通常需要采集大量图像帧，才能使丝状结构清晰可见。准备就绪后，使用主界面中的命令“start iPALM acquisition”开始采集原始图像数据集。在采集过程中，通过调节405纳米激光的强度，调整光激活水平，以维持所需的适当闪烁密度。当样品盖玻片正确组装后，在环境光或标准荧光照明下肉眼可观察到牛顿环。iPALM成像中荧光发射体轴向位置的提取需要同时进行多相位干涉，该过程通过三个EMCCD中给定基准标记的强度变化进行校准。随后对强度进行归一化处理并拟合以确定相位差。以下是重建的iPALM图像，每个定位坐标由一个二维高斯函数渲染，其宽度对应于定位不确定性。Z坐标根据颜色条进行着色。可以观察到纤维结构密集和稀疏的区域。图中所示为用Alexa Fluor 647鬼笔环肽标记的HUVEC细胞肌动蛋白细胞骨架的iPALM重建图像。图像颜色根据色标指示 Z 坐标。横截面直方图由框选区域内沿长轴方向的 XY 定位坐标生成。高斯拟合显示横截面的半高全宽为 43.88 纳米。此直方图显示了框选区域内定位坐标的 Z 位置。高斯拟合显示其半高全宽为 17.50 纳米。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 90 分钟内完成。观看本视频后，您应能够了解如何通过简单的样品制备与封片、光学调校、原始数据采集以及后续分析，利用iPALM在超微结构水平上可视化肌动蛋白细胞骨架。该技术发展后，为细胞生物学领域研究肌动蛋白细胞骨架的纳米级结构以及细胞黏附结构（如局灶性黏连）开辟了道路。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

三维超F-微丝高分辨率显微镜通过干涉光敏定位显微镜（iPALM）

我们描述了一种超分辨率成像方法，用于研究细菌FtsZ环的结构组织，该结构是细胞分裂所必需的重要装置。该方法基于对光激活定位显微镜（PALM）图像的定量分析，可应用于其他细菌细胞骨架蛋白的研究。...

细菌分裂机器的超分辨率成像

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同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

活细胞内动态蛋白质的时空信息对于理解生物学过程至关重要。一种称为快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）的超分辨率显微技术能够揭示细菌细胞分裂Z环的独特信息：不仅呈现其珠状结构，还能展示FtsZ蛋白在环内的快速动态行为。...

利用快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）对活体细菌中细胞分裂Z环进行超分辨率成像

通过将双分子荧光互补（BiFC）与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在细胞中以纳米级空间分辨率可视化蛋白质-蛋白质相互作用。本文描述了在U2OS细胞中利用BiFC-PALM成像Ras-Raf相互作用，以观察单个Ras-Raf复合物的纳米级簇集和扩散行为。...

双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

利用新型荧光探针对质膜中磷脂酰肌醇4,5-二磷酸进行单分子超分辨率成像

磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，质膜，单分子成像，超分辨率显微镜，荧光探针

本方法学的总体目标是从样品制备到图像采集与重建，提供最佳实验条件，以在固定细胞中实现微管和中间丝的二维双色dSTORM成像。...

利用二维直接随机光学重建显微镜成像中间丝和微管

形成正确的肌节网络对于诱导多能干细胞来源的心肌细胞的成熟至关重要。我们提出了一种基于超分辨率成像的方法，可对干细胞来源心肌细胞的结构成熟度进行定量评估，从而优化促进心脏发育的培养条件。...

利用单分子定位显微镜分析人iPSC来源心肌细胞中的α-肌动蛋白结合蛋白网络

本实验方案描述了一种利用培养的大鼠海马神经元和三维结构照明显微镜（3D-SIM）对轴突起始段膜周骨架中的肌动蛋白环及其他组分进行可视化和测量的方法。...

使用三维结构照明显微镜（3D-SIM）测量轴突起始段膜周期性骨架的特性

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

本方案概述了使用配备光学光子重分配功能的转盘共聚焦显微镜进行深层全细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像的实验步骤，从而无需定制光学元件或复杂照明即可实现DNA-PAINT成像。...

全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

学习使用干涉光敏定位显微镜（iPALM）技术对贴壁哺乳动物细胞中的肌动蛋白细胞骨架进行三维超分辨率成像。该方法可实现纳米级分辨率的细胞超微结构可视化，为细胞生物学研究提供高特异性标记的详细实验方案。

通过干涉光激活定位显微镜（iPALM）对F-actin丝进行三维超分辨率成像

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