通过干涉光激活定位显微镜（iPALM）对F-actin丝进行三维超分辨率成像

本实验的总体目标是利用一种名为iPALM的三维超分辨率显微成像技术，在超微结构水平上观察贴壁哺乳动物细胞中的肌动蛋白细胞骨架。iPALM成像可在三个维度上实现亚衍射极限的纳米级空间分辨率，从而能够利用荧光探针对超微结构进行可视化观察，并实现高特异性的标记。

本视频中介绍的实验步骤可快速调整并具有指导意义，可用于通过基于单分子定位的超分辨率显微镜技术观察细胞中的其他超微结构特征。首先，在六孔板中的盖玻片上培养细胞以制备样品。在组装成像样品时，使用精细镊子轻轻将带有样本的盖玻片从缓冲液孔中取出。

然后用折叠的吸水纸轻轻接触盖玻片边缘，迅速而轻柔地吸去多余的缓冲液。将盖玻片有样品的一面朝上放置在一张洁净的镜头纸上。通过在样品上加入30至50微升成像缓冲液冲洗样品。

用折叠的吸水纸倾斜并轻拍以去除多余的缓冲液。重复清洗步骤数次后，向样品上加入30至50微升成像缓冲液。用吸水纸吸干盖玻片边缘，然后在干燥区域滴加数个非常小的快速固化环氧树脂点。

缓慢地将另一片预先清洁的1.5号盖玻片置于含有细胞的22毫米盖玻片中央。通过毛细作用使成像缓冲液润湿两片盖玻片。快干环氧树脂的小点应粘附在两片盖玻片上。

使用折叠的吸水纸轻轻按压组装好的样品，以均匀分散压力。施加足够的压力使样品层变薄且均匀，但切勿过度按压导致细胞破碎。通过观察牛顿环图案来判断合适的厚度。

务必轻柔操作此步骤，以尽量减少气泡产生。如有需要，可事先用空的盖玻片多次练习。接着，用熔化的凡士林羊毛脂石蜡密封样品。

然后用去离子水冲洗密封的样品。用压缩空气吹干样品，以备安装到显微镜上。将弹簧加载的上方物镜向上移动，以便取出样品 holder。

将密封的样品置于样品架上，并用数个小的稀土磁铁固定。在成像样品的两侧涂抹浸油。将样品架重新放回光路中，并缓慢放下顶部的物镜。

打开激发激光器。同时以帧转移模式开启EMCCD相机。接下来，旋转至合适的发射滤光片。

激活机械快门以阻断上光路并打开下光路。通过压电驱动器以微小步进平移，使下物镜聚焦。一旦基准标记清晰聚焦，打开上光路同时阻断下光路，并以类似方式调节上物镜至聚焦状态。

在计算机显示器上监测定位标记的宽度以获得最佳焦距。为实现正确居中，需同时打开上方和下方的光路。在保持下方物镜固定的同时，使用一对微调螺钉手动调节上方物镜，直至定位标记的图像尽可能重叠，理想情况下在一个像素范围内。

随后进行精细调整，使标志物图像重叠在EMCCD像素的十分之一范围内。通过控制软件调节安装在压电平台上的顶部两个轴反射镜，同时保持两个物镜和底部反射镜固定不变。通过计算机显示屏比较顶部和底部物镜视图中标志物的中心位置，以指导调整过程。

打开激光器，相机持续成像，同时保持顶部和底部光路开启，通过控制软件生成的正弦电压波形驱动样品台Z轴压电陶瓷，使其在Z轴方向持续振荡，振幅为400纳米。手动上下移动电动光束分束器组件，直至基准标记的光强出现振荡。由于期望实现单光子干涉效应，此现象表明两条光路的光程长度已接近匹配。

在理想情况下，可实现超过10的峰谷比。为确保每个表面的振幅和相位在视场内尽可能均匀，需以微小步长调节分束器组件的底部反射镜，以精细调整间隙和倾斜角度。通过在800纳米范围内以8纳米的Z轴步长移动样品，完成分束器的精细对准。

监测第一至第三台相机之间的基准标记强度。通过微调分光器组件中底部反射镜的高度、位置和倾斜角度，使第一台相机相对于第二台相机的振荡相位达到最大，理想情况下为120度。初始对准完成后，移动样品以扫描合适的视野，该视野应包含待成像的细胞以及附近多个基准标记。

在系统周围放置一个遮光罩，以阻挡杂散光和环境干扰。找到成像区域后，再次移动样品，并记录校准曲线，用于后续的 Z 坐标提取。在主界面中使用“采集校准扫描 vs 样品压电位移”命令。

找到目标区域并获得校准曲线后，将相应的文件名输入软件中。打开上光路和下光路，然后将642纳米激光器的激发功率调至最大。对于Alexa Fluor 647，可能需要一段初始的Fluor-4关闭期。

使用642纳米的恒定激发光照射五分钟，或根据需要更长时间，直至观察到单分子闪烁现象。软件可在采集过程中自动增加405纳米的光活化强度。通常需要采集大量图像帧，才能使丝状结构清晰可见。

准备就绪后，使用主界面中的命令“start iPALM acquisition”开始采集原始图像集。在采集过程中，通过调节405纳米激光的强度来调整光激活水平，以根据需要维持适当的闪烁密度。当样品盖玻片正确组装后，在环境光或标准荧光照明下肉眼可观察到牛顿环。

iPALM成像中荧光发射体轴向位置的提取需要同时进行多相位干涉，该过程通过三个EMCCD中给定基准标记的强度变化进行校准。随后对强度进行归一化处理并拟合以确定相位差。以下是重建的iPALM图像，每个定位坐标由一个二维高斯函数渲染，其宽度对应于定位不确定性。

Z坐标根据颜色条进行着色。可以观察到致密和稀疏的丝状结构区域。图中显示的是用Alexa Fluor 647鬼笔环肽标记的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）肌动蛋白细胞骨架的iPALM重建图像。

图像颜色根据色标指示Z坐标。横向截面直方图由方框区域内沿长轴方向的XY定位坐标生成。高斯拟合显示，与横向截面相关的半高全宽为43.88纳米。

此直方图显示了框选区域内定位坐标的 Z 位置。高斯拟合结果显示半高全宽为 17.50 纳米。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 90 分钟内完成。

观看本视频后，您应能够理解如何通过简单的样品制备与封片、光学对准、原始数据采集以及后续的图像重建分析，利用iPALM在超微结构水平上可视化肌动蛋白细胞骨架。该技术发展之后，为细胞生物学领域的研究人员探索肌动蛋白细胞骨架以及局灶性黏附等细胞黏附结构的纳米级架构开辟了道路。