全血中自然杀伤细胞溶细胞活性的流式细胞术分析

本实验的总体目标是以快速、可靠且稳定的方式测定人全血样本中自然杀伤细胞（NK细胞）的数量及其细胞毒活化水平。该方法有助于回答免疫学领域中的相关问题，例如：外界干预对NK细胞生物活性有何影响？该技术的主要优势在于其快速、准确，同时仍能在不同实验间提供可重复的结果。

为了从人全血中分离NK细胞，首先将标记为全血样本、阴性组分和阳性组分的15毫升离心管放入细胞分离管架中的相应位置。当所有离心管装载完毕后，将分离管架插入迷你取样器中进行自动标记，在菜单中选择“试剂”以高亮显示试剂瓶在管架上的放置位置。选择“读取试剂”以激活二维码读取器，并将相应的试剂瓶以距离二维码读取器盖0.5至2.5厘米的角度置于读取器前方。

将已读取的小瓶放入相应的分离架位置。接下来，在“分离”选项卡下，选中目标位置。然后打开“标记”子菜单，并选择一个自动标记程序。

将细胞分选试剂磁珠分配至支架的 1、2、3 和 4 号位置。选择 Posselwb 分选程序。选择清洗洗涤程序。

在“体积”子菜单下的“样品体积”中输入 1500 微升，然后按 Enter 键。接着点击“运行”以开始细胞分离。点击“确定”以确认有足够的缓冲液用于处理所有样品。

为准备细胞毒性实验样本，首先根据需要为每个样本和/或参与者标记1.5毫升离心管，并将适当比例的NK细胞与DIO标记的K562细胞移液至各管中。通过离心收集细胞，并小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀。接着，将细胞混合物重悬于500 µL不完全NK细胞培养基中，并向每管细胞中加入5 µL碘化丙啶进行标记。

通过另一次离心收集细胞，并将细胞培养物在37摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，在相同的离心条件下离心细胞，并将沉淀重悬于25 µL新鲜的不完全NK细胞培养基中。若需通过流式细胞术分析细胞，首先点击成像流式细胞仪软件中的启动按钮，以冲洗系统。

接下来，单击散点图按钮以生成四个散点图，并加载双阳性对照管。使用双阳性对照样本，确定405毫瓦激光器所需的最佳强度，以避免检测器过载，并设置成像仪以获取适当的细胞计数。将405毫瓦激光器的强度设置为适合同时检测DIO和PI的水平，需要积累对这两种染料以及流式细胞仪检测范围的操作经验。

双阳性对照样本采集完成后，加载仅含DIO的对照样本，选择40倍物镜，并关闭642毫瓦激光器和明场通道。培养适量细胞，对仅含碘化丙啶的样本重复进行采集。所有对照样本运行完毕后，重新打开405毫瓦激光器和明场通道，然后单击“设置强度”。

然后，在“文件采集”选项卡下，输入自定义文件名，并选择用于保存数据文件的文件夹。接下来，输入需要采集的细胞数量。加载第一个实验样本管，然后点击“采集”按钮。

当所有样本运行完毕后，打开成像流式细胞仪分析软件，载入一个实验用 RIF 文件。在补偿选项卡下，选择“创建新矩阵”。软件将提示选择单色文件，并将其合并以生成一个用于通道补偿的矩阵文件。

使用“构建模块”功能设置适当的点图，然后点击统计功能以获取每个门控中的细胞数量。在此代表性实验中，按指示采集血样，并测定每位跑者每毫升全血中自然杀伤细胞（NK细胞）的浓度，以及每个时间点的平均浓度。

四分之三的跑步者在运动后均出现自然杀伤细胞（NK细胞）数量轻微上升，随后迅速下降，最终在运动结束后24至48小时逐渐恢复至正常水平。平均而言，运动后1.5小时NK细胞数量下降，但在24小时后恢复至接近正常水平。

在计算细胞数量后，立即按照上述方法分析NK细胞的细胞毒活性，结果显示运动结束后即刻以及1.5小时后NK细胞毒活性平均下降，但在运动后24小时显著升高。与运动前水平相比，NK细胞毒活性在后续时间点保持较高水平，尽管差异无统计学意义。一旦熟练掌握，该技术在正确操作下约需四小时即可完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何以可重复的无菌方式从人血样本中获取并表征自然杀伤细胞（NK细胞）的数量及其细胞毒活性。