利用3D打印技术融合MRI与组织学：一种脑切片方案

本方案的总体目标是通过定制3D打印的脑组织固定器和切片盒，精确地将磁共振成像图像数据与组织学切片进行配准。尽管本视频主要聚焦于从狨猴中提取的脑组织，但该方案可适用于任何来源的脑组织，无论是啮齿类动物、非人灵长类动物还是人类。请按照方案中的描述准备工作站。

将Fomblin和纱布填充至试管的20毫升刻度处。在填充过程中压缩纱布以去除气泡。轻轻擦干脑组织中的福尔马林。

然后将脑组织腹面朝下放入管底。用纱布围绕脑组织侧面小心固定其位置，以确保脑组织在管内稳定。随后用纱布和Fomblin填充管内剩余空间。

沿途小心去除气泡。然后拧紧管盖，并用石蜡密封试管。将管盖标记线对准大脑半球间裂。

然后用纸巾包裹试管，并将其插入线圈中，使标记位于顶部中央位置。将线圈插入磁共振成像仪。完成图像采集与后处理后，我们可获得一幅T2加权图像，可用于构建脑部的数字模型。

以冠状面方向打开 MRI 图像。然后使用转换工具将图像重采样为 1 毫米各向同性体素。接下来，应用非线性噪声抑制滤波器。

选择显示查找表，然后点击双阈值按钮。拖动图表上的滑块以覆盖整个大脑。

使用基于最小/最大值的阈值分割算法创建二值化脑部掩膜。将位于强度图左下角、刻度下方的数值输入到“下限”框中。然后选择“二值化”并取消勾选“反向阈值”。

选择形态学算法中的“填充孔洞”。勾选“在2.5D中处理”。为填补后脑与大脑皮层之间的间隙，选择线状VOI。

在大脑两侧最外侧点处，分别绘制脑干与大脑皮层之间的连接。继续在脑内绘制感兴趣区域（VOI）之间的连接。将这些感兴趣区域（VOI）转换为二值掩膜。

使用图像计算器，通过选择“或”运算来合并VOI和脑部二值掩膜。选择提升目标图像类型。然后选择形态学算法中的填充孔洞。

并检查 2.5D 中的处理。选择算法“提取表面”，选择掩膜图像，输入名称，然后选择文件类型为 ply。可根据切片平面位置，在切割框中设置间隙，起始位置可从脑部前方、脑部后方，或相对于感兴趣区域（如此处所示白质中的病灶）进行放置。

使用盒形感兴趣区域（VOI），在脑部周围绘制一个矩形框。将该矩形框复制并粘贴到与预定板间隙厚度相对应的MRI切片数量上。然后跳过每段对应的MRI切片数量，重复前述操作拼接矩形框，以创建另一个刀片间隙。

重复此过程直至覆盖整个脑部。将脑区体积（VOIs）反转为二值化掩膜，然后如之前对脑部的操作一样，使用提取表面功能获取表面。

选择刀片间隙的二值掩膜。使用图像数学运算将其乘以 10,000。然后使用图像计算器将乘法处理后的二值掩膜与重采样的各向同性 MRI 相加。

现在通过选择三平面视图，可以在三个正交视图中看到显示大脑将被切割位置的 MRI 刀片图。在 Netfabb Professional 中，选择“添加部件”，然后选择 Blade Gap 模型和 Brain Model plys。

选择脑模型并点击修复模式。使用壳层选择按钮选中脑组织，然后切换选择至其他壳层并将其删除。

然后进行修复并移除旧的部分。选中脑组织后，选择“移动”功能。点击原点，并记录X、Y、Z框中的参数。

这些部件用于保持刀片间隙的定位。点击翻译，然后关闭窗口。

选择刀片间隙模型，并使用上一步记录的参数对其进行平移。选择脑模型，然后单击修复模式。使用壳体选择按钮选择脑组织。

然后选择平滑三角面。将迭代次数设为四，并勾选防止体积收缩。

选择“减少三角形”并在“目标三角形数量”框中输入 200000。然后选择“自动修复”并执行默认修复。应用此修复。

然后将平滑后的脑模型导出为 STL 格式。将平滑后的脑模型导入 Meshmixer。使用雕刻工具对线状 VOI 绘制的区域进行平滑处理。

修复模型的其他任何微小缺陷。将平滑并编辑后的脑模型导入 Netfabb Professional，然后添加部件“brain slicer parts marmoset”。

选择壳体到各部件，然后根据实验方案中的描述将每个部件重命名。根据实验方案中所述的选择设置，单击并拖动部件，将脑组织置于盒子中央。

单击并拖动部件以调整方框中大脑的深度。在方框中选择经过平滑和编辑的大脑模型，然后选择布尔运算。单击大脑模型，使其变为红色。

并选择布尔减法。执行计算。勾选悬垂部分的选项，以防止大脑无法正确放置。

请参阅方案的补充部分以获取去除它们的方法。选择刀片间隙模型并点击移动。在 Z 位置记录。

这将是最后方刀片间隙的位置。然后关闭窗口。从脑部切片装置的部件中选择刀片部分，然后点击移动。

输入上一步中的 Z 值，并输入当前位置的 X 和 Y 值。选择绝对平移并进行平移。

单击“复制”。如果切片厚度一致（如此处所示），请输入总刀片数、总数量和Z轴计数，并在Z轴间隙框中输入切片厚度，然后选择复制。

从脑部切片装置的部件中选择切片刀片部分。重复之前对刀片部分进行的移动和复制步骤。选择所有切片刀片和主刀片架，然后点击布尔运算。

选择所有切片刀片使其变为红色，然后点击布尔减法。接着应用计算。进入修复模式并选择自动修复。

执行扩展修复并应用修复。将刀片支架导出为STL格式。选择所有刀片、主盒体和副盒体，以及经过平滑和编辑的脑模型，然后点击布尔运算。

使用部件选择窗口将除主盒体外的所有部件设置为红色。然后选择布尔减法运算，执行计算。

进入修复模式，检查是否存在可能损伤脑组织的锐利边缘。这些边缘可在 Netfabb 的修复模式下进行修复，或使用 Meshmixer 中的雕刻工具进行处理。

然后选择自动修复。执行扩展修复，然后应用该修复。

将脑盒导出为STL格式。在Cura中，选择“加载”并导入脑盒。单击“旋转”按钮。

然后点击并拖动以将盒子展平。按照方案中所示编辑打印设置，然后保存刀具路径。

对刀片架执行相同的操作流程，并复制该对象。然后保存刀具路径。在打印平台上涂抹一层薄胶后，根据本方案中描述的设置，使用3D打印机打印脑盒和刀片架。

打印完成后，即可准备切脑。按照方案所述设置工作站。将脑组织小心放入盒子中，并确保其固定稳妥。

将切片机刀片放入刀片架中，并将其置于盒子中对应的凹槽内。佩戴防护手套，用力将刀片架向下压紧。以缓慢、均衡的压力进行脑组织切片。

从大脑前部开始，逐个移除脑片。尽管该方法较为直接，但此过程需要多个步骤，并涉及多种软件的使用，因此操作人员在开始实验前应熟悉各软件的用户界面。本工作流程总结了制作狨猴脑切片盒的方案。

脑组织经福尔马林固定后，以150微米分辨率进行T2加权MRI扫描。对图像进行处理并设定阈值以生成二值化掩膜，随后在三维建模软件中对表面进行三维重建。

通过切片模板与脑模型之间的布尔减法运算，生成脑切片器的数字模型。随后使用3D打印机打印脑切片器盒。将脑组织牢固地放入切片器盒中进行切割。

脑组织切片后，通过将活体与死后 MRI 图像及脑片表面照片进行视觉比对，可观察到多个脑片之间的定位匹配良好。高分辨率的死后 MRI 与来自多个脑片的 LFB CV 染色组织学切片之间的进一步比对，显示出狨猴脑内所有结构均具有精确且一致的对应关系。在此多发性硬化动物模型中，动物的脑内会出现遍布全脑的白质病变。

利用该技术，活体 MRI 上检测到的小病灶可以在死后 MRI 和组织学切片上进行追踪。组织学和死后 MRI 还可揭示在活体 MRI 上被遗漏的病灶。本例中，活体 MRI 未显示出明确的正常高信号证据，以提示任一视束存在病灶。

然而，在死后 MRI 中，视束区域观察到信号高信号灶，这些区域与 LFB CV 组织学切片中所见的有髓鞘病变区域直接对应。因此，综上所述，本文介绍的方法学可使研究人员准确评估 MRI 发现背后的病理学基础。

我们认为，这是一种极具前景的方法，可用于识别涉及大脑的疾病以及特定病理过程（如炎症和髓鞘再生）的新型生物标志物。