Name: 从单分子结构信息FRET实验使用快速纳米定位系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学习使用快速纳米定位系统进行单分子FRET实验，结合贝叶斯推断软件分析生物大分子结构。该方法利用全内反射荧光显微镜获取高分辨率数据，可定位柔性结构域，为结构生物学研究提供可靠方案。

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作者感谢 B. Gruchmann 提供的流室机械设计图。此外，我们还要感谢 Max Beckers 和 Florian Drechsler 就纳米颗粒示踪技术（NPS）及其底层采样引擎提出的富有见地的评论和讨论。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们介绍了用于精确定量测定通过柔性连接臂连接至生物大分子的染料之间FRET效率的实验装置与操作流程， 即核酸和/或蛋白质。
为确保精确的单分子Förster共振能量转移（smFRET）测量（第3节），在测量过程中必须始终排除流动池中的空气。此外，务必避免荧光染料过载，荧光分子之间必须清晰分离，以保证正确分析。由于不显示供体漂白的smFRET分子对需从分析中剔除，因此需确保 &#62;视野中80%的分子在视频结束时已漂白。为校正样品中的不均一性， &#946;-因子和 &#947;-因子，用于分别校正每个FRET对的供体和受体通道间的串扰以及相对检测效率。
相机设置（第3.9节中描述的积分时间、电子倍增增益、前置放大器增益和读出速率）应设定为在信噪比、动态范围和时间分辨率之间取得最佳平衡的数值。若实验条件不同或使用不同硬件，需重新调整这些参数。帧数需足够高，以确保在观察时间内大多数供体分子发生漂白。
在荧光光谱仪上进行测量（第7至9节）时，需在信号强度与所记录数据的光谱分辨率之间找到一个良好的折中方案。为此，应根据所使用的仪器和样品浓度，调整荧光光游戏副本中激发和发射光路的狭缝宽度。
此外，我们介绍了 Fast-NPS 分析方法，用于获取瞬态或动态大分子复合物的结构信息。NPS 已被应用于揭示古菌 RNA 聚合酶开放复合物中非模板 DNA 链的路径以及转录起始因子的位置。通过利用包含 60 多个不同距离测量值的网络，我们证明了配备新实现采样引擎（Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., &amp;#38; Michaelis, J. 正在准备中），减少了分析该复杂单分子FRET网络所需的时间 &#8776;相较于原始的全局NPS方法，快了2个数量级27该算法的稳健性源于结合了并行退火方案的Gibbs采样器内的Metropolis算法。Fast-NPS在分子网络分析结果上具有精确的可重复性，并与先前发表的结果一致30.
已有多种不同的方法发表，旨在从单分子荧光共振能量转移（smFRET）测量中推断结构信息11,12,13,14,15,16,17,18。所有这些方法仅提供一种特定的染料模型。因此，若染料不符合相应模型所作的假设，则无法使用该方法，或会导致错误的结构信息。相比之下，Fast-NPS 允许为每个染料分子选择不同的模型。这有助于考虑染料分子本身及其连接臂所表现出的不同构象行为。染料分子所处的局部分子环境及其物理性质将决定哪种模型最为合适。
对于所分析的古菌起始复合物的单分子FRET网络，若对所有染料分子采用各向同性假设，其可信体积的大小将相较于经典模型显著减小。当结合所有染料分子的动态位置平均时，所有可信体积（95%置信水平）的中位数减小至不足0.5 nm3。然而，这些染料分子的后验分布与其实测的单分子FRET数据不再一致，表明所采用的假设会导致错误的结构信息。相比之下，采用经典模型所确定的后验分布在结果上与测得的单分子FRET效率保持一致。
由于假设所有染料分子均呈现各向同性或动态位置平均会导致不一致的结果，Fast-NPS 允许为每种染料分子设置先验分布，使每种染料可被分配至五种模型之一。每种模型使用相同的可及体积。用于计算染料可及体积（AV）的算法基于若干假设：首先，荧光团的空间形状被近似为球形，因此应使用一个综合考虑荧光团宽度、高度和厚度的直径值（第12节）。此外，连接臂的形状被近似为柔性杆。第12节中提供的数值是针对通过12-C连接臂连接的 Alexa 647 染料计算得到的。目前尚无法在实验前准确判断在给定实验构型下哪种模型最为合适，因此应测试所有模型。通常应选择在与数据保持一致的前提下产生最小后验分布范围的模型。为检验模型选择是否与单分子荧光共振能量转移（smFRET）数据一致，需同时计算后验分布和似然函数。一致性是指从后验分布中采集的样本中，超过90%位于似然函数的95%置信区间内。
尽管确实各向异性越低，距离的不确定性就越小，但在smFRET网络中，还必须考虑荧光染料分子的空间几何排布。因此，虽然通常首选使用iso模型来描述荧光各向异性较低的染料分子，但一致性检验为选择正确的染料模型提供了更直接的方法。染料模型的最佳选择可显著提高定位精度，同时保持网络与其FRET数据的一致性。
总之，Fast-NPS 能够获取大型大分子复合物的结构与动态信息。与X射线晶体学或冷冻电子显微镜等常规结构方法相比，该技术可用于监测高度柔性或瞬时存在的复合物，从而极大地拓展了我们对复杂生物过程机制的理解。

确定生物大分子的结构是理解其功能的关键前提。目前，两种成熟的结构解析方法是冷冻电子显微镜技术（cryo-electron microscopy）和X射线晶体学1,2。如今，这两种方法均可提供高达埃级分辨率的高分辨率结构信息。这些方法已被广泛用于解析蛋白质复合物等大型生物大分子的结构。尽管现有方法在过去几十年中不断得到改进，但生物结构的复杂性仍为结构生物学带来重大挑战，尤其是在研究大型、动态且瞬时存在的复合物时尤为突出3。

为了研究大分子复合物的动力学及其特定的结构-功能关系，单分子方法已提供了有价值的信息4。多种新策略相继发展，为获取结构与动态信息提供了正交的途径，例如高速原子力显微镜（AFM）5、机械操纵技术6、荧光定位显微镜7，以及单分子 Förster 共振能量转移（smFRET）8,9。由于 FRET 在生物大分子尺度上具有距离依赖性，早在早期就被称作分子尺10。
单分子FRET（smFRET）一个特别有趣的应用是利用其测量获得的距离信息来推断结构信息11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23。由于smFRET具有高时间分辨率，因此可以定位蛋白质结构中可移动部分的位置。然而，为了从smFRET数据中提取定量信息，需要在测量过程中确定有关染料分子的重要校正参数24。利用这些校正因子，可通过以下公式计算FRET效率 EFRET
<img alt="FRET 效率公式 \(E_{FRET}=\frac{I_A-\beta \cdot I_D}{I_A+\gamma \cdot I'_D}\)；光谱学方法。" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1">,
 
其中 IA 和 ID 分别为受体分子和供体分子的荧光强度（见图2）。β因子用于校正串扰，即供体发射信号泄漏至受体通道的情况，其计算公式如下：
<img alt="静力平衡公式，β=I'A/I'D，用于力学分析的方程。" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 2">
其中 I'A 和 I'D 分别表示受体分子光漂白后供体分子和受体分子的荧光强度。
γ因子用于校正两个通道中相对检测效率的差异，以及供体和受体染料荧光量子产率的差异。它通过每条独立的时间轨迹按以下公式计算：
<img alt="伽马校正公式，ΔIA/ΔID，用于图像处理分析的数学表达式。" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 3">
请注意，本描述忽略了对受体分子的直接激发，而这种情况有时会变得重要，同样需要进行校正。为了确定这些校正因子，采用交替激发供体和受体的方案是十分有益的25 以区分光物理变化与结构动力学。
为了不仅获得定量的单分子FRET效率，还能获取定量的结构信息，2008年提出了纳米定位系统（Nano-Positioning System, NPS）26。该名称的选取是基于其与卫星导航全球定位系统（Global Positioning System, GPS）的相似性。NPS是一种结合单分子FRET与X射线晶体学数据的混合技术，用于定位生物大分子复合物中未知染料的位置。晶体结构作为参考坐标系，而单分子FRET结果则用于获取未知荧光团位置（天线）与晶体结构中已知位置（卫星）之间的距离信息。在连续的实验中，测量天线与多个卫星之间的距离，并通过基于贝叶斯参数估计的严格统计分析方法确定天线的位置。结果不仅可计算出天线最可能的位置，还可获得其完整的三维不确定性分布，即所谓的后验分布，并通过可信体积进行可视化。此外，NPS已被扩展，可用于分析完整的单分子FRET网络27。
NPS 已被用于解决真核转录中的多个重要问题，即上游 DNA、非模板 DNA 以及 RNA 聚合酶 II 延伸复合物中新生 mRNA 的走向12,28，同时也揭示了转录起始因子的作用26以及开放启动子复合物的动态结构29。此外，NPS 还被用于阐明古菌 RNA 聚合酶开放复合物的结构30，特别是转录起始因子 TFE 的位置，该因子与转录延伸因子 Spt4/5 竞争性地结合于相同位点31。
此后，已发表多种基于单分子FRET的结构研究方法15,18,21,23。在比较不同基于单分子FRET的结构方法时，可以明显看出，该方法的表观精度在很大程度上取决于所选用的染料模型。需要注意的是，染料分子可能因其局部环境的不同而表现出不同的空间和取向行为。
为此，研究者引入了Fast-NPS32。Fast-NPS采用了一种先进的采样算法，可显著缩短计算时间。此外，Fast-NPS还支持进行结构分析，并且用户可为每个染料分子从五种不同的染料模型中进行选择，这些模型将在下文予以介绍。其中最保守的模型称为classic（经典模型），该模型假设染料仅占据一个但未知的位置。在此位置上，荧光团可在一个锥形空间内自由旋转，锥体的大小由其相应的（时间依赖性）荧光各向异性决定。由于锥体的方向未知，因此在将测得的单分子FRET效率转换为距离时会带来较大的不确定性。从这一角度来看，该模型是保守的，因为与其他染料模型相比，它所得出的距离精度最低。仅在距离非常短的情况下，经典模型的假设才会导致明显不准确的位置判断。对于典型的单分子FRET值，真实位置始终包含在相对较大的可信体积范围内。
然而，由于更高的精度是可取的，因此开发和测试替代性染料模型非常重要，这有助于提高精度。如果染料的旋转速度远快于其固有的荧光寿命，则称为 iso 模型可被应用。此处，取向因子κ2 （用于计算特征各向同性 Förster 半径）<img alt="R_iso=0，静力平衡公式，物理方程，教学用途" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1">) 设定为 2/3。因此，与经典模型相比，所计算的可信体积几乎小了两个数量级。32在荧光团所处的环境中，若不仅能够实现快速重定向，还能在整个可及体积内实现快速运动，则 meanpos-iso 应使用该模型。在此模型中，染料仅有效占据一个平均位置，空间平均效应通过多项式距离转换进行校正。15该模型适用于例如（通常为疏水性的）染料连接到亲水区域的情况， 例如， DNA。应用 平均位置-同位素 模型进一步使可信体积减小约一半。然而，与蛋白质相连的染料可能在其空间可及体积（AV）内可逆地结合多个疏水区域。若一种荧光团在这些区域之间瞬时切换，但在每个区域内进行自由旋转和快速局部运动，则最适宜用以下方式描述 方差-均值位置-同位素 模型。对于染料不能自由旋转的类似情况 方差-均值位置 模型适用。有关这些模型的更多详细信息，请参见我们最近的出版物32.
这些模型提供了广泛的选项，可专门用于描述染料可能遇到的各种环境，合理应用这些模型能够优化染料定位的精确度。在 Fast-NPS 中，连接在特定位置的每个染料分子均可分配至独立的模型，从而允许 FRET 配对分子采用不同的模型。这实现了无限灵活且接近真实情况的建模。然而，重要的是必须进行严格的统计检验，以确保最终模型组合所得结果仍与实验数据一致。这些检验已包含在 Fast-NPS 软件中。
为了将 Fast-NPS 应用于实验数据，只需测量三个输入参数。首先，必须确定染料对特异性的各向同性 Förster 半径（<img alt="静态平衡方程 \( R_0^{iso} \)；工程或物理示意图。" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 1">）。为此，需要测量供体染料的量子产率（QY）、供体荧光发射光谱以及受体吸收光谱。这些测量可在体相中进行，使用标准分光光度计和标准荧光光谱仪即可完成。对于每一对染料，可利用免费软件 PhotochemCAD 计算其 R0 值，并将其用于 NPS 分析。此外，还需使用具有偏振（和时间）分辨能力的荧光光谱仪获取染料分子的（时间分辨）荧光各向异性。然而，Fast-NPS 最重要的输入参数是在单分子荧光显微镜系统（如全内反射荧光显微镜（TIRFM））上测得的单分子 FRET 效率。
本文介绍了一种获取单分子FRET数据并应用Fast-NPS的逐步实验方案（图1）。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;流动池制备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>定制金属样品台</td><td>自行搭建</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>石英玻璃载玻片，76&amp;nbsp;mm x 26&amp;nbsp;mm</td><td>Technical Glass Products</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，60 mm x 24&amp;nbsp;mm</td><td>Marienfeld</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>清洗剂，Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>Synergy UV 超纯水</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Zepto 等离子清洗仪</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，p.a.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯，5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>生物素化聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯，5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>密封膜（Nescofilm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 柔性硅胶管，内径 0.8&amp;nbsp;mm，外径 2.4&amp;nbsp;mm</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>细内径聚乙烯管，内径 0.58 mm，外径 0.96 mm（Smiths Medical）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>中性亲和素（Neutravidin）</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;全内反射荧光显微镜&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Nd:YAG 激光器，532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>二极管泵浦固态激光器，491 nm，Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>二极管激光器，643 nm，iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜，532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜，476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>声光可调滤波器</td><td>AA Opto-Electronic</td><td>AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>平凸柱面透镜，f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>平凹柱面透镜，f = -300&amp;nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棱镜，PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>聚焦透镜，f = 75&amp;nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>注射泵，PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 个步进电机，Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>压电致动器，PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>红外二极管激光器</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>自动聚焦系统组成部分</td></tr><tr><td>二向色镜，775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>位置传感探测器（PSD），PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>自动聚焦系统组成部分</td></tr><tr><td>水浸物镜，Plan Apo 60X WI，NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>二向色镜，645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>发射光路组成部分</td></tr><tr><td>发射滤光片，3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>发射光路中的绿色通道</td></tr><tr><td>发射滤光片，3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760</td><td>发射光路中的红色通道</td></tr><tr><td>EMCCD 相机，iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 相机，iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>紫外-可见分光光度计</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>荧光分光光度计</td></tr><tr><td>Solis（V4.15）</td><td>Andor</td><td></td><td>EM-CCD 相机控制软件</td></tr><tr><td>Apt 用户工具&amp;nbsp;（V1.022）</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>压电电机控制软件</td></tr><tr><td>Norland 光学胶 68</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>粘合剂</td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8 Nile red</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>亲和素包被的荧光多色微球&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>用于自定义编写软件的技术计算语言</td></tr><tr><td>Origin（V9.0）</td><td>Originlab</td><td></td><td>科学绘图与数据分析软件</td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>光程长度为 1&amp;nbsp;cm 的吸收池</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>光程长度为 3 mm 的荧光比色皿</td></tr></tbody></table>

使用快速纳米定位系统从单分子fret实验中获取结构信息

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

单分子荧光共振能量转移（smFRET）可用于实时获取生物分子复合物的结构信息。通过该方法，可利用多个 smFRET 测量数据，采用三边测量法确定蛋白质复合物内未知染料分子的位置。为了获得定量信息，纳米定位系统（NPS）结合 X 射线晶体学的结构数据与单分子荧光数据，采用概率性数据分析方法，不仅计算出最可能的位置，还计算出完整的三维概率分布（称为后验分布），以反映实验的不确定性。该概念已被推广，用于分析包含多个染料分子的 smFRET 网络。NPS 的最新版本 Fast-NPS 采用了一种新算法，基于马尔可夫链蒙特卡洛采样和并行退火的贝叶斯参数估计方法，可在相对较短的时间内分析大规模的 smFRET 网络。此外，Fast-NPS 允许为每个染料分子从五种不同的模型中选择一种，以考虑染料分子因其局部环境不同而表现出的空间和取向行为差异。
本文介绍了一种获取单分子FRET（smFRET）数据并应用Fast-NPS方法的详细实验方案。我们提供了获取Fast-NPS三个输入参数的详细操作步骤：smFRET值、染料分子的量子产率以及各向异性。近期，NPS已被用于解析古菌开放启动子复合物的结构。本研究利用该数据展示了五种不同染料模型对后验分布的影响。

转录是所有生物体基因表达的第一步。在古菌中，转录由单一的RNA聚合酶（RNAP）完成。与真核生物相比，古菌的RNAP在结构上与其真核对应物具有显著的相似性，但其转录机制更为简单。因此，古菌可作为研究真核生物RNA聚合酶II（Pol II）转录起始的模型系统。最近，通过单分子FRET和NPS技术已解析出古菌RNA聚合酶开放复合物的完整结构。NPS分析所得数据被用于构建完整的古菌开放启动子复合物模型，为转录起始机制提供了有价值的见解。
为了阐明该结构，测量了位于开放启动子复合物内的未知天线染料分子与多个已知的卫星染料分子之间的单分子FRET效率，这些卫星染料分子被引入RNA聚合酶（RNAP）中的五个参考位点，其位置由晶体结构确定（pdb-ID: 2WAQ）37。天线染料被连接至非模板DNA、TFB、TBP或TFE的不同位点之一。本研究中使用的完整距离网络包含超过60个测量距离。
图7展示了基于NPS分析构建的完整古菌开放启动子复合物模型。该模型包含双链启动子DNA（浅蓝色和深蓝色）、RNA聚合酶（灰色）以及转录起始因子TBP（紫色）、TFB（绿色）和TFE（黄色）。该模型与NPS分析结果叠加显示，即通过经典模型（A）、iso模型（B）、meanpos-iso模型（C）、var-meanpos-iso模型（D）和var-meanpos模型（E）计算得到的可信体积。
<img alt="TIRF 显微镜、紫外/可见光分光光度计示意图；FRET 效率、Förster 半径；Fast-NPS 分析。" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1： Fast-NPS 计算所需参数的获取与处理流程。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光强度与时间关系图；光激发过程的数据分析。" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 单分子FRET事件的典型荧光强度随时间变化轨迹。 供体（绿色）和受体分子（红色）的荧光强度显示了三个特征阶段，即 I：单分子FRET阶段，II：受体光漂白后的供体荧光，III：供体光漂白后的背景荧光。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用石英载玻片、流动通道、棱镜和丙烯酸支架的光谱学光学装置示意图。" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 单分子FRET实验用流动室的示意图。 流动室安装在一个定制的金属支架上，并配有丙烯酸玻璃固定件。该流动室采用三明治结构，包括一块带有两个孔的石英玻璃（熔融石英）载玻片，用于连接进样和出样管路，中间为密封膜，顶部由盖玻片封闭流动室。用于TIRF激发的棱镜安装在流动室的下半部分。中空凸耳螺钉提供流动室的进样口和出样口。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="石英玻璃载片示意图；尺寸为76x26x1mm；适用于实验装置的进液-出液流路设计。" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4： 石英玻璃载片与密封膜的制备。 石英玻璃载片的机械设计图，标示了孔位位置（单位：毫米）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="铝制和丙烯酸支架尺寸示意图、工程图、设备制造。" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5： 流动室的机械结构图。 铝制棱镜支架、丙烯酸玻璃支架和铝制安装框架的尺寸以毫米为单位给出。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于激发和发射分析的激光器、EM-CCD、AOTF 的光学光谱装置示意图。" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 
图 6： 用于单分子FRET实验的棱镜型全内反射荧光（TIRF）装置的示意图。 光学元件缩写：A，光阑；DM，二向色镜；F，发射滤光片；L，透镜；M，反射镜；O，物镜；P，棱镜；PSD，位置敏感光电二极管；S，样品；PS，定位平台；T，望远镜。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA-蛋白质结合分子模型示意图，显示ntDNA与不同蛋白质的相互作用。" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7： 不同模型假设的模拟结果。 所有图像均显示古菌RNA聚合酶（pdb-ID: 2WAQ，顶视图），以及启动子DNA模型（tDNA和ntDNA分别为蓝色和青色）、TBP（紫色）、TFB（绿色）和TFE（黄色）组成的古菌开放复合物30。可信体积叠加显示了NPS模拟结果：（A）经典模型，（B）iso模型，（C）meanpos-iso模型，（D）var-meanpos-iso模型，以及（E）var-meanpos模型。所有体积均以68%置信度显示。经典模型和var-meanpos网络与单分子FRET（smFRET）数据一致；相比之下，若所有荧光染料均采用iso、meanpos-iso或var-meanpos-iso模型的网络，则与实测数据不一致。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍了利用全内反射荧光显微镜（TIRF）从大型供体-受体网络获取单分子FRET数据的实验装置及操作流程。通过贝叶斯推断软件Fast-NPS对这些测量数据进行逐步分析，结合适配的染料模型，可获得高分辨率的结构信息。

使用快速纳米定位系统从单分子FRET实验中获取结构信息

单分子Förster共振能量转移（smFRET）可用于实时获取生物分子复合物的结构信息。

快速纳米定位系统（Fast Nano-positioning system）的总体目标是通过将单分子FRET实验与严格的统计分析相结合，实时提供生物大分子的结构信息。该方法能够回答结构生物学领域中的一些关键问题，例如在标准结构生物学工具无法应用的情况下，确定大分子中柔性结构域的定位。与其它基于FRET的结构分析工具相比，快速NPS的主要改进在于：不仅可以利用最可能的位置，还可借助三维概率分布来比较不同的染料模型。该技术的主要优势在于，它将蛋白质数据库中的结构数据与定量的单分子荧光测量相结合。开始实验前，组装一个流动池和样品架。准备进样和出样螺钉时，将硅胶管插入中空标签螺钉中，并用剃刀刀片将管子两端剪成平直切口。将盖板螺丝拧入样品支架。将流动池的石英载玻片孔与样品支架的螺纹对齐。轻轻拧紧玻璃固定夹的螺丝，以固定流动池的位置。将20厘米长的硅胶管插入进样口和出样口的螺钉中。用500微升PBS清洗流式腔室。然后用100微升含中性亲和素的PBS溶液冲洗流式腔室，确保进样口管末端形成液滴，以防止空气进入样品室。每次操作后夹闭进出口管路，以防止空气进入流动室。室温孵育15分钟。随后用500微升PBS洗去中性亲和素溶液。在棱镜上滴加一滴浸油，然后将棱镜拧紧到样品室上。使用全内反射荧光显微镜采集单分子FRET数据。启动相机软件和载物台压电马达软件。将腔室水平安装在TIRF显微镜的微米级载物台上，尽可能保持平直，并确保其与所有三束激光相交。加入浸油液体，通过观察红外反射来调节显微镜物镜的焦距。设置相机参数、文件路径以及自动递增参数。启动实时相机成像，并使用全部三种激光器以最大强度漂白背景荧光。随后降低激光强度。然后，向腔室中加入100微升荧光微球溶液。等待10分钟，使磁珠结合到腔室表面。录制一个视野范围内包含50至100个磁珠的视频，并使用较高的峰值检测阈值进行批量分析。加载视频文件，选择视野对角两个角落中具有明显中心的两个磁珠。选择这些微珠中强度最大的像素。取下棱镜并进行清洁。准备第二个样品室，并将棱镜支架旋紧到样品室上。将样品室安装到千分尺载物台上。然后，向样品室中加入100微升浓度为50至100皮摩尔的生物素化荧光标记样品溶液。等待分子与样品室表面结合。同时点击“采集信号”开始录制，并打开供体激发激光。调节激光功率，确保视野中至少80%的分子被漂白。然后移动样品腔，显示一个未漂白的区域，并录制下一个视频。以这种方式逐次漂白样品腔的其余部分。在TIRF显微镜上完成测量后，需要对获得的单分子FRET数据进行分析以得到平均FRET效率。对样品的供体和受体视频进行批量分析，然后将批量处理后的视频文件加载到数据分析软件中。单击“未选中”按钮以标记各个FRET相位。依次单击FRET时段的起始点、受体荧光强度因漂白而下降的时间点，以及供体荧光强度因漂白而下降的时间点。在下一个窗口中，选择“是”以保留所选的FRET效率轨迹。当每个分子均完成分析后，保存轨迹并分析下一个视频。分析完成后，运行脚本以合并FRET结果。使用默认输入选项将合并后的逐帧FRET文件导入数据分析软件中。将数据绘制成直方图，并使用非线性曲线拟合工具拟合高斯曲线。超出值即为主要的FRET效率。使用紫外-可见光谱和荧光光谱法测定每种染料的各向同性Forster半径以及稳态各向异性值。纳米定位系统的设计灵感来自广为人知的全球定位系统（GPS），我们通过若干已知位置（卫星）来确定一个未知位置（天线）。开始NPS分析时，启动FastNPS软件并创建一个新的任务文件。在ModelDyePrior窗口中，输入待定义位置的空间分辨率，以设定标记天线和卫星的位置先验信息。通过加载相应的居中PDB文件来排除大分子内部区域。输入染料直径和骨架化距离。填写染料可能位置的最小和最大坐标值。如果所定义的位置是一个卫星分子，选择通过柔性连接臂连接染料，并输入来自居中PDB文件的原子坐标。填写连接臂的长度和直径。点击计算可及体积，保存之前的位置，并导出用于可视化。对所有卫星和天线重复此过程。位置定义完成后，打开“定义测量”窗口，创建一个新的染料分子，并加载此前与该染料相关联的位置。输入荧光各向异性值，选择合适的染料模型，并激活该染料。重复此过程，直至所有染料均已定义。然后，创建新的测量。从已定义的染料中选择一个FRET配对。输入该染料对的单分子FRET效率及其误差，以及各向同性的Forster半径，然后启动测量。对所有染料对重复此操作。接下来，打开计算窗口。如果已为不同染料指定了不同的模型，请选择“用户自定义”。否则，请选择适用于所有染料的模型。执行计算并打开结果窗口。使用 FastNPS 时，必须记住针对所有染料调整模型，以尽量减少可信体积，同时确保一致性。如果一致性低于 90%，请单击详细一致性，找出在一致性低于 90% 的条目中共同存在的染料。打开“定义测量”窗口，更改相关染料的模型。以“用户自定义”模式重新运行计算。可单独或批量导出染料的可信体积。在可视化软件中打开密度文件，并将置信度调整至所需水平。通过单分子FRET效率测量了未知天线分子与古菌RNA聚合酶开放启动子复合物内多个已知卫星分子之间的距离。对该数据进行NPS分析，确定了这些染料分子相对于古菌RNA聚合酶开放启动子复合物的可信体积。使用了五种不同的模型对染料分子进行分析，并比较了结果。当采用假设染料只能在未知取向的圆锥范围内自由旋转的模型进行计算时，可信体积与实测数据一致。其中，经典模型尤为保守，因为它进一步假设染料处于固定位置。这会产生一个相对较大的可信体积，但该体积通常能够包含正确的位置。更高精度的模型假设染料在其荧光寿命内可以完全自由旋转。iso 模型与经典模型类似，均假设染料在可及体积内处于固定位置。meanpos-iso 模型假设对所有可能的位置进行动态平均。尽管 iso 模型的可信体积远小于非 iso 模型计算出的体积，但其结果与实测数据不一致。我们希望开发一种技术，能够捕捉瞬态复合物的动态结构信息，这一问题目前尚无法通过现有的结构分析工具解决。单分子FRET数据记录完成后，FastNPS分析可在数小时内完成，从而快速比较不同的染料模型。通过此流程，后续可进一步开展分子动力学（MD）模拟等其他方法，以获得与实验单分子FRET数据一致的结构模型。

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科研

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