Name: 对细胞的超快磁化阳离子化Magnetoferritin的合成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 了解在蛋白质笼内合成磁性纳米颗粒并对其进行阳离子化修饰的方法，以实现干细胞的快速磁化标记。该技术利用低浓度纳米颗粒和短孵育时间，适用于MRI成像和磁性细胞分离等生物医学应用。

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本工作由工程与物理科学研究理事会（EPSRC 资助编号 EP/G036780/1）资助的布里斯托功能纳米材料中心提供经费支持。

人骨髓间充质干细胞（hMSC）取自接受全髋关节置换术的骨关节炎患者股骨近端骨髓，完全遵循布里斯托尔南米德医院研究伦理委员会指南（参考编号 #078/01），并在获得患者知情同意后进行。
1. 磁性铁蛋白的合成与纯化
<ol>
	<li>一般说明
	<ol>
		<li>在65 °C、氮气氛围下，于可密封的双层夹套反应容器中进行磁性铁蛋白的合成，以限制金属前体的氧化。使用注射泵通过盖子上的进样口将金属盐溶液和过氧化氢注入反应容器中。</li>
		<li>磁性铁蛋白合成完成后，通过阴离子交换色谱（见第1.4节）纯化蛋白，以去除未被蛋白空腔包裹的纳米颗粒，随后通过尺寸排阻色谱（见第1.5节）分离蛋白单体。使用Bradford法测定蛋白浓度（见第1.6节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>合成前的准备工作
	<ol>
		<li>将连接至氮气钢瓶的导管插入500 ml去离子水中，用保鲜膜密封容器，并通入氮气约60分钟，以去除水中溶解氧。</li>
		<li>将连接至双层夹套反应容器的水浴加热至65 °C。向反应容器中加入75 ml 50 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（pH 8.6），密封容器，并通入氮气约20分钟以去除缓冲液中的氧气。同时使用磁力搅拌器搅拌缓冲液。</li>
		<li>在HEPES缓冲液脱氧后，将通氮气的导管从缓冲液中取出，保持其悬于容器内以维持氮气氛围。加入脱辅基铁蛋白（apo-ferritin），使其终浓度达到3 mg/ml。继续磁力搅拌，若出现起泡则降低搅拌速度。</li>
		<li>通过将0.19 g七水合硫酸钴溶于50 ml脱氧去离子水中，配制25 mM的储备液。</li>
		<li>通过将0.98 g六水合硫酸铁铵溶于100 ml脱氧去离子水中，配制25 mM的硫酸铁铵溶液。</li>
		<li>取出2.5 ml硫酸铁铵六水合物溶液，并用2.5 ml七水合硫酸钴溶液替代。</li>
		<li>在脱氧去离子水中配制8.33 mM的过氧化氢溶液：先将965 μl过氧化氢溶液（30% w/w）加入9 ml脱氧去离子水中，再将1 ml该预稀释液加入99 ml脱氧去离子水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性铁蛋白的合成
	<ol>
		<li>使用两台注射泵，以0.15 ml/min的流速将10.1 ml铁-钴前体溶液和10.1 ml过氧化氢溶液同时注入磁力搅拌的脱辅基铁蛋白溶液中（总注入体积：20.2 ml）。</li>
		<li>在注射过程中，另取500 ml去离子水进行脱氧。 
		注：随着反应进行，反应容器内的溶液逐渐变为深棕色。</li>
		<li>在第一次注射即将完成前，使用新脱氧的去离子水配制另外100 ml铁-钴前体溶液和过氧化氢溶液。</li>
		<li>使用新配制的铁-钴前体和过氧化氢溶液，重复步骤1.3.1的注射操作。</li>
		<li>在注射过程中，再次对500 ml去离子水进行脱氧，并按步骤1.3.3和1.3.4所述继续操作。</li>
		<li>第三次注射完成后，在搅拌条件下让溶液熟化15分钟。</li>
		<li>向反应容器中加入1.5 ml 1 M柠檬酸钠溶液，以螯合溶液中游离的金属离子。</li>
		<li>将反应液转移至50 ml离心管中，以4,350 × g离心30分钟，并将上清液通过0.22 µm针式滤器过滤。此时，滤过的上清液可在4 °C下保存至后续纯化步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离子交换色谱
	<ol>
		<li>使用蠕动泵以10 ml/min的流速，将样品加载至装有阳离子基质的色谱柱（直径2.5 cm，长20 cm）中。</li>
		<li>使用梯度泵以10 ml/min的流速，用约100 ml洗脱缓冲液（50 mM三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）缓冲液，pH 8.0）洗涤色谱柱。</li>
		<li>为洗脱蛋白，以10 ml/min的流速用含逐步增加浓度的氯化钠（NaCl）的Tris缓冲液进行梯度洗脱：最终NaCl浓度分别为150、500和1,000 mM，每种浓度洗脱150 ml。</li>
		<li>由于蛋白在500 mM NaCl浓度下洗脱，使用自动组分收集器以50 ml为一份收集洗脱液。 
		注：有关离子交换色谱的详细方案，请参考已发表的文献26。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尺寸排阻色谱
	<ol>
		<li>使用15 ml离心浓缩管，随后换用4 ml体积的浓缩管，将150 ml磁性铁蛋白溶液浓缩至约2 ml。具体操作步骤请参考离心浓缩管制造商的说明书（见材料列表）。</li>
		<li>使用进样环将浓缩后的样品加载至凝胶过滤色谱柱中。</li>
		<li>以1.3 ml/min的流速，用运行缓冲液（含150 mM NaCl的50 mM Tris缓冲液，pH 8.0）洗涤色谱柱。</li>
		<li>使用自动组分收集器收集每份6 ml的洗脱液。蛋白单体最后洗脱。此时，纯化的磁性铁蛋白可在4 °C下保存至后续阳离子化处理。 
		注：有关使用凝胶过滤柱进行尺寸排阻色谱的详细方案，请参考已发表的文献27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定蛋白浓度
	<ol>
		<li>使用市售的马脾铁蛋白，在50 mM Tris缓冲液中配制0.06、0.125、0.25、0.5和1 mg/ml的铁蛋白标准品。 
		注：市售铁蛋白的蛋白浓度标注于瓶身。若无标注，请联系供应商获取相关信息。</li>
		<li>将未知浓度的磁性铁蛋白样品用50 mM Tris缓冲液稀释，直至其颜色与0.5 mg/ml标准品相近。记录稀释倍数。</li>
		<li>将各标准品及磁性铁蛋白样品各取10 μl，每样设三个重复，加入96孔板的孔中。</li>
		<li>向每孔加入200 μl预混好的Bradford试剂（详见材料列表中的Bradford试剂信息）。</li>
		<li>室温孵育8分钟。</li>
		<li>使用酶标仪在λ = 595 nm处测定吸光度。</li>
		<li>以铁蛋白标准品的平均吸光度对蛋白浓度作图，利用线性拟合的斜率和截距计算磁性铁蛋白样品的浓度。 
		注：计算时需考虑用于匹配标准曲线的磁性铁蛋白样品的稀释倍数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 磁性铁蛋白阳离子化
<ol>
	<li>一般说明 
	注意：对于磁铁蛋白的阳离子化，使用 N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）将表面的天冬氨酸和谷氨酸残基与N,N-二甲基-1,3-丙二胺（DMPA）偶联。
	<ol>
		<li>在室温下搅拌条件下进行反应。以下方案适用于5 ml 总体积中 10 mg 磁铁蛋白的阳离子化（蛋白浓度为 2 mg/ml）。但可根据需要按比例放大或缩小，同时保持蛋白:DMPA:EDC 的比例一致，并保持缓冲液和磁铁蛋白溶液的体积比例。</li>
		<li>在阳离子化反应前，将磁铁蛋白样品对含有 50 mM NaCl 的 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7）进行透析。此步骤至关重要，旨在去除Tris洗脱缓冲液，避免Tris胺与EDC活化的羧酸残基发生非特异性反应。透析后测定蛋白浓度，并在阳离子化前将其调整至 4 mg/ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阳离子化操作步骤
	<ol>
		<li>称取 374 mg DMPA，溶于 2.5 ml 200 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液中。</li>
		<li>使用浓盐酸（6 M HCl）将溶液 pH 调至约 7。 
		注意：此步骤必须在通风橱中操作，因酸加入 DMPA 时会释放有毒气体！</li>
		<li>加入 2.5 ml 浓度为 4 mg/ml 的磁铁蛋白溶液（最终 MES 浓度为 100 mM，磁铁蛋白终浓度为 2 mg/ml，蛋白总量为 10 mg）。</li>
		<li>加入磁力搅拌子，搅拌 2 小时以达到平衡。</li>
		<li>使用 1 M HCl 小心将溶液 pH 调至 5.0。</li>
		<li>向 DMPA/磁铁蛋白混合液中加入 141 mg EDC 粉末。</li>
		<li>继续搅拌 3.5 小时。</li>
		<li>用 0.22 µm 注射器滤器过滤溶液，以去除任何沉淀物。</li>
		<li>将溶液装入截留分子量为 12–14 kDa 的透析袋中，于 4 °C 条件下对含 50 mM NaCl 的 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7）透析 2 天，期间至少更换透析缓冲液三次。 
		注意：此时阳离子化磁铁蛋白可在 4 °C 下保存，直至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用阳离子化磁性铁蛋白标记人源间充质干细胞
<ol>
	<li>一般注意事项
	<ol>
		<li>所有细胞培养操作均须在 II 级层流生物安全柜中进行，并使用 37 °C、5% 二氧化碳气氛的恒温培养箱。</li>
		<li>使用 175 cm2 培养瓶和 20 ml 培养基以单层形式培养细胞，每 3–4 天更换一次培养基。培养基成分为含 1,000 mg/L 葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），添加 10%（v/v）胎牛血清、1%（v/v）青霉素/链霉素溶液、1%（v/v）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液，以及新鲜添加的 5 ng/ml 人成纤维细胞生长因子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用阳离子化磁铁蛋白对 hMSC 进行磁性标记
	<ol>
		<li>将 150,000 个 hMSC 接种至 25 cm2 培养瓶中，于 37 °C 培养过夜使其贴壁。</li>
		<li>使用 0.22 µm 注射器滤器对阳离子化磁铁蛋白进行过滤除菌，并测定其蛋白浓度。</li>
		<li>在无菌条件下，将阳离子化磁铁蛋白用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成 0.5 μM 的溶液。盖好后置于无菌培养罩内，待用。</li>
		<li>用 2 ml 室温 PBS 洗涤已贴壁的细胞。</li>
		<li>向培养瓶中加入 1 ml 已除菌的阳离子化磁铁蛋白溶液，孵育所需时间（1 分钟至 1 小时）。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞，然后加入 0.5 ml 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，于 37 °C 孵育 5 分钟以消化细胞。</li>
		<li>加入 1 ml 培养基以中和胰蛋白酶/EDTA 活性，将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，于 524 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 0.5 ml 磁分离缓冲液中，该缓冲液由含 0.5%（w/v）胎牛血清和 2 mM EDTA 的 PBS 组成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性细胞分离
	<ol>
		<li>将磁铁固定在多用支架上，并将磁分离柱安装于磁铁上。在分离柱上方放置预分离滤器。</li>
		<li>向预分离滤器中加入 0.5 ml 磁分离缓冲液，使其流经滤器和分离柱，以洗涤并润湿装置。</li>
		<li>在分离柱下方放置一个 15 ml 离心管。</li>
		<li>将 0.5 ml 细胞悬液加入磁分离柱的滤器储液槽中。</li>
		<li>当储液槽排空后，加入 0.5 ml 磁分离缓冲液。</li>
		<li>当储液槽再次排空后，再加入 0.5 ml 磁分离缓冲液。</li>
		<li>重复一次上述步骤（洗涤所用磁分离缓冲液的总体积应为 1.5 ml）。此洗涤步骤可将所有非磁性标记细胞从柱中洗脱（非磁性细胞组分）。</li>
		<li>将分离柱从磁铁上取下，放入一个新的 15 ml 离心管中，并移除柱上储液槽中的滤器。</li>
		<li>向储液槽中加入 1 ml 磁分离缓冲液，并立即使用厂家提供的推杆将液体推过分离柱。此操作可将磁性标记的细胞从柱中洗脱至离心管中（磁性细胞组分）。</li>
		<li>将两个离心管均于 524 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀分别重悬于 0.3 ml PBS 中。</li>
		<li>使用血细胞计数板对各组分中的细胞数量进行计数。</li>
		<li>使用以下公式计算磁性标记细胞的比例 M(%)： 
		<img alt="质量百分比公式，方程 M(%)=100·n(M)/n(M+NM)，化学计算。" src="/files/ftp_upload/54785/54785eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程">  
		其中 n(M) 表示磁性细胞组分中的细胞数，n(M+NM) 表示磁性与非磁性细胞组分中细胞数的总和。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）定量铁含量，制备经阳离子化磁铁蛋白标记的 hMSC 
	注意：本方案可能需要根据其他 ICP-OES 仪器进行调整，建议咨询相关技术人员。
	<ol>
		<li>将已知数量的细胞于 524 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去 PBS 上清液，加入 0.25 ml 50%（v/v）硝酸。</li>
		<li>涡旋振荡酸化后的细胞悬液。</li>
		<li>于室温孵育过夜。</li>
		<li>向每个样品中加入 4.75 ml 去离子水，并涡旋混匀。</li>
		<li>使用 ICP-OES 进行分析。28</li>
		<li>将测得的铁含量按细胞数量进行归一化，以确定细胞内铁含量值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

经金硫葡萄糖染色的磁性铁蛋白样品的透射电子显微镜（TEM）结果显示，纳米颗粒在蛋白质笼内成功实现了矿化。对纳米颗粒核心进行电子衍射和拉曼分析表明存在钴铁氧体，说明纳米颗粒核心已成功掺杂钴元素。这证明混合氧化物纳米颗粒可在脱辅基铁蛋白空腔内成功矿化。此外，我们先前的研究已表明，通过调节反应体系中钴前驱体的添加量可改变钴的掺杂程度，从而实现对磁学性能的调控。18
磁铁蛋白的合成可在多种容器中进行，只要容器能够严密封闭，并具有可引入反应物的接入端口（例如，三颈圆底烧瓶）。反应温度应通过将容器置于水浴或油浴中，或使用双层夹套容器，维持在 65 °C。本实验中，我们采用双层夹套电化学池装置进行合成。为确保合成成功，维持正确的 pH 值并避免水溶液被氧气污染至关重要。金属盐溶液应始终在使用前新鲜配制，而非提前准备。此外，市售脱铁铁蛋白溶液的质量可能存在差异，从而影响合成结果（例如，矿化纳米颗粒核心的尺寸）。在合成前将脱铁铁蛋白溶液透析至 50 mM HEPES 缓冲液（pH 8.6）中，有助于去除制造商可能残留的还原剂。建议记录用于合成的脱铁铁蛋白溶液的批号，以便后续需要采购时可向供应商明确指定该批次产品。此外，市售脱铁铁蛋白的蛋白浓度通常标注于瓶身，可用于计算合成所需脱铁铁蛋白溶液的体积。若未标注，应联系供应商获取该信息。
逐步添加金属盐和过氧化氢的优势——如本文及先前报道所述——在于可控制纳米颗粒核心的矿化过程，从而实现不同的负载因子（即， 可实现纳米颗粒尺寸的调控。33 此外，可以使用磁性分离柱进一步纯化磁铁蛋白， 例如， 由电磁铁固定的、内装不锈钢粉末的色谱柱。34 因此，可以从大量磁性铁蛋白样品中分离出高度单分散的纳米颗粒核心。然而，如本文所述的磁性细胞标记应用则无需进行此分离步骤。磁性铁蛋白合成的一个局限性在于其合成产率相对较低，约为10%，且商用脱铁铁蛋白溶液的成本较高。然而，脱铁铁蛋白也可通过已建立的去矿化方案，从价格低廉的马脾铁蛋白制备获得。16
通过向每个带负电荷的残基添加250个分子的DMPA和50个分子的EDC（基于马脾铁蛋白氨基酸序列计算），实现了磁性铁蛋白的阳离子化。试剂相对于蛋白质的过量使用导致了高效的阳离子化，其效率与先前报道的铁蛋白阳离子化结果相当。35 由于磁性铁蛋白核心的分子质量过大，进行MALDI-TOF分析时使用了脱辅基铁蛋白及其阳离子化产物。为了获得高效的阳离子化，最佳pH值也至关重要。EDC介导的交联在弱酸性条件下最为有效，我们发现pH 5可使磁性铁蛋白获得最佳的阳离子化效果。然而，对于其他蛋白质，阳离子化的pH可能需要进一步优化。应避免在蛋白质等电点或其附近进行阳离子化，因为这可能导致严重的沉淀。
使用阳离子化磁性铁蛋白对干细胞进行磁化标记效率很高，且孵育时间远低于30分钟即可实现。即使仅孵育1分钟，细胞内的铁含量也可达到3.6 pg，该数值处于已报道的可影响MRI的T2和T2*对比度所需的铁含量范围内36,37。值得注意的是，这种高效的标记可在较低的细胞外铁浓度下实现。例如，既往使用阴离子纳米颗粒的研究报道，在5 mM铁浓度下孵育30分钟，每细胞铁含量为10 pg38。相比之下，使用含0.5 μM蛋白的阳离子化磁性铁蛋白溶液孵育，相当于在约0.2 mM铁浓度下进行，30分钟后每细胞铁含量也可达到约10 pg。我们未能通过透射电子显微镜（TEM）明确识别出内吞囊泡。然而，既往使用阳离子化铁蛋白的研究发现，其在暴露后的最初10分钟内即已完成内化39,40。阳离子化铁蛋白可定位于包被囊泡中，提示其内吞机制可能依赖于网格蛋白或小窝蛋白。这些研究还报道，在孵育30分钟后，阳离子化铁蛋白仍可在细胞表面以及多泡体（类似溶酶体结构）中被检测到。
进一步的应用可能包括对装载了其他纳米颗粒和/或功能分子（如抗癌药物41或量子点42）的脱铁铁蛋白笼进行阳离子化。对这些铁蛋白结构进行阳离子化可实现其携带物向细胞的更快且更高效的递送。

超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）在细胞表面的结合或被细胞内化，已实现多种细胞类型的磁化，可用于成像和远程操控等应用。1 然而，实现足够的细胞磁化仍具挑战性，特别是当SPION与细胞表面相互作用较弱时。2 过去常采用延长暴露时间或高浓度SPION的方法来应对这一挑战。3,4 然而，这些策略存在问题，因为它们会增加毒性5,6，并且对于内化率较低的细胞类型（如淋巴细胞）效果极为有限。7 为增强SPIONs的细胞摄取，已探索了多种表面功能化方法。例如，可利用抗体促进受体介导的内吞作用8，也可使用转染试剂9,10或穿膜分子（如HIV tat-肽）实现非特异性摄取。11,12 然而，抗体和肽类功能化方法受限于试剂成本高和合成制备复杂，而转染试剂则可能导致纳米颗粒沉淀并负面影响细胞功能。13,14
我们近期报道了化学阳离子化磁性铁蛋白的合成，这是一种新型超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION），仅需短至一分钟的孵育时间即可高效实现人源间充质干细胞（hMSCs）的磁化15。磁性铁蛋白是通过在去矿化的铁储存蛋白铁蛋白的空腔内重建超顺磁性氧化铁纳米核而合成的16。这种基于蛋白质的SPION结合了多种有利于细胞磁化的特性，例如可调控磁性核心的磁学性质17-19，以及由蛋白质外壳赋予的生物相容性和水溶性。此外，由于其表面存在可靶向修饰的氨基酸残基，易于实现化学20-22或基因工程23-25的表面功能化。我们已证实，对蛋白质外壳上的酸性氨基酸残基进行化学阳离子化修饰，可生成稳定的纳米颗粒，该颗粒能迅速与细胞表面的阴离子区域相互作用，从而实现快速且持久的细胞磁化。该方法无需繁琐的功能化步骤和长时间孵育流程，且由于其非特异性的标记机制，这种快速磁化策略有望广泛应用于其他类型的细胞。本文详细报道了这种超快速细胞标记方法，包括阳离子化磁性铁蛋白的合成、纯化及表面功能化的具体实验方案。

<table><tbody><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPE310-1</td><td>粉末；配制成 pH 8.6 的 1 M 储存液，使用前稀释至 50&amp;nbsp;mM。合成前请仔细检查 pH！</td></tr><tr><td>马脾脱铁铁蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3641</td><td>我们使用了批号 #081M7011V</td></tr><tr><td>七水合硫酸钴&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>使用前用盐新配制溶液</td></tr><tr><td>六水合硫酸亚铁铵&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1543</td><td>使用前用盐新配制溶液</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液 (30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>使用前用盐新配制溶液</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>粉末；可配制成 1 M 溶液，在室温下可保存数月</td></tr><tr><td>Millex GP 滤器单元，0.22&amp;nbsp;微米</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>注射器滤器</td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>粉末；配制成 pH 8.0 的 1 M 储存液，使用前稀释至 50&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434</td><td>粉末；按需加入缓冲液中</td></tr><tr><td>Centriprep 离心滤过装置</td><td>Merck Millipore</td><td>4310</td><td>Ultracel YM-50 膜，12 ml 体积；用于初步浓缩，将磁性铁蛋白溶液从约 150 ml 浓缩至 20&amp;nbsp;ml</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 离心滤过装置</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Ultracel-10 膜，4&amp;nbsp;ml 体积；用于将磁性铁蛋白溶液从约 20 ml 浓缩至&amp;nbsp;2 ml</td></tr><tr><td>ANX Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1287-04</td><td>我们自行装填该层析柱</td></tr><tr><td>HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 层析柱&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1196-01</td><td>该层析柱为预装柱</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA 纯化系统</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td></td></tr><tr><td>样品泵 P-960</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6727-00</td><td>以 10 ml/min 的流速上样</td></tr><tr><td>自动组分收集器 Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 检测试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916</td><td>即用型溶液</td></tr><tr><td>铁蛋白 I 型：来源于马脾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4503</td><td>用此溶液配制铁蛋白标准品，以测定磁性铁蛋白浓度</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二甲基-1,3-丙二胺 (DMPA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>308110</td><td>&lt;strong&gt;注意：&lt;/strong&gt;调节 DMPA 溶液 pH 时，应在通风橱中操作</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-二甲基氨基丙基)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;&amp;rsquo;-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6383</td><td>保存于冷冻柜中，使用前恢复至室温再打开瓶盖</td></tr><tr><td>2-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-吗啉代)乙磺酸 (MES)</td><td>AppliChem</td><td>A0689,0500</td><td>粉末；配制成 pH 5 的 200 M 储存液</td></tr><tr><td>透析袋纤维素膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9652</td><td>使用前在去离子水中浸泡 10 分钟</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 (DMEM)，葡萄糖含量 1,000 mg/L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5546</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>加入 DMEM 储存液瓶中，终浓度为 10% (v/v)</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td>加入 DMEM 储存液瓶中，终浓度为 1% (v/v)</td></tr><tr><td>GlutaMAX 溶液</td><td>Gibco</td><td>35050-087</td><td>加入 DMEM 储存液瓶中，终浓度为 1% (v/v)</td></tr><tr><td>人成纤维细胞生长因子</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>每次更换培养基时新鲜加入细胞培养瓶中；终浓度为 5 ng/ml</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>无菌溶液，用于细胞培养</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td>保存于冷冻柜中，使用前在 37&amp;nbsp;&amp;deg;C 水浴中解冻</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td>粉末；在 PBS 中配制成 2 mM 溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>在 PBS 中的 2&amp;nbsp;mM EDTA 溶液中加入 0.5% (w/v)；用磁力搅拌器小心搅拌，避免起泡；经 0.22 微米注射器滤器过滤除菌</td></tr><tr><td>MACS 多功能支架&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>用于固定 MACS 磁铁</td></tr><tr><td>MACS MS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>一次性使用；设计为单次使用，但如果不要求无菌，可重复使用：用去离子水和 100% 乙醇清洗，并置于干燥烘箱中；若发现生锈斑点则应丢弃</td></tr><tr><td>MiniMACS 分离磁铁</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td>可作为起始套装购买，包含层析柱和支架</td></tr><tr><td>MACS 柱预分离滤器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>30 mm 滤器</td></tr><tr><td>硝酸溶液，64-66%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7006</td><td></td></tr><tr><td>Titrando 907，注射泵</td><td>Metrohm</td><td>2.907.0020</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;用于表征磁性铁蛋白及阳离子化磁性铁蛋白的设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>用于 Bradford 检测中的吸光度测定</td></tr><tr><td>JEM 1200 EX</td><td>JEOL</td><td></td><td>用于磁性铁蛋白的透射电子显微镜成像</td></tr><tr><td>InVia 拉曼光谱仪</td><td>Renishaw</td><td></td><td>用于拉曼光谱分析</td></tr><tr><td>Torus DPSS 激光器</td><td>Laser Quantum</td><td></td><td>用于拉曼光谱分析</td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>用于脱铁铁蛋白及阳离子化脱铁铁蛋白的 MALDI-TOF 分析</td></tr><tr><td>ZetaSizer Nano-ZS</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>用于测定磁性铁蛋白及阳离子化磁性铁蛋白的流体动力学直径和泽塔电位</td></tr><tr><td>磁性性能测量系统</td><td>Quantum Design</td><td></td><td>用于测定磁饱和矩和磁化率</td></tr><tr><td>Magnetom Skyra</td><td>Siemens</td><td></td><td>用于测定纵向和横向弛豫率&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnai 12 BioTwin Spirit</td><td>FEI</td><td></td><td>用于经阳离子化磁性铁蛋白标记的人间充质干细胞的透射电子显微镜成像</td></tr><tr><td>710 ICP-OES</td><td>Agilent</td><td></td><td>用于测定细胞内的铁含量</td></tr></tbody></table>

合成阳离子化磁铁蛋白用于细胞的超快速磁化

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

许多重要的生物医学应用，例如细胞成像和远程操控，可以通过使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）标记细胞来实现。实现足够的细胞摄取SPIONs一直是一个挑战，传统方法通常通过提高SPIONs的浓度或延长暴露时间（长达72小时）来解决。然而，这些策略可能引发毒性。本文介绍了基于蛋白质的SPION磁铁蛋白（magnetoferritin）的合成方法，以及一种简便的表面功能化方案，可在低浓度暴露条件下实现快速细胞磁化。磁铁蛋白中的SPION核心为掺钴的氧化铁，平均粒径为8.2 nm，矿化于马脾无铁形式的铁蛋白（apo-ferritin）空腔内。通过对磁铁蛋白进行化学阳离子化修饰，获得了一种新型的、具有高度细胞膜活性的SPION，可在低至0.2 mM的铁浓度下，仅需一分钟孵育时间即可实现人源间充质干细胞（hMSCs）的磁化。

透射电子显微镜（TEM）用于确认载铁蛋白空腔内纳米颗粒的矿化情况，并测定其平均核尺寸（图 1A 和 1B）。对未染色的磁性载铁蛋白样品进行图像分析，得到平均核直径为 8.2 ± 0.7 nm，金硫葡萄糖染色证实了蛋白质笼内存在纳米颗粒。需要注意的是，图像所示为经过磁分离进一步纯化以获得均匀纳米颗粒核的磁性载铁蛋白样品；未经磁性纯化的磁性载铁蛋白样品其核尺寸分布略宽29。通过选区电子衍射对磁性载铁蛋白核结构进行分析，结果显示可能存在基于磁铁矿（Fe3O4）和/或磁赤铁矿（γ-Fe2O3）的反尖晶石结构，以及由于 Co3O4 引起的尖晶石结构。此外，拉曼光谱显示存在归属于 Fe3O4 的峰，以及少量 γ-Fe2O3 和钴铁氧体的特征峰（图 1C）。ICP-OES 分析表明，每毫克磁性载铁蛋白中含有平均 102 μg 铁和 0.9 μg 钴。
附示意图说明后续的阳离子化步骤（图 2 A）。通过动态光散射测定，磁性铁蛋白（magnetoferritin）和阳离子化磁性铁蛋白的流体动力学直径分别为 11.8 ± 1.1 nm 和 12.5 ± 1.4 nm。采用ζ电位测定法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对DMPA共价偶联至磁性铁蛋白的阳离子化效率进行了评估。ζ电位由磁性铁蛋白（MF）的 -10.5 mV 变为阳离子化磁性铁蛋白的 +8.3 mV，证实其表面电位由负变正（表 1）。质谱实验测得天然脱辅基铁蛋白（apo-ferritin）亚基的分子量为 20.1 kDa，阳离子化脱辅基铁蛋白亚基为 21.1 kDa（图 2 B）。该分子量增加对应每个蛋白亚基上约偶联了 12 个 DMPA 分子，整个由 24 个亚基组成的蛋白共修饰了 288 个残基。
采用SQUID磁强计测量磁饱和度和磁化率，并利用磁共振成像测量横向和纵向弛豫率。磁铁蛋白与阳离子化磁铁蛋白的磁学性质相似，表明阳离子化对所包埋的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）的磁学性质影响可忽略不计（表1）。此外，这些性质与其他基于氧化铁的纳米颗粒相似19,30，表明阳离子化磁铁蛋白在增强成像对比度方面，可与传统的基于SPION的磁共振成像对比剂同样有效。
经过30分钟孵育后，细胞表面被阳离子化磁铁蛋白密集覆盖（图3 A）。然而，一周后细胞表面未检测到任何纳米颗粒（图3 B）。阳离子化磁铁蛋白在磁性标记人骨髓间充质干细胞（hMSCs）方面表现出显著效果。值得注意的是，细胞仅暴露于阳离子化磁铁蛋白1分钟，即可实现92%细胞群体的磁化，并向每个细胞递送3.6 pg铁。将孵育时间延长至15分钟，可使全部细胞群体实现磁化（图3 C）。
<img alt="磁性纳米颗粒的透射电镜图像及拉曼光谱，显示钴掺杂铁氧体、磁铁矿和γ-氧化铁。" src="/files/ftp_upload/54785/54785fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1： 掺杂 5% 钴的磁性铁蛋白核心的表征。 经硫代葡萄糖金染色（A）和未染色（B）的磁性铁蛋白透射电镜图像。插图为对应电子衍射图，标有磁铁矿的衍射指数。比例尺：20 nm。（C）磁性铁蛋白的拉曼光谱。箭头所示分别为钴掺杂铁氧体（T2g）、磁铁矿和γ-氧化铁（均为 A1g）的主要拉曼振动模式。31,32 所用激光波长为 532 nm。（图像改编自 Okuda et al.18）。需注意，该磁性铁蛋白样品经磁分离进一步纯化，从而获得负载均匀的磁性铁蛋白颗粒。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="纳米颗粒修饰过程；质谱图；蛋白质分析；12 nm 粒径。" src="/files/ftp_upload/54785/54785fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2： 磁性铁蛋白的阳离子化。A) 溶剂可及表面积示意图，显示蛋白质表面酸性（红色）和碱性（黄色）氨基酸残基的分布。磁性铁蛋白（1）通过DMPA与蛋白质表面酸性氨基酸残基的碳二亚胺介导交联，被修饰为阳离子化磁性铁蛋白（2）（3）。B) 脱辅基铁蛋白和阳离子化脱辅基铁蛋白亚基的质谱分析。通过MALDI-TOF获得的脱辅基铁蛋白（ApoF）和阳离子化脱辅基铁蛋白（cat-ApoF）的质荷比（m/z）谱图。阳离子化后，分子量从20.1 kDa增加至21.1 kDa。（图片改编自Correia Carreira et al.15）<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞磁化过程；显微镜图像、图表；标记后不同时间点的铁摄取量（分钟）" src="/files/ftp_upload/54785/54785fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 使用阳离子化磁性铁蛋白孵育后人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的磁性标记与细胞分离。 A) hMSCs 经阳离子化磁性铁蛋白孵育30分钟后透射电子显微镜（TEM）图像。箭头指示磁性铁蛋白核心密集聚集在细胞表面。比例尺：200 nm。 B) 标记后一周的 hMSCs 透射电子显微镜图像。细胞表面已无阳离子化磁性铁蛋白残留。 C) 磁性标记速度的研究：在0.5 μM阳离子化磁性铁蛋白中暴露1分钟后，92%的细胞群体已被磁化，整个细胞群体在15分钟内完成磁化。每细胞铁含量通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定。数据展示三个生物学重复的平均值及标准差。（图像改编自 Correia Carreira et al.15） <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MF</td>
			<td>cat-MF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>流体动力学直径 [nm]</td>
			<td>11.8 ± 1.1</td>
			<td>12.5 ± 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeta 电位 [mV]</td>
			<td>(-)10.4 ± 0.2</td>
			<td>8.3 ± 0.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磁饱和矩 [Am2 kg-1]</td>
			<td>54.9 ± 1.6</td>
			<td>55.3 ± 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>质量磁化率 [x 104 m3 kg-1]</td>
			<td>1.75 ± 0.08</td>
			<td>1.75 ± 0.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纵向弛豫率 [mM-1 sec-1]</td>
			<td>2.6 ± 0.1</td>
			<td>2.3 ± 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>横向弛豫率 [mM-1 sec-1]</td>
			<td>44.6 ± 1.0</td>
			<td>52.8 ± 0.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：磁性铁蛋白（MF）和阳离子化磁性铁蛋白（cat-MF）的理化表征。（表格改编自 Correia Carreira 等15）

本文介绍了一种掺钴磁性铁蛋白的合成与阳离子化方案，以及利用阳离子化磁性铁蛋白快速磁化干细胞的方法。

许多重要的生物医学应用，例如细胞成像和远程操控，可通过使用超顺磁性氧化铁标记细胞来实现。

本方法的总体目标是在蛋白质笼内合成磁性纳米颗粒，然后对蛋白质进行功能化修饰，使其能够快速将磁性纳米颗粒连接到细胞上。该方法可用于制备能够实现细胞快速高效磁性标记的磁性纳米颗粒，这在磁共振成像（MRI）或磁性细胞分离等应用中具有重要意义。该技术的主要优势在于，仅需使用较低浓度的纳米颗粒并经过短暂孵育即可实现细胞磁化，从而避免因纳米颗粒暴露可能带来的不良影响。首先，将连接至氮气钢瓶的管子插入500毫升去离子水中，并用保鲜膜密封容器，以对去离子水进行脱氧处理。随后通入氮气约60分钟。将与双夹套反应容器相连的水浴加热至65摄氏度。然后，向反应容器中加入 75 毫升 50 毫摩尔的 HEPES 缓冲液（pH 8.6）。密封容器，并通过向缓冲液中通入氮气约 20 分钟以去除氧气。同时，使用磁力搅拌器搅拌缓冲液。脱氧 HEPES 缓冲液后，将氮气管从缓冲液中取出，但仍悬置于溶液上方，以维持氮气环境。加入脱铁铁蛋白，使其终浓度达到 3 毫克/毫升。继续磁力搅拌，若出现泡沫则降低搅拌速度。在合成磁性铁蛋白时，使用两个注射泵以每分钟0.15毫升的流速，同时将10.1毫升铁-钴前体溶液和10.1毫升过氧化氢注入脱辅基铁蛋白溶液中。随后按照文本方案中所述的步骤继续完成合成。然后，使用蠕动泵以每分钟10毫升的流速将样品加载到含有阳离子基质的层析柱上。使用梯度泵，以每分钟10毫升的流速，用约100毫升的运行缓冲液洗涤层析柱。为洗脱蛋白质，以每分钟10毫升的流速，用150毫升浓度逐渐升高的氯化钠和Tris缓冲液洗涤层析柱。由于蛋白质在500毫摩尔的氯化钠浓度下洗脱，使用自动组分收集器以每份50毫升的体积收集洗脱组分。使用15毫升离心过滤装置，随后使用4毫升体积的过滤装置，将150毫升的磁性铁蛋白浓缩至约2毫升体积。有关此操作的详细步骤，请参考离心过滤装置制造商提供的说明书。接下来，使用进样环将浓缩后的样品上样至凝胶过滤柱中。用运行缓冲液以每分钟1.3毫升的流速洗涤层析柱。使用自动组分收集器收集6毫升的组分。蛋白质单体最后洗脱出来。此时，纯化的磁铁蛋白可在四摄氏度下保存，直至进行阳离子化处理。对于 10 毫克磁铁蛋白，称取 374 毫克 DMPA 并溶于 2.5 毫升 200 毫摩尔每升 MES 缓冲液中。使用浓盐酸将溶液 pH 值调节至约 7。调节DMPA溶液pH值时会释放有毒气体，务必在通风橱中操作。加入2.5毫升浓度为4毫克/毫升的磁铁蛋白溶液。加入磁力搅拌子，搅拌两小时以达到平衡。将溶液 pH 值调节至 5.0 后，向 DMPA 磁性铁蛋白溶液中加入 141 毫克 EDC 粉末。继续搅拌 3.5 小时。用0.22微米的注射器滤器过滤溶液，以去除任何沉淀物，并按照文本方案所述透析蛋白质。按照文本方案所述培养hMSCs。用2毫升室温PBS洗涤培养板上的细胞。然后，在培养皿中的细胞中加入1 mL灭菌的阳离子化磁性铁蛋白溶液，并在所需时间范围内进行孵育。用PBS洗涤细胞，随后加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在37°C孵育5分钟以收获细胞。加入1 mL培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA后，将溶液转移至15 mL离心管中，在524 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于0.5 mL磁分离缓冲液中。接下来，将磁铁固定在多功能支架上，并将磁性分离柱安装到磁铁上。在分离柱上放置预分离滤膜。然后，向预分离滤膜中加入 0.5 毫升磁性分离缓冲液，使其流经滤膜和分离柱，以洗涤二者。接下来，将一个15毫升离心管置于柱子下方，并将0.5毫升细胞悬液加入磁性分离柱的滤器储液室中。当储液室排空后，加入0.5毫升磁性分离缓冲液。当储液室再次排空后，再加入0.5毫升磁性分离缓冲液。再重复洗涤一次，磁性分离缓冲液总体积为1.5毫升。此洗涤步骤可洗脱柱中所有非磁性细胞。将柱子从磁铁上取下，放入一个新的15毫升离心管中。然后，从柱子的储液 reservoir 中取出滤膜。向储液 reservoir 中加入 1 毫升磁性分离缓冲液，并立即使用厂家提供的推杆将液体推过柱子。此步骤可将磁标记的细胞从柱子中洗脱至离心管中。按照文中的实验方案进行铁含量定量。负染透射电子显微镜图像显示，磁性铁蛋白样品中的纳米颗粒已在蛋白质笼内形成。Zeta电位测定结果证实，经阳离子化处理后，磁性铁蛋白表面带有正电荷。将人源间充质干细胞暴露于阳离子化磁铁蛋白仅一分钟，即可使92%的细胞群体被磁化，并向每个细胞递送3.6皮克的铁。将孵育时间延长至15分钟，可实现全部细胞群体的磁化。观看本视频后，您应掌握如何通过将金属盐前体依次加入蛋白质溶液，在脱铁铁蛋白空腔内合成磁性纳米颗粒的方法。然后，介绍如何使用TMPA偶联对蛋白质进行化学阳离子化。一旦掌握，若操作得当，磁性铁蛋白的合成、纯化和阳离子化可在三天内完成。在进行该实验过程中，重要的是避免氧气污染，并在整个磁性铁蛋白合成过程中维持适当的温度和pH值。在此方法的基础上，可将其他货物分子如量子点或治疗剂封装于阳离子化脱铁铁蛋白笼中，以实现这些物质向细胞更高效的递送。该技术可为磁性细胞操控领域的研究人员探索磁性标记提供新途径，尤其适用于那些对纳米颗粒摄取能力较差，或对长时间纳米颗粒暴露及高浓度纳米颗粒敏感的细胞类型。

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科研

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Bioengineering

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