合成阳离子化磁铁蛋白用于细胞的超快速磁化

本方法的总体目标是在蛋白质笼内合成磁性纳米颗粒，然后对蛋白质进行功能化修饰，使其能够快速将磁性纳米颗粒连接到细胞上。该方法可用于制备能够实现细胞快速高效磁性标记的磁性纳米颗粒，这在磁共振成像（MRI）或磁性细胞分离等应用中具有重要意义。该技术的主要优势在于，仅需使用较低浓度的纳米颗粒并经过短暂孵育即可实现细胞磁化，从而避免因纳米颗粒暴露可能带来的不良影响。

首先，将连接至氮气钢瓶的管子插入500毫升去离子水中，并用保鲜膜密封容器，以对去离子水进行脱氧处理。随后通入氮气约60分钟。将与双夹套反应容器相连的水浴加热至65摄氏度。

然后，向反应容器中加入 75 毫升 50 毫摩尔的 HEPES 缓冲液（pH 8.6）。密封容器，并通过向缓冲液中通入氮气约 20 分钟以去除氧气。同时，使用磁力搅拌器搅拌缓冲液。

脱氧 HEPES 缓冲液后，将氮气管从缓冲液中取出，但仍悬置于溶液上方，以维持氮气环境。加入脱铁铁蛋白，使其终浓度达到 3 毫克/毫升。继续磁力搅拌，若出现泡沫则降低搅拌速度。

在合成磁性铁蛋白时，使用两个注射泵以每分钟0.15毫升的流速，同时将10.1毫升铁-钴前体溶液和10.1毫升过氧化氢注入脱辅基铁蛋白溶液中。随后按照文本方案中所述的步骤继续完成合成。然后，使用蠕动泵以每分钟10毫升的流速将样品加载到含有阳离子基质的层析柱上。

使用梯度泵，以每分钟10毫升的流速，用约100毫升的运行缓冲液洗涤层析柱。为洗脱蛋白质，以每分钟10毫升的流速，用150毫升浓度逐渐升高的氯化钠和Tris缓冲液洗涤层析柱。由于蛋白质在500毫摩尔的氯化钠浓度下洗脱，使用自动组分收集器以每份50毫升的体积收集洗脱组分。

使用15毫升离心过滤装置，随后使用4毫升体积的过滤装置，将150毫升的磁性铁蛋白浓缩至约2毫升体积。有关此操作的详细步骤，请参考离心过滤装置制造商提供的说明书。接下来，使用进样环将浓缩后的样品上样至凝胶过滤柱中。

用运行缓冲液以每分钟1.3毫升的流速洗涤层析柱。使用自动组分收集器收集6毫升的组分。蛋白质单体最后洗脱出来。

此时，纯化的磁铁蛋白可在四摄氏度下保存，直至进行阳离子化处理。对于 10 毫克磁铁蛋白，称取 374 毫克 DMPA 并溶于 2.5 毫升 200 毫摩尔每升 MES 缓冲液中。使用浓盐酸将溶液 pH 值调节至约 7。

调节DMPA溶液pH值时会释放有毒气体，务必在通风橱中操作。加入2.5毫升浓度为4毫克/毫升的磁铁蛋白溶液。

加入磁力搅拌子，搅拌两小时以达到平衡。将溶液 pH 值调节至 5.0 后，向 DMPA 磁性铁蛋白溶液中加入 141 毫克 EDC 粉末。继续搅拌 3.5 小时。

用0.22微米的注射器滤器过滤溶液，以去除任何沉淀物，并按照文本方案所述透析蛋白质。按照文本方案所述培养hMSCs。用2毫升室温PBS洗涤培养板上的细胞。

然后，在培养皿中的细胞中加入1 mL灭菌的阳离子化磁性铁蛋白溶液，并在所需时间范围内进行孵育。用PBS洗涤细胞，随后加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在37°C孵育5分钟以收获细胞。加入1 mL培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA后，将溶液转移至15 mL离心管中，在524 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于0.5 mL磁分离缓冲液中。

接下来，将磁铁固定在多功能支架上，并将磁性分离柱安装到磁铁上。在分离柱上放置预分离滤膜。然后，向预分离滤膜中加入 0.5 毫升磁性分离缓冲液，使其流经滤膜和分离柱，以洗涤二者。

接下来，将一个15毫升离心管置于柱子下方，并将0.5毫升细胞悬液加入磁性分离柱的滤器储液室中。当储液室排空后，加入0.5毫升磁性分离缓冲液。当储液室再次排空后，再加入0.5毫升磁性分离缓冲液。

再重复洗涤一次，磁性分离缓冲液总体积为1.5毫升。此洗涤步骤可洗脱柱中所有非磁性细胞。将柱子从磁铁上取下，放入一个新的15毫升离心管中。

然后，从柱子的储液 reservoir 中取出滤膜。向储液 reservoir 中加入 1 毫升磁性分离缓冲液，并立即使用厂家提供的推杆将液体推过柱子。此步骤可将磁标记的细胞从柱子中洗脱至离心管中。

按照文中的实验方案进行铁含量定量。负染透射电子显微镜图像显示，磁性铁蛋白样品中的纳米颗粒已在蛋白质笼内形成。Zeta电位测定结果证实，经阳离子化处理后，磁性铁蛋白表面带有正电荷。

将人源间充质干细胞暴露于阳离子化磁铁蛋白仅一分钟，即可使92%的细胞群体被磁化，并向每个细胞递送3.6皮克的铁。将孵育时间延长至15分钟，可实现全部细胞群体的磁化。观看本视频后，您应掌握如何通过将金属盐前体依次加入蛋白质溶液，在脱铁铁蛋白空腔内合成磁性纳米颗粒的方法。

然后，介绍如何使用TMPA偶联对蛋白质进行化学阳离子化。一旦掌握，若操作得当，磁性铁蛋白的合成、纯化和阳离子化可在三天内完成。在进行该实验过程中，重要的是避免氧气污染，并在整个磁性铁蛋白合成过程中维持适当的温度和pH值。

在此方法的基础上，可将其他货物分子如量子点或治疗剂封装于阳离子化脱铁铁蛋白笼中，以实现这些物质向细胞更高效的递送。该技术可为磁性细胞操控领域的研究人员探索磁性标记提供新途径，尤其适用于那些对纳米颗粒摄取能力较差，或对长时间纳米颗粒暴露及高浓度纳米颗粒敏感的细胞类型。