对细胞的超快磁化阳离子化Magnetoferritin的合成

该方法的总体目标是在蛋白质笼内合成磁性纳米颗粒，然后将蛋白质功能化，使其能够使磁性纳米颗粒快速附着在细胞上。该方法可用于生成磁性纳米颗粒，从而能够快速有效地对细胞进行磁性标记，这对于 MRI 或磁性细胞分离等应用非常重要。该技术的主要优点是可以使用低纳米颗粒浓度和较短的孵育时间实现细胞磁化，从而防止因纳米颗粒暴露而产生的潜在不利影响。

首先，将一根连接到氮气瓶的管子放入水中并用保鲜膜密封容器，对 500 毫升去离子水进行脱氧。然后，将氮气鼓泡约 60 分钟。将连接到双层夹套反应容器的水浴加热至 65 摄氏度。

然后，将 75 毫升 50 毫摩尔 HEPES 缓冲液（pH 值为 8.6）加入反应容器中。密封容器并通过在缓冲溶液中鼓泡氮气约 20 分钟来脱氧。同时，使用磁力搅拌器搅拌缓冲溶液。

对 HEPES 缓冲溶液进行脱氧后，从缓冲液中取出氮气管，使其悬浮在溶液上以保持氮气气氛。添加脱脂铁蛋白，使终浓度达到 3 毫克/毫升。继续磁力搅拌，但如果发生起泡，请降低搅拌速度。

对于铁磁蛋白合成，使用两个注射泵以每分钟 0.15 毫升的流速同时将 10.1 毫升铁钴前驱体和 10.1 毫升过氧化氢注入脱铁蛋白溶液中。继续执行文本协议中所述的合成步骤。然后，使用蠕动泵以 10 mL/min 的流速将样品加载到含有阳离子基质的色谱柱上。

使用梯度泵以 10 mL/min 的流速，用大约 100 mL 的电泳缓冲液清洗色谱柱。要洗脱蛋白质，用 150 mL浓度递增的氯化钠和 tris 缓冲液以每分钟 10 mL 的速度洗涤色谱柱。当蛋白质以 500 毫摩尔的氯化钠浓度洗脱时，使用自动馏分收集器将其收集在 50 mL 馏分中。

使用 150 毫升离心过滤装置将铁蛋白磁浓缩至约 2 毫升的体积，然后使用 4 毫升体积的装置。有关此程序的详细方案，请参阅离心过滤装置的制造商说明。接下来，使用进样定量环将浓缩的样品加载到凝胶过滤柱上。

用电泳缓冲液以 1.3 mL/min 的流速洗涤色谱柱。使用自动馏分收集器收集 6 mL 馏分。蛋白质单体最后洗脱。

此时，纯化的铁磁蛋白可以在 4 摄氏度下储存直至阳离子化。对于 10 毫克铁磁蛋白，称取 374 毫克 DMPA 并溶解在 2.5 毫升 200 毫摩尔 MES 缓冲液中。使用浓盐酸将溶液 pH 值调节至约 7。

当您用盐酸调节 DMPA 溶液的 pH 值时，会释放出有毒烟雾。请务必在通风橱中处理这些材料。以每毫升 4 毫克的浓度加入 2.5 毫升铁磁蛋白溶液。

加入磁力搅拌器，搅拌 2 小时以达到平衡。将溶液调节至 pH 5.0 后，向 DMPA 铁蛋白溶液中加入 141 毫克 EDC 粉末。继续搅拌三个半小时。

通过 0.22 微米注射器过滤器过滤溶液，以去除任何沉淀物并按照文本方案中的说明透析蛋白质。按照文本方案中的说明培养 hMSC。用 2 毫升室温 PBS 洗涤铺板的细胞。

然后，向铺板的细胞中加入 1 毫升灭菌的阳离子化铁蛋白溶液，然后孵育所需的时间。用 PBS 洗涤细胞，然后加入 0.5 毫升胰蛋白酶-EDTA 并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟来收获细胞。加入 1 毫升培养基灭活胰蛋白酶 EDTA 后，将溶液转移至 15 毫升离心管中，以 524 次离心离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 0.5 毫升磁分离缓冲液中。

接下来，将磁力架连接到多功能支架上，并在磁力架上添加磁分离柱。在色谱柱上放置预分离过滤器。然后，向预分离过滤器中加入 0.5 毫升磁性分离缓冲液，让它流过过滤器和色谱柱进行清洗。

接下来，将 15 毫升离心管放在色谱柱下方，并将 0.5 毫升细胞悬液添加到磁性分离柱的过滤容器中。当储液槽为空时，加入 0.5 mL 磁分离缓冲液。当储液槽再次排空时，再加入 0.5 mL 的磁性分离缓冲液。

再重复洗涤一次，使磁性分离缓冲液的总体积为 1.5 mL。该洗涤步骤从色谱柱中洗脱所有未磁化的细胞。从磁力架上取下色谱柱，并将其放入新鲜的 15 ml 离心管中。

然后，从色谱柱储液器中取出过滤器。向储液槽中加入 1 毫升磁分离缓冲液，并立即使用制造商提供的柱塞推入色谱柱。这会将磁化的细胞从色谱柱洗脱到离心管中。

继续按照文本方案中的说明进行铁定量。负染色铁蛋白样品的透射电子显微镜图像显示，纳米颗粒已在蛋白质笼内形成。Zeta 电位测量证实，铁磁蛋白在阳离子化后获得了正表面电荷。

将人间充质干细胞暴露于阳离子化铁蛋白中 1 分钟，导致 92% 的细胞群磁化，每个细胞输送 3.6 pg 铁。将孵育时间增加到 15 分钟导致整个细胞群磁化。观看此视频后，您应该了解如何通过依次向蛋白质溶液中加入金属盐前体来在脱铁蛋白腔内合成磁性纳米颗粒。

然后，如何使用 TMPA 偶联对蛋白质进行化学阳离子化。一旦掌握，如果作得当，铁磁蛋白的合成、纯化和阳离子化可以在三天内完成。在尝试此过程时，重要的是要避免氧气污染并在整个铁蛋白合成过程中保持正确的温度和 pH 值。

在此程序之后，其他货物（如量子点或治疗剂）可以封装在阳离子化的脱铁蛋白笼中，以实现这些材料更有效地递送到细胞。这项技术可以为磁性细胞作领域的研究人员铺平道路，以探索纳米颗粒摄取不良或对长时间纳米颗粒暴露或纳米颗粒浓度升高非常敏感的细胞中的磁性标记。