Name: 制造的UV-Vis和拉曼光谱免疫平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学习利用紫外可见光谱和拉曼光谱技术开发基于金纳米粒子的可定制免疫检测平台，通过双光学方法验证检测效果并优化纳米粒子功能化过程，为生物医学研究提供高灵敏度、可灵活调整的检测方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了犹他州立大学研究催化剂奖的支持。作者感谢Annelise Dykes、Cameron Zabriskie和Donald Wooley的贡献。

1. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>磷酸盐缓冲液（PBS）
	<ol>
		<li>将50 ml的10x PBS用450 ml的HPLC级水稀释，配制成1x PBS浓度的溶液。使用0.22 µm滤膜进行无菌过滤。</li>
		<li>室温下储存溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含吐温20的Tris缓冲盐水（TBST）的配制
	<ol>
		<li>将50 ml的10x Tris缓冲盐水（TBS）用450 ml的HPLC级水稀释，配制成1x浓度的溶液。加入250 μl的Tween-20，使其终浓度为0.05%（v/v）。使用0.22 μm滤膜进行无菌过滤。</li>
		<li>室温下储存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人血清白蛋白（HSA）封闭液的配制
	<ol>
		<li>称取0.45 g HSA加入15 ml经无菌过滤的1x PBS中，配制成3% w/v的HSA溶液。涡旋振荡至HSA完全溶解。</li>
		<li>将HSA溶液在4 °C下储存。 
		注：牛血清白蛋白（BSA）也可用作封闭液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚乙二醇化抗体（PEG-Ab）溶液的配制 
	注：抗体溶液中必须不含载体蛋白或稳定蛋白（如BSA），因为这些蛋白会与n-羟基琥珀酰亚胺（NHS）结合位点竞争，干扰偶联反应。如果抗体溶于Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须进行缓冲液置换，以避免胺类或铵盐干扰NHS偶联反应。如果抗体为冻干粉形式，可按照生产商推荐的方法重悬于1–10 mg/ml的浓度。
	<ol>
		<li>对于溶于Tris或甘氨酸缓冲液中的抗体，使用脱盐柱将其缓冲液置换为100 mM碳酸氢钠溶液。使用该100 mM缓冲液将pH调至约8.5，以加快偶联反应速度。</li>
		<li>用100 mM碳酸氢钠溶液溶解邻吡啶二硫化物-PEG-NHS（OPSS-PEG-NHS），配制成体积为1 ml、浓度为1 mg/ml或更高的溶液。 
		注：OPSS-PEG-NHS应现配现用，并在约20分钟内使用完毕。在pH 8.5的水溶液中，OPSS-PEG-NHS上的NHS基团半衰期约为20分钟。</li>
		<li>将OPSS-PEG-NHS以2:1（PEG: 抗体）的偶联比例加入抗体溶液中，用于测试样品。另取一支微量离心管，将OPSS-PEG-NHS以2:1的偶联比例加入抗原溶液中，用于对照组。 
		注：2:1的比例假设偶联效率为50%。目标是每个抗体连接一条PEG链。在此步骤中，过度标记优于标记不足。使用以下公式计算所需的OPSS-PEG-NHS和抗体溶液的体积： 
		<img alt="显示溶液分离分析中体积与浓度比关系的公式。" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation"> 
		其中V表示体积，C表示浓度（单位为每毫升分子数或抗体数）。下标PEG和Ab分别代表OPSS-PEG-NHS和抗体。最终体积应约为250 μl。</li>
		<li>将PEG-Ab溶液在4 °C下孵育8小时或过夜。将溶液分装成约25 μl的工作 aliquot，在-20 °C下保存，以减少冻融循环次数，并确保使用低吸附性离心管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备紫外-可见/拉曼探针
<ol>
	<li>制备裸金纳米颗粒（AuNP）溶液
	<ol>
		<li>制备2 ml浓度约为1 × 1011 个颗粒/ ml的AuNP溶液。
		<ol>
			<li>若需浓缩AuNP，将2,000 μl储备AuNP溶液加入低吸附离心管中，在5,000 × g条件下离心20分钟，或直至上清液澄清。用移液器小心吸除上清液，注意不要扰动AuNP沉淀。</li>
			<li>将剩余的AuNP溶液合并至同一管中，并通过紫外-可见光谱（UV-Vis）测量估算其浓度，与已知浓度进行比对，因二者呈线性关系。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定合适的拉曼报告分子标记比例
	<ol>
		<li>将拉曼报告分子溶于甲醇中，配制工作溶液。其浓度取决于所用报告分子。本实验中，配制3,3′-二乙基三碳菁碘化物（DTTC）工作溶液，浓度为200 μM。</li>
		<li>假设每孔终体积为100 μl，向96孔板第一行各孔中加入适量拉曼报告分子工作溶液，使报告分子浓度范围为0.2 μM至10 μM。向每孔中加入足够量的HPLC级水，使液体体积达到80 μl。再向每孔加入20 μl AuNP溶液，使每孔终体积为100 μl。示例见表1。</li>
		<li>使用酶标仪在400至700 nm范围内测量紫外-可见吸收光谱。合适浓度应为具有清晰吸收峰的最高浓度。逐步提高浓度重复步骤2.2.2，直至确定拉曼报告分子与AuNP的最高浓度比例。 
		注：染料种类以及AuNP的形状、尺寸和生产商均会影响合适浓度。因此，必须根据所用组分评估并调整上述步骤。本方案使用带正电荷的染料，因此采用带负电荷的AuNP可增强其与报告分子的结合，本实验中使用柠檬酸盐包被的AuNP实现。详见讨论部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将拉曼报告分子和PEG化抗体（PEG-Ab）结合至AuNP
	<ol>
		<li>配制两份1.5 ml AuNP与拉曼报告分子的混合溶液，浓度为前一步确定的最优浓度，在室温下孵育30分钟，使报告分子充分结合至AuNP表面。</li>
		<li>向其中一份AuNP-报告分子混合液中加入PEG化抗体（PEG-Ab），使抗体与颗粒的比例为200:1，该溶液用于检测样本。在另一离心管中，向另一份AuNP-报告分子混合液中加入PEG化抗原，同样按200:1的抗体/颗粒比例作为对照。室温孵育30分钟。 
		注：抗体与颗粒的比例取决于所用AuNP和染料，需针对每种情况优化。目标是在避免颗粒聚集的前提下，使AuNP探针结合尽可能多的抗体。使用以下公式计算所需添加体积： 
		<img alt="免疫分析法中抗体-金纳米颗粒比例的计算公式；显示体积关系。" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation"> 
		其中V表示体积，C表示浓度，单位为每毫升颗粒数或抗体数。终体积应约为1.5 ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用mPEG-SH封闭AuNP表面剩余位点
	<ol>
		<li>将甲氧基聚乙二醇硫醇（mPEG-SH）固体溶于水中，配制成200 μM的溶液。涡旋振荡至mPEG-SH完全溶解。</li>
		<li>按40,000:1的比例向步骤2.3制备的AuNP-PEG-Ab溶液中加入mPEG-SH。室温孵育10分钟，确保金纳米颗粒表面剩余位点被充分封闭。使用以下公式确定所需添加体积： 
		<img alt="纳米颗粒表面修饰公式，用于计算PEG化参数的化学方程式。" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation"> 
		其中V表示体积，C表示浓度，单位为每毫升颗粒数或抗体数。终体积应约为1.5 ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回收功能化的拉曼探针
	<ol>
		<li>将颗粒在低吸附离心管中以5,000 × g离心20分钟，或直至上清液澄清。用移液器小心吸除上清液，避免扰动AuNP沉淀。</li>
		<li>用1 ml预先配制的1× PBS溶液重悬颗粒。取少量溶液（3 μl）进行紫外-可见光谱测量，根据已知AuNP浓度的测量结果估算AuNP浓度。调整体积，使终浓度至少达到1 × 1011 个颗粒/ ml。</li>
		<li>将溶液储存于4 °C，待用于免疫分析板的功能化修饰。溶液应在一周内使用完毕。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">各组分需添加的体积（ml）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTTC 最终浓度（mM）</td>
			<td>DTTC 工作液（200 mM）</td>
			<td>AuNP</td>
			<td>水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
			<td>79.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6</td>
			<td>0.3</td>
			<td>20</td>
			<td>79.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>20</td>
			<td>79.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20</td>
			<td>79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>20</td>
			<td>77.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>3.5</td>
			<td>20</td>
			<td>76.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>5.0</td>
			<td>20</td>
			<td>75</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. DTTC稀释示例。 DTTC的不同稀释度及其对应的DTTC储备液、金纳米颗粒溶液和水的体积。
3. 免疫测定板的制备
<ol>
	<li>将目标抗原结合到免疫测定板上。
	<ol>
		<li>准备足量的稀释抗原（50 μg/ml用溶液填充聚苯乙烯微孔板孔，涡旋混匀后立即加入到板孔中。室温孵育1小时，使抗原与板孔结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗去未结合的抗原。
	<ol>
		<li>将多余的抗原溶液倒入废液容器中，并将板子轻击在铺有纸巾的桌面上以去除残留液体。</li>
		<li>向孔中加入 TBST 洗涤表面，然后以先前所述相同方式移除洗涤液。重复此步骤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭板孔以阻断剩余的结合位点，防止非特异性结合。
	<ol>
		<li>添加 70 μl 加入 HSA 封闭液至板的每孔中，室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>移除并按照步骤 3.2 中规定的相同程序冲洗平板。盖好平板，干燥保存于 4 °C 直至可进一步使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>功能化免疫测定板
	<ol>
		<li>添加 70 μl 将第2节制备的探针纳米颗粒加入96孔板的第一列，并使用1:2倍比稀释法稀释后续各列。让该板孵育至少1小时。免疫分析板制备示例见 图3.</li>
		<li>用 TBST 按照步骤 3.2 中所述方法洗涤平板 5 次，注意妥善处理金纳米颗粒（AuNPs）。最后一次洗涤后，加入 70 μl 向每孔加入 1x PBS，并用封板膜密封。 
		注意：对照样品应为无色透明。若发生非特异性结合，对照样品将呈现与检测样品相似的颜色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过紫外-可见光谱和拉曼光谱检测分析方法的灵敏度。
	<ol>
		<li>使用酶标仪型紫外-可见分光光度计，对每个孔测定400至700 nm范围内的紫外-可见吸收光谱。</li>
		<li>使用倒置拉曼显微镜，将物镜聚焦于含有金纳米粒子（AuNP）探针的孔板表面，获取该孔的拉曼光谱。采集范围为1,800 cm⁻¹至200 cm⁻¹的光谱。-1 至 400 cm-1对所有孔重复此步骤。</li>
		<li>使用合适的光谱软件，执行 11th 拉曼光谱的三阶多项式基线校正及三rd 紫外-可见光谱的多项式拟合。</li>
		<li>使用适当的光谱软件对拉曼光谱和紫外-可见光谱进行归一化处理。将最大值设为1，并相应地缩放所有其他数值。为归一化拉曼光谱，选择一个独特的聚苯乙烯峰并将其设为1，然后相应地缩放所有其他数值。</li>
		<li>使用适当的光谱软件对每条光谱进行峰面积积分。对于拉曼光谱，代表拉曼报告分子的峰应位于无聚苯乙烯峰的区域。进行峰积分时，需为待测峰设定积分边界，并记录所有样品（包括对照组）中该峰的面积。</li>
		<li>将目标物的平均峰面积对 AuNP 浓度的对数作图，每个数据点用误差棒表示其对应的标准偏差。将这些校准点拟合至四参数逻辑斯蒂曲线。</li>
		<li>通过计算空白样品中目标峰面积的平均值，确定空白值的均值。计算这些峰面积的标准差，此即为空白值的标准差。</li>
		<li>针对上一步中分析的同一峰，求其最低浓度下峰面积的标准偏差。</li>
		<li>根据代表性结果部分所述，计算空白限和检测下限。将这些值与四参数逻辑（4PL）校准曲线结合，以确定金纳米颗粒（AuNP）浓度的定量下限（LLOD）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsraelsen%2C+ND+%22Sci.+World+J%22">Sci. World J</a>. , e124582(2015).</li>
<li>Wang, Y., Schlücker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+synthesis+of+SERS+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rational design and synthesis of SERS labels.</a> Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Yan, B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+tags%3A+novel+optical+nanoprobes+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis.</a> Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Immunoassay+Handbook%3A+Theory+and+applications+of+ligand+binding%2C+ELISA+and+related+techniques%22">The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques</a>. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).</li>
<li>Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+KL+%22Assay+Guid.+Man%22">Assay Guid. Man</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	">
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ELISA+development+guide%22">ELISA development guide</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf">https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf</a> (2016).</li>
<li>Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+Raman-labeled+nanoparticles+for+a+dual-modality%2C+light+scattering+immunoassay+on+a+polystyrene+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate.</a> J. Biol. Eng. 10, (2016).</li>
<li>Menges, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMenges%2C+F+%22Spekwin32+-+optical+spectroscopy+software.+Version+1.72.1%22">Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="http://www.effemm2.de/spekwin/">http://www.effemm2.de/spekwin/</a> (2016).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+Antibody+Binding+on+Protein+Microarrays+using+Microarray+Nonlinear+Calibration%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration.</a> BioTechniques. 54, 257-264 (2013).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EP17-A2%3A+Evaluation+of+Detection+Capability+for+Clinical+Laboratory+Measurement+Procedures%3B+Approved+Guideline%22">EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline</a>. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. 
 <a target="_blank" href="http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html">http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html</a> (2012).</li>
<li>Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+assessing+the+reliability+of+molecular+diagnostics+based+on+multiplexed+SERS-coded+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles.</a> Plos One. 8 (4), e62084(2013).</li>
<li>Sinha, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+binding+potential+of+cell-surface+receptors+in+fresh+excised+specimens+via+dual-probe+modeling+of+SERS+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles.</a> Sci. Rep. 5, 8582(2015).</li>
<li>Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+using+targeted+surface-enhanced+Raman+scattering+nanoparticles+and+magnetic+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment.</a> J. Biomed. Opt. 19, 056014(2014).</li>
<li>Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated+dimers+of+silver+nanospheres+as+surface-enhanced+Raman+scattering+tags+for+imaging+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120092(2013).</li>
<li>McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+surface-enhanced+Raman+tags%3A+individual+nanorods+for+measurements+from+the+visible+to+the+infrared+%28514-1064+nm%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm).</a> Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在详细方案中，有几个关键点需要说明。其一是拉曼报告分子和金纳米颗粒的选择。尽管本方案的编写旨在适用于个性化调整，但以DTTC作为拉曼报告分子的示例进行了说明。DTTC是一种带正电荷的报告分子，可结合于带负电荷的表面，例如柠檬酸盐包被的AuNPs。若使用表面带正电荷的金纳米颗粒，该方案也可适用于带负电荷的报告分子。例如，聚乙烯亚胺（PEI）包被的AuNPs具有正电荷表面，可更有效地与带负电荷的报告分子结合。
维持蛋白质与纳米颗粒之间的平衡是本方案中的关键步骤。该平衡通过以优化的抗体与金纳米颗粒比例（200:1）添加聚乙二醇化抗体来实现。若聚乙二醇化抗体的添加比例显著高于此值，则可能发生离子诱导的颗粒聚集；反之，若比例过低，则会导致蛋白质聚集和不溶性现象。该比例需在每种具体情况下分别确定。
另一个关键的实验步骤是将OPSS-PEG-NHS与抗体进行偶联。该步骤之前需将OPSS-PEG-NHS悬浮于碳酸氢钠溶液中，使NHS基团与抗体结合。如前所述，该偶联反应会与不利的水解反应相竞争7。水解反应随着时间的推移更易...

典型的夹心免疫测定法使用两种抗体间接检测抗原的存在。捕获抗体结合在固相表面，当遇到相应的抗原时，形成抗体-抗原复合物。随后加入检测抗体，其与抗原结合。洗涤后，抗体/抗原/抗体复合物得以保留，并通过标记的检测抗体进行检测，如图1A所示。常规检测通常采用荧光或比色检测器，由于光谱峰较宽，多重检测能力通常限于10种分析物2,3。相比之下，基于拉曼的系统具有更窄的发射峰，因而显著提高了多重检测能力，有文献报道可同时检测多达100种分析物2,3。
已有大量文献资料涵盖了与免疫测定相关的各个方面4-6，例如创建个性化ELISA试剂盒的逐步操作细节。然而，这些实验方案仅适用于荧光或比色检测，限制了定制免疫测定的多重检测能力。为满足这一需求，本文提供了一种详细的实验流程，用于构建此前已发表的紫外-可见/拉曼免疫测定方法7，该方法适用于直接免疫测定，如图1B所示。
本方案包括基于功能化金纳米颗粒探针的制备，如图2所示。拉曼/紫外-可见（UV-Vis）探针的制备首先将拉曼报告分子结合到金纳米颗粒（AuNPs）表面。随后，将与聚乙二醇（PEG）相连的抗体对AuNPs进行功能化修饰。为防止后续分析过程中发生非特异性结合，使用甲氧基聚乙二醇硫醇（mPEG-SH）封闭AuNPs上剩余的结合位点。制备好的AuNP探针通过与固定在聚苯乙烯板孔中的抗原结合进行检测，如图1B所示。洗涤平板后，采用紫外-可见光谱法检测AuNP探针，同时利用拉曼光谱法检测与其相连的拉曼报告分子。结合紫外-可见光谱和拉曼光谱数据可提供两种分析方法，从而增强该免疫分析技术的检测能力。

<table><tbody><tr><td>60 nm 金纳米颗粒</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15708-6</td><td>这些是柠檬酸盐包被的金纳米颗粒。有关拉曼探针与金纳米颗粒表面电荷之间的关系及其对金纳米颗粒和/或拉曼探针正确选择的重要性，请参见讨论部分。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐水（10x），pH 7.5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶过滤装置</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20（聚山梨酯 20）</td><td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>用作洗涤步骤中的乳化剂。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 10x 浓缩液，pH 7.4</td><td>Scy Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr><tr><td>蛋白 LoBind 管 2.0&amp;nbsp;ml</td><td>Eppendorf Tubes</td><td>22431102</td><td>LoBind 管可防止蛋白质和金纳米颗粒结合到管壁表面。</td></tr><tr><td>蛋白 LoBind 管 0.5&amp;nbsp;ml</td><td>Eppendorf Tubes</td><td>22431064</td><td>LoBind 管可防止蛋白质和金纳米颗粒结合到管壁表面。</td></tr><tr><td>Microplate Devices UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>用于密封和储存功能化微孔板。</td></tr><tr><td>检测板，带低蒸发盖，96 孔平底</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱级水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-二乙基三碳菁碘化物（DTTC）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>拉曼探针</td></tr><tr><td>mPEG-硫醇，分子量 5,000 - 1 克</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA，分子量 5,000 - 1&amp;nbsp;克</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>OPSS-PEG-SVA-5000-1g</td><td>OPSS-PEG-SVA 具有 NHS 末端。</td></tr><tr><td>小鼠 IgG 全分子对照</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td>抗原</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31164</td><td>抗体</td></tr><tr><td>人血清白蛋白封闭液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1887-1G</td><td>可使用牛血清白蛋白替代。</td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>脱盐柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>自制 785&amp;nbsp;nm 倒置拉曼显微镜系统</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>倒置拉曼显微镜最适合对微孔板表面进行精确聚焦。否则，由于 96 孔板的高度限制，将不得不使用非常低的放大倍数。本研究使用自制系统，因其成本低于从供应商购买成品。然而，任何市售的倒置拉曼显微镜系统均可使用。</td></tr></tbody></table>

构建紫外-可见光与拉曼光谱免疫分析平台

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

免疫测定法利用抗体的存在来检测蛋白质。由于其在科研和临床环境中的广泛应用，目前已有大量配套的免疫测定仪器和材料。例如，市面上可提供96孔和384孔的聚苯乙烯板，其标准设计可适配不同厂家的紫外-可见光（UV-Vis）分光光度计。此外，还有多种多样的免疫球蛋白、检测标记物和封闭剂可供选择，用于定制化免疫测定实验的设计，如酶联免疫吸附测定（ELISA）。
尽管已有相关基础设施，标准ELISA试剂盒仍无法满足所有研究需求，因此需要开发个性化的免疫分析方法，而这可能成本高昂且耗时较长。例如，ELISA试剂盒的多重检测能力（即同时检测多种分析物）较低，因其通常依赖荧光或比色法进行检测。由于光谱峰较宽，比色法和基于荧光的分析方法在多重检测方面能力有限。相比之下，基于拉曼光谱的方法因具有较窄的发射峰，具备更强的多重检测能力。拉曼光谱的另一个优势在于，拉曼报告分子的光漂白程度显著低于荧光标记物1。尽管拉曼报告分子相较于荧光和比色标记物具有诸多优势，但用于构建拉曼免疫分析的实验方案仍十分有限。本文旨在提供一种制备功能化探针的实验方案，该探针可与聚苯乙烯板联用，通过紫外-可见光分析（UV-Vis）和拉曼光谱法直接检测分析物。该方案将使研究人员能够采用自主构建的方式，利用现有基础设施实现未来的多分析物检测。

本研究中使用了60 nm的金颗粒进行紫外-可见光谱分析。收集了400至700 nm范围内的紫外-可见吸收光谱，并利用开源光谱分析软件8确定每种AuNP浓度的峰面积。在进行峰面积积分之前，对收集到的光谱采用三点多项式拟合进行基线校正。利用峰面积生成对数校准曲线，如图4所示。需要注意的是，图4和图5均采用了对数校准曲线。使用非线性校准曲线可显著扩展检测方法的动态范围，现已成为需要低浓度检测能力的各种免疫分析方法中的公认实践9,10。
为定量评估该检测方法的灵敏度，按下述方法计算空白限（LOB）和最低检测限（LLOD）： 
<img alt="空白限计算公式，LOB=x̅_blank+1.645σ_blank，用于统计数据分析。" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_LOB.jpg" data-alt...

基于纳米颗粒的光学探针已被设计为用于通过拉曼光谱和紫外-可见光谱检测抗原的载体。本文描述了一种制备此类探针用于紫外-可见/拉曼光谱免疫分析的方案，该方案可整合未来的多重检测能力。

免疫测定法利用抗体的存在来检测蛋白质。由于其在科研和临床环境中的广泛应用，……

本方案的总体目标是展示一种基于金纳米颗粒的可定制免疫分析方法的开发过程，该方法可使用紫外-可见光谱和拉曼光谱进行分析。采用两种光学方法可实现分析方法的内部验证，并提高其灵活性。该方法解决了金纳米颗粒免疫分析方法开发中的关键问题。并解释了纳米颗粒的功能化在该检测中如何影响光吸收和光散射。本实验方案的独特之处在于，其采用典型研究实验室中常见的材料构建了一种免疫检测平台，且可根据个体研究需求进行定制。该免疫检测基于紫外-可见光谱（UV-Vis）和拉曼光谱技术。与荧光法或比色法相比，拉曼光谱技术具有更窄的带宽，能够同时检测多种生物标志物，因此更具优势。首先，将双功能交联剂或吡啶二硫代聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯（pyridyl disulfide PEG-NHS）溶于100 mL碳酸氢钠溶液中进行水合。其中，邻位吡啶基团将与金纳米颗粒表面结合，而NHS基团在活化后会与蛋白质表面的伯胺发生反应。务必在使用前约20分钟内配制交联溶液。接下来，按2:1的偶联比例将双功能交联剂加入抗体溶液中。确保抗体溶液中不含可能与反应发生相互作用的载体蛋白。在另一个微量离心管中，按与对照组相同的比率将双功能交联剂加入抗原溶液中。2:1 的比例是基于 50% 的偶联效率进行估算的。目标是每个抗体连接一条聚乙二醇（PEG）链。此步骤中，过度标记优于标记不足。最后，将聚乙二醇化抗体溶液在4摄氏度孵育8小时。将溶液以25微升分装至低吸附管中，于-20摄氏度保存，以减少冻融循环次数。根据需要使用每份等分试样。为制备拉曼探针，首先根据随附文本方案中所述确定的浓度，制备两份1.5 mL的金纳米颗粒与拉曼报告分子的混合物。具体操作是将拉曼报告分子溶液与金纳米颗粒溶液混合，室温下孵育30分钟，使其充分结合。然后，将聚乙二醇化抗体溶液加入一种标记了报告分子的金纳米颗粒溶液中，使抗体与颗粒的比例为200:1，该溶液用于检测样本。在另一个微量离心管中，将聚乙二醇化抗原以200:1的抗原与颗粒比例加入另一种标记了报告分子的金纳米颗粒溶液中，作为对照使用。将两种溶液在室温下孵育三十分钟。接着，封闭纳米颗粒表面的剩余位点。为此，首先使用高效液相色谱用水将固体甲氧基聚乙二醇硫醇溶解，配制成200 μM浓度的溶液。涡旋溶液直至巯基化合物完全溶解。然后，按40,000:1的比例将巯基溶液加入纳米颗粒结合的PEG抗体溶液中，并在室温下孵育10分钟，以确保金纳米颗粒上的剩余位点被封闭。接下来，将反应体系转移至低吸附离心管中，通过离心回收功能化的拉曼探针，直至上清液澄清。用移液器吸除上清液，但注意不要扰动纳米颗粒。然后，用1 mL PBS重新悬浮纳米颗粒。取约3微升溶液进行紫外-可见光谱测定，通过与已知浓度的金纳米颗粒结果比较，估算金纳米颗粒的浓度，因为二者呈线性关系。如果纳米颗粒未得到充分封闭，它们会因颗粒间的黏附力而发生聚集，这表明试剂的添加浓度不正确。正常情况下，溶液呈深红色，而聚集会导致溶液呈现灰色。调整体积，使最终溶液的浓度至少达到每毫升1×10¹¹个颗粒，并将溶液在4°C下保存，直至用于氨基检测板的功能化处理。这些溶液需在一周内使用。首先，配制足量的稀释抗原以填充聚苯乙烯微孔板的孔。然后，涡旋混匀溶液，并立即加入到板的孔中。室温下孵育一小时，使抗原结合到板上。随后倾去多余的抗原溶液，并将板轻击于铺有纸巾的桌面上以去除残留液体。向孔中加入TBST洗涤液清洗表面，再次倾去洗涤液，并将板轻击于铺有纸巾的桌面上以去除残留洗涤液。接下来，向每孔中加入70 µL HSA封闭液，以封闭板上剩余的结合位点，防止非特异性结合，并将板在室温下孵育30分钟。然后，移除封闭液，并用TBST洗涤板3次，方法同前。最后一次洗涤液移除后，将板覆盖并干燥保存于4°C，直至后续使用。将先前制备的探针纳米颗粒140微升加入96孔板的第一列中，前五排加入待测纳米颗粒，后三排加入对照纳米颗粒。向其余各列加入70微升PBS。使用1比2的倍比稀释法稀释每一列。首先从第一列取70微升，与第二列混合；然后从第二列取70微升加入第三列，依此类推。将培养板孵育至少一小时。随后，移除未结合的纳米颗粒探针，并用 TBST 洗涤培养板五次，操作方法如前所述。最后一次洗涤后，向每孔中加入 70 µL 的 PBS，并用封板膜覆盖培养板。检查对照样品是否澄清。如果发生非特异性结合，对照样品的颜色将与测试样品相似。对于每个孔，使用酶标仪在400至700纳米范围内测定紫外-可见吸收光谱。使用倒置拉曼显微镜，将物镜聚焦于含有金纳米粒子探针的孔板表面。获取该孔的拉曼光谱。采集波数范围从1800 cm⁻¹至400 cm⁻¹的光谱，并对每个孔重复此操作。最后，按照随附文字方案的最后一部分中的步骤，确定该装置的灵敏度。60 纳米的金颗粒按本视频所述方法制备，随后使用紫外-可见光谱法和拉曼光谱法进行分析。使用开源光谱分析软件确定每种金纳米颗粒浓度的峰面积，并用于生成如图所示的对数校准曲线。根据该数据，紫外-可见光检测的最低检测限为 3.5 皮摩尔，而使用拉曼光谱法时为 1.7 皮摩尔。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用紫外-可见光谱和拉曼光谱技术定制基于纳米颗粒探针的免疫分析方法。

fabricating-a-uv-vis-and-raman-spectroscopy-immunoassay-platform

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

制造的UV-Vis和拉曼光谱免疫平台

在SiO2表面，利用一种简单的干涉测量技术，可实现对生物分子（如DNA、蛋白质等）的定量、高通量、实时且无需标记的检测。该技术依赖LED照明、极少的光学元件和一台相机。干涉反射成像传感器（IRIS）成本低廉、操作简便，并适用于微阵列格式。...

采用干涉反射成像传感器（IRIS）进行生物分子检测

在本视频中，我们介绍了一种基于拉曼光谱的直接免疫分析方法，用于检测特定的目标抗原。附着在拉曼探针表面的金纳米颗粒上的抗体可与目标抗原发生相互作用，产生特定的拉曼光谱，随后被检测到。...

一种基于拉曼光谱的直接免疫测定法检测特定抗原

我们描述了纳米生物系统的制备与表征，该系统将纳米结构基底与固定化的蛋白质和适配体进行界面结合。文中报道了涉及纳米结构基底的光刻制备、生物功能化以及表面增强拉曼光谱（SERS）表征等相关实验步骤。展示了对表面固定化蛋白质的SERS检测，以及对蛋白质-配体和适配体-配体结合相互作用的探测。...

利用电子束光刻制备的纳米结构基底通过表面增强拉曼光谱检测生物分子

一种基于滤膜的表面增强拉曼光谱（SERS）检测化学污染物的制备与检测方法即，...

基于滤膜的表面增强拉曼光谱法快速检测化学污染物

我们详细介绍了一种用于构建基于纸张的三维微流控装置的方法，该装置可用于免疫测定的开发。我们的装置组装方法属于一种多层增材制造技术。我们展示了夹心免疫测定法，以提供此类基于纸张的装置的代表性结果。...

用于免疫分析的三维纸质微流控装置的制备

本方案描述了一种小型即用型卡盒的制备方法，该卡盒可用于单次检测中对多种核酸进行可视化检测，操作简便。该方法采用毛细管阵列，实现对转基因目标物的多重、高效检测。...

毛细管阵列中多种核酸的可视化检测

目前用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒的多重诊断方法需要复杂的样品制备过程和昂贵的仪器设备，难以在资源有限的环境中应用。我们展示了一种基于等温扩增技术并结合靶标特异性链置换探针的诊断方法，可高灵敏度、高特异性地检测并区分这些病毒。...

基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

本方案介绍了一种集成拉曼光谱-质谱（MS）平台，可实现单细胞分辨率。拉曼光谱可用于研究细胞对药物的响应，而质谱则可用于药物摄取与代谢的靶向定量分析。...

一种集成拉曼光谱与质谱技术的平台用于研究单细胞药物摄取、代谢及效应

基于电润湿的数字微流控技术是一种利用电压驱动微升体积液滴的表观接触角变化来实现液滴操控的方法。将该技术与功能化磁珠相结合，可集成多种实验室单元操作，用于基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的病原体样本制备与鉴定。...

基于电润湿的数字微流控平台用于自动化酶联免疫吸附测定

本文提出了一种新一代的多参数分析平台，可提高细胞外囊泡亚群表征的通量。该方法结合了多重生物传感技术与原子力显微镜的计量学和形貌力学分析，并耦合拉曼光谱，用于对捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标进行定性分析。...

基于多重表面等离子体共振成像芯片的多模态分析平台用于细胞外囊泡亚群分析

本文介绍了一种利用无标记表面增强拉曼光谱法（SERS）分析单个小细胞外囊泡（sEVs）的实验方案，该方法可实现疾病无创诊断，并评估sEVs作为治疗递送载体的应用潜力。...

探索基于表面增强拉曼散射的单个sEV生物传感在疾病诊断与治疗中的应用

学习利用紫外可见光谱和拉曼光谱技术开发基于金纳米粒子的可定制免疫检测平台，通过双光学方法验证检测效果并优化纳米粒子功能化过程，为生物医学研究提供高灵敏度、可灵活调整的检测方案。

构建紫外-可见光与拉曼光谱免疫分析平台

探索更多视频