基于SILAC的HIV-1感染细胞外泌体蛋白质组学表征

本实验的总体目标是对 HIV-1 感染细胞来源的外泌体蛋白质组进行表征。该方法有助于解答外泌体生物学领域中的关键问题，例如外界应激因素对外泌体蛋白质组组成的影响。该技术的主要优势在于，即使在蛋白质组学和外泌体生物学背景知识有限的情况下，也能够掌握并应用。

尽管该方法可为HIV感染研究提供见解，但也适用于其他疾病研究，例如细菌感染。本实验使用H9细胞系，但只要细胞处于活跃增殖阶段且对所选测试条件敏感，也可使用其他多种细胞系。将两乘以十的六次方个H9细胞分别接种至两个细胞培养瓶中。

将一个细胞群体培养于10毫升含10%胎牛血清（FBS）、100毫克/升C13标记的L-赖氨酸以及100毫克/升C13和N15标记的L-精氨酸的标记培养基中。将另一个细胞群体培养于10毫升不含同位素标记的培养基中，其中含有10%胎牛血清（FBS）、未标记的L-赖氨酸和L-精氨酸。细胞培养至经历六次倍增，此时标记培养基中的细胞蛋白质已被重同位素氨基酸标记的比例超过99%。

根据细胞类型，定期添加新鲜培养基或更换培养基。标记结束时，将培养体积增加至 30 毫升，以适应更多细胞的生长。使用标准的 HIV-1 感染方案，用 HIV-1 的 NL4-3 毒株感染已标记的细胞。

向细胞中加入适量病毒，并孵育48小时，同时未标记的细胞在未添加HIV-1的培养基中继续生长。HIV-1感染结束后，收集两组细胞的上清液用于外泌体分离。将培养物的上清液收集至50毫升锥形管中，注意避免混入细胞。

在300 × g、4 °C条件下离心10分钟，以去除残留细胞。将上清液收集至新的50 mL锥形管中，在2,000 × g条件下离心10分钟，以去除死细胞。将所得上清液转移至可耐受超速离心的商品化转子兼容管中。

务必平衡超速离心管。以10,000 × g离心30分钟，以去除细胞碎片。将上清液收集到新的超速离心管中。

在100,000 × g条件下离心70分钟，弃去上清液。将每个富含外泌体的沉淀重悬于5毫升新鲜PBS中，并将溶液转移至新的超速离心管中。

再次在100,000 × g条件下离心70分钟。最后一次离心后，弃去上清液。此时细胞沉淀已准备好进行蛋白质提取。

开始此操作时，将每个分离得到的外泌体沉淀溶解于 100 至 200 微升含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，该抑制剂可抑制多种蛋白酶的活性。将溶解后的溶液在 4°C 条件下以 13,000 × g 离心 10 分钟。将澄清的上清液转移至新的 1.5 毫升微量离心管中。

通过标准检测方法测定每个样品的蛋白浓度后，将标记和未标记样品的等量蛋白质混合。将等量混合物在4%至20%的SDS-PAGE凝胶中电泳30分钟。用考马斯亮蓝染色凝胶，随后进行脱色。

使用剃刀刀片从凝胶上切下样品泳道，然后将凝胶泳道切成10至15个大小相等的小块。每块放入一个全新的1.5毫升微量离心管中，共10至15个管，随后按照文本方案中所述的蛋白质提取步骤继续操作。蛋白质组学数据分析的步骤将不在此演示，但其流程总结于以下流程图中。

首先通过液相色谱-串联质谱法分析提取的蛋白质，并评估数据质量。接着，通过去除定量肽段少于两个的蛋白质对数据进行预处理。然后鉴定显著上调和显著下调的蛋白质。

最后，比较显著候选蛋白的重复实验结果以确保一致性，并合并所有重复实验的数据。为了开始对已鉴定蛋白进行表征，可利用其GenBank登录号或UniProt ID，在现有的外泌体数据库中进行检索。本演示中将使用ExoCarta数据库。

点击查询并输入基因或蛋白质名称或登录号。任何关于外泌体的证据均证实候选蛋白质此前已在外泌体中被发现，这进一步增强了候选蛋白确实存在于外泌体中的可信度。接下来，将候选蛋白与HIV-1和人类蛋白质相互作用数据库进行比对搜索。

在蛋白质结构域名称输入栏中，输入候选蛋白的名称或登录号，然后点击搜索。搜索结果可提供有关 HIV-1 与候选蛋白之间相互作用的信息，并提示哪些候选蛋白可能真正与 HIV-1 相关。第三步是使用基因本体（gene ontology，GO）分析软件（如 fun-rich）对候选蛋白进行全局性分析，以获得整体功能信息。

在富集分析中，点击“添加数据集”并上传候选蛋白的 GenBank 登录号或 UniProt ID，然后选择图表类型以可视化 GO 分析结果。GO 分析结果以饼图形式展示，提供候选蛋白在生物过程、细胞组分和分子功能三个方面的信息。下一步是通过 DAVID 分析鉴定在统计学上显著富集的 GO 条目。

单击功能注释工具，输入候选基因列表，并选择基因的标识符，例如 UniProt ID。选择基因列表并进行搜索。搜索完成后，单击基因本体（gene ontology）类别下的注释摘要结果页面，以查看富集的 GO 条目、p 值及其他参数。最后，利用公开可访问的 STRING 数据库分析潜在的蛋白质-蛋白质相互作用及可能的生物化学通路。

将蛋白质 ID 或序列输入指定的搜索框中，并选择正确的物种进行分析。点击搜索。结果将提供有关直接和间接关联的信息。

在结果中显示的外泌体候选蛋白的前10个已知匹配项应被考虑用于重要候选物的筛选。图中展示了对一组14种蛋白质进行DAVID分析的代表性结果。生物学过程富集分析表明，与细胞死亡相关的过程显著富集。

细胞组分富集分析显示，许多蛋白来源于细胞内，而分子功能富集分析则表明大多数候选蛋白具有蛋白质结合功能。其中，L-乳酸脱氢酶B链（LDHB）被选为最显著的候选蛋白，STRING分析鉴定了LDHB的前10个相互作用蛋白。这些LDHB相互作用蛋白中的大多数在功能和定位上也与HIV-1中的外泌体相关。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在一周内完成。在进行该实验时，重要的是要牢记在适当的温度和条件下执行每一步骤。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法（如亲和分离）来验证生物信息学分析的预测结果。

该技术建立后，为外泌体领域研究HIV-1感染相关的外泌体蛋白质组变化开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从细胞培养物中分离外泌体、分析其蛋白质组，并探究其与HIV的关系。请务必注意，操作HIV或其他传染性病原体具有极高危险性，在进行此类实验时，必须采取佩戴个人防护装备等安全防护措施。