第一次混合胶质细胞培养的成年小鼠脊髓组织准备

该方案的总体目标是从成年小鼠脊髓中建立原代混合神经胶质细胞培养物，用于体外研究。该方法为我们提供了一个体外系统来研究神经胶质细胞在涉及脊髓内病理变化的神经系统疾病中的作用，例如神经性疼痛和多发性硬化症。该技术的主要优点是神经胶质培养物是从成年小鼠脊髓制备的，提供了一个更准确地反映体内条件的系统。

演示该程序的是我实验室的技术人员 Jennifer Malon。在组织培养罩中工作，将四根小鼠脊髓转移到 HBSS 的培养皿中。使用无菌剪刀和镊子将每条脊髓切成小块。

然后，将碎片转移到含有木瓜蛋白酶 DNAse 酶混合物的 50 毫米锥形管中。避免将 HBSS 转移到酶混合物中，因为这可能会导致酶的性能降低。组织块经过充分消化以获得单细胞悬液至关重要。

然而，过度消化会导致活细胞减少。每个实验室都需要进行中试测试，以根据最适合其细胞的方法确定确切的消化时间。接下来，轻轻涡旋试管，然后在 37 摄氏度下孵育 1 小时，并以每分钟 150 转的速度摇动轨道。

孵育后，涡旋试管，然后使用 5 毫升移液管用力研磨组织以促进进一步解离。然后，将细胞悬液转移至 15 mL 试管中，并在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。在离心过程中，在 300 μL 重构的白蛋白卵类粘蛋白抑制剂溶液中，在无菌管中加入 2.7 mL ABSS 并充分混合。

然后加入 150 微升 DNAse 溶液。离心后，去除上清液，并将细胞沉淀重悬于新鲜制备的白蛋白卵类粘蛋白抑制剂和 DNAse 溶液中。充分涡旋以打破细胞沉淀。

然后，向细胞悬液中加入 3 毫升重构的白蛋白卵类粘蛋白抑制剂溶液，不含 DNAse。在室温下以 70 x g 离心细胞 6 分钟。离心后，去除含有膜片段的上清液，并保留沉淀。

要从解离的脊髓细胞中去除髓鞘，首先将 8 毫升室温 20% 梯度密度培养基加入含有细胞沉淀的试管中，然后轻轻涡旋。接下来，在室温下以 800 x g 离心细胞 30 分钟，不要破裂。离心后，小心吸出顶层碎片，其中主要包含髓鞘和上清液，留下沉淀。

要去除任何剩余的密度梯度，请用 8 毫升用 HBSS 稀释的 cDMEM 重悬沉淀来洗涤细胞。将细胞在 4 摄氏度下以 400 g 离心 10 分钟。去除上清液，并像以前一样用稀释的 cDMEM 洗涤细胞。

去除上清液后，将沉淀物储存在冰上，直到接种细胞。准备好铺板后，将细胞重悬于 14 mL cDMEM 中，并补充有 2-巯基乙醇。并向 12 孔板中的每个孔中加入 1 毫升细胞悬液。

接种额外的孔，可用于确定每孔的平均细胞数和培养物的小胶质细胞含量。细胞铺板后，将细胞在 35.9 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。在第 1 天更换培养基，即接种后的第二天。

一些细胞附着在培养板上，但它们大部分仍然是圆形的。还有许多漂浮的单元和重要的碎片。此后 3 到 4 天重复更换培养基，直到细胞在第 12 天和第 14 天之间准备好进行处理。

37 摄氏度或 35.9 摄氏度下培养来自成年 C57 black 6 小鼠的混合神经胶质细胞，并通过流式细胞术进行分析。如您所见，在这些温度下，总细胞群没有明显差异。这些代表性图显示了从先前显示的总细胞群中分离的 CD45 阳性 CD11b 阳性小胶质细胞群。

该图表明，当混合胶质细胞在 35.9 摄氏度而不是 37 摄氏度下培养时，可以获得更高的小胶质细胞含量。从 C67 black 6 只小鼠制备成年脊髓混合胶质细胞培养物。显示了培养细胞在第 1 天、第 4 天、第 8 天和第 12 天的代表性图像。

图片展示了文化的典型进步，以及媒体的重要性，在后文化建立的第一天就发生了变化。一旦掌握，如果作得当，混合胶质细胞培养物的初始设置可以在大约 4 小时内完成。在建立混合胶质细胞培养物后，可以从该初始混合种群中获得去除的小胶质细胞和富含小胶质细胞的培养物。

然而，除非使用大量脊髓建立培养物，否则富含小胶质细胞的细胞的产量将受到限制。该技术最初旨在研究神经胶质细胞在神经性疼痛发展过程中的作用。然而，它可用于研究涉及成人脊髓内病理变化的其他神经系统疾病。