一种从鱿鱼 Doryteuthis pealeii 中提取色素的方法

本实验的总体目标是描述如何从新解剖获得的长鳍近鱿（Doryteuthis pealeii）色素细胞中提取位于其纳米结构颗粒内的色素。头足类动物是一类复杂的海洋生物，能够对其皮肤颜色进行快速且适应性的改变，以及对皮肤颜色进行适应性调节。

然而，关于这些系统的工作机制仍有许多未知之处。该技术的主要优势在于能够特异性地靶向色素细胞器官中的纳米结构颗粒，这将使研究人员能够阐明起源于纳米尺度的变色机制。

除了对头足类生物学提供深入理解外，该研究还可为合成系统的设计提供指导，这些合成系统旨在利用预封装的色素纳米颗粒，模拟头足类所展示的自适应变色的动态范围。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为色素细胞组织与周围组织位置邻近，难以获取纯净的样品。我们的方法经过优化，可有效减少此类污染物。

开始解剖时，首先将约250毫升过滤海水倒入解剖盘中。将一个标本放入解剖盘内，使用不锈钢直头精细剪刀，从腹侧外套膜基部沿动物后侧剪开，直至鳍区。用解剖镊子轻轻提起所有内脏器官，并用剪刀切断结缔组织，将其移除。

将器官丢弃至标本袋中。使用解剖T形针，将外套膜鳍有色素层的一侧朝上固定于解剖板上。用镊子小心去除不透明的表皮层，保留含色素细胞的皮肤层完整无损。

将表皮层丢弃至标本袋中。接着，去除色素细胞层。将色素组织切成大小为一厘米乘一厘米的小片。

将切片放入1.5毫升的微量离心管中，每管装入约半管体积的解剖组织。最后向各管中加入500微升过滤海水。为分离色素颗粒，首先以14,000 × g离心5分钟，对色素细胞组织切片进行处理。

弃去上层海水。向样品中加入 500 µL 木瓜蛋白酶-胶原酶溶液，在最高转速下涡旋震荡 1 至 2 分钟。接着，将样品在 40 kHz 条件下超声处理 5 分钟，以使细胞从周围组织中解离。

在14,000 × g条件下再次离心5分钟，然后弃去上清液。重复离心操作两次，每次均弃去上清液。随后，加入胶原酶进行重悬。

使用镊子手动去除在继续操作前未消化的任何残留大块组织。起始颗粒溶液的纯度会影响色素的提取，因此确保起始的色素细胞材料完全消化至关重要。

我们发现，约一厘米大小的组织切片最适合收集最纯净的颗粒群体。取一个150毫升带螺口盖的试管，加入适量的HEPES、氯化镁、谷氨酸钾和二硫苏糖醇，配制匀浆缓冲液。加入一片商用小型蛋白酶抑制剂片剂。

使用量筒量取 100 ml 去离子水，加入含有匀浆盐的离心管中。涡旋振荡离心管，混匀至溶液变澄清。离心组织样品，然后弃去上清液。

向每支试管中加入 500 µL 裂解缓冲液，涡旋振荡 2 分钟以充分混匀。在 40 kHz 条件下超声处理样品 30 分钟。然后再次离心。

弃去上清液后，重复进行匀浆添加、超声处理和离心操作两到三次，以确保细胞外组织完全消化。最后，离心管中应含有淡黄色的上清液和由分离的色素颗粒组成的红色沉淀。弃去上清液。

首先，在螺口盖玻璃样品瓶中配制酸性甲醇用于提取，加入 5 ml 甲醇和 25 µL 浓盐酸，轻轻旋转混匀溶液。预留一个样品管不进行后续反应，该样品管将作为最终反应后的颗粒处理组。

从含有颗粒的第二根试管中移除匀浆缓冲液。向其余试管中加入500 µL酸性甲醇溶液，涡旋振荡3至4分钟。在40 kHz条件下超声处理样品10分钟，然后在14000 × g下离心5分钟。

使用微量移液器将上清液收集到一个1 dram带螺帽的玻璃小瓶中。此即为色素，应呈现深红色。重复加入酸性甲醇、超声处理及离心步骤四至五次，每次均收集上清液，直至不再有颜色被提取出来为止。

剩余的无色沉淀物即为色素提取后的颗粒。为制备用于成像的颗粒样品，首先将未反应的颗粒等分试样和色素提取后的颗粒分别在14000 × g离心5分钟，弃去上清液，然后将每份沉淀物重悬于1 ml 95%乙醇中。使用移液管将每种颗粒悬液各取2–3滴，分别置于独立的铝制扫描电镜载台（SEM stub）上。

将样品置于干燥器中，在真空条件下过夜干燥。对载片进行金铂溅射镀膜，持续3分钟，以获得15纳米厚的镀层。使用扫描电子显微镜对样品进行成像。

接下来，使用分光光度计采集未反应颗粒、提取后颗粒及提取色素的吸光度谱图。通过在洁净的比色皿中加入 1 ml 去离子水，对颗粒样品进行空白测定。将空白溶液弃入废液容器中。

接下来，将含有未反应色素颗粒的悬液加入比色皿中。采集颗粒样品的紫外-可见吸收光谱。使用1 mL酸性甲醇和一个洁净的比色皿，对提取的色素进行第二次空白测定。

最后，测定色素的紫外-可见吸收光谱，并确定每个样品的最大吸收波长。扫描电子显微镜结果显示，色素提取过程降低了颗粒的平均直径。提取前，颗粒的平均直径为527.3 nm。

经过酸性甲醇处理后，该尺寸显著减小至约202.6 nm，这种减小被认为是由色素的提取所致。加入酸性甲醇后，未反应颗粒所呈现的颜色也明显减弱。

通过分光光度法获得了对该假设的验证。该图显示了提取前颗粒具有较宽的吸收谱，而提取后颗粒的吸收谱同样较宽但强度较低。相比之下，可溶性提取色素在约500 nm处呈现最大吸收峰（lambda max），并在约380 nm处具有明显的肩峰。

总体而言，这些数据表明已成功从颗粒中提取出可见颜色。一旦掌握，该技术从开始到结束大约需要四小时即可完成。在进行该操作时，重要的是要记住彻底去除含有反射性蛋白片层的组织，以免干扰提取和分析过程。

表皮组织还可能干扰匀浆步骤和色素提取过程。通过本方法后，可进一步采用其他技术，如薄层色谱法和质谱法，以进一步纯化色素并表征其组成成分。这些步骤有助于阐明头足类动物体色形成的分子基础。

该方法可帮助海洋生物学家、化学家和工程师回答一些关键问题，例如：变色过程中所用色素的成分是什么？它们如何影响真皮色素细胞器官内纳米结构颗粒的功能与结构？观看本视频后，您应能充分掌握如何从新近解剖的长鳍近镖乌贼（Doryteuthis pealeii）色素细胞中提取色素。