Name: 一种从鱿鱼提取色素的方法 Doryteuthis pealeii (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 了解从鱿鱼Doryteuthis pealeii色素细胞中提取纳米结构颗粒色素的方法。该技术有助于揭示头足类动物快速变色机制的纳米级原理，为海洋生物学和仿生材料研究提供基础。

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作者衷心感谢新罕布什尔大学提供的设施支持，包括大学仪器中心。本工作由新罕布什尔大学化学系资助。

本文开展的无脊椎动物研究在美国不受相关法规管辖；因此，机构动物护理与使用委员会无权对此类实验方案进行审查。鉴于这些研究不属于美国法规的管辖范围，作者在此声明，本研究在实施过程中真诚地遵循了动物的伦理使用、护理和处理原则，尽可能减少了实验个体数量，且相关努力符合《巴塞尔宣言》以及国际实验动物科学理事会（ICLAS）的伦理指南。
1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) 解剖
<ol>
	<li>从马萨诸塞州伍兹霍尔海洋生物实验室的海洋资源部门或任何新鲜鱼类市场购买去头的鱿鱼 D. pealeii。请勿使用已被切片或经过其他处理的标本，以确保本实验方法的适用性。具体而言，标本上的色素细胞层必须保持完整。
	<ol>
		<li>若动物标本未立即使用，应将其储存在 -20 °C 环境中直至使用。解冻时，将标本置于室温水中浸泡 1 小时后再进行解剖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用不锈钢直头精细解剖剪，在动物体后侧进行剪切。起始位置为腹侧外套膜基部，终止于鳍部区域。</li>
	<li>用解剖镊夹起所有内部器官（包括胃、鳃、墨腺、生殖器官、体心脏和臂心脏），并用解剖剪切断其连接组织，将其移除。将移除的器官丢弃至标本袋中。</li>
	<li>使用解剖T型针将外套膜（鳍面朝上）固定在一个标准的 11-1/2&#34; x 7-1/2&#34; x 1-1/2&#34; 铝制解剖盘中，盘内需配有柔性解剖垫。将组织浸入 250 ml 经一次性聚苯乙烯真空过滤系统（滤膜孔径 0.2 µm）过滤的海水。</li>
	<li>用解剖镊小心剥离表皮层（呈不透明颜色），同时保持含有色素细胞的皮肤层完整。一旦表皮层被去除，将其丢弃至标本袋中。</li>
	<li>用镊子和解剖剪从色素细胞层上分离出小块（1 cm × 1 cm）组织片段。将样本收集至 1.5 ml 微离心管中（每管填充约一半体积的解剖组织）。</li>
	<li>向含有组织的离心管中加入 500 µl 过滤海水。样本可在 4 °C 下保存过夜。</li>
</ol>
2. 分离色素细胞中的色素颗粒
<ol>
	<li>组织消化
	<ol>
		<li>木瓜蛋白酶/胶原酶的配制
		<ol>
			<li>使用 4&#34; x 4&#34; 低氮称量纸称取 30 mg 胶原酶和 5 mg 木瓜蛋白酶。将酶转移至一个带螺帽的 50 ml 聚丙烯离心管中。</li>
			<li>使用刻度移液管量取 10 ml 去离子水，直接加入含有木瓜蛋白酶/胶原酶的管中。涡旋振荡至溶液澄清，使用最高转速。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>去除细胞外组织
		<ol>
			<li>将步骤 1.7 中收集的色素细胞组织在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上层海水至塑料废液桶中。</li>
			<li>使用 P1000 多通道可调体积微量移液器向组织中加入 500 µl 木瓜蛋白酶/胶原酶溶液。每份样品在最高转速下涡旋振荡 1–2 分钟。</li>
			<li>将样品在 40 kHz 频率下超声处理 5 分钟，以使细胞从周围组织中解离。</li>
			<li>在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。将上清液弃入塑料废液桶中。</li>
			<li>将收集的色素细胞组织再次在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上层海水至塑料废液桶中。重复此步骤一次。</li>
			<li>在进行下一步之前，使用镊子手动去除在此过程中未消化的任何残留大块组织。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>色素颗粒的分离
	<ol>
		<li>匀浆缓冲液的配制
		<ol>
			<li>称取 2.38 g (4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸) (HEPES, 100 mM)、0.095 g 氯化镁 (10 mM)、0.856 g 谷氨酸钾 (50 mM) 和 0.015 g 二硫苏糖醇 (1 mM)，转移至一个带螺帽的 150 ml 聚苯乙烯容器中。加入一片商用蛋白酶抑制剂小片。</li>
			<li>使用量筒量取 100 ml 去离子水，直接加入含有匀浆盐的容器中。涡旋振荡至溶液澄清。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>色素颗粒的匀浆处理
		<ol>
			<li>将步骤 2.1 中获得的每份样品在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液至塑料废液桶中。此样品应不含细胞外组织。</li>
			<li>向每根离心管中加入 500 µl 匀浆缓冲液，每管涡旋振荡 1–2 分钟以充分混匀样品。将样品超声处理 30 分钟（约 40 kHz），随后在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
			<li>将上清液弃入塑料废液桶中，并重复上述步骤 2–3 次，以确保完全消化色素细胞囊和蛋白锚定结构。最终剩余溶液应包含淡黄色上清液和含有分离色素颗粒的红色沉淀。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 色素提取
<ol>
	<li>酸性甲醇（HCl-MeOH）的制备
	<ol>
		<li>小心地将 25 µl 浓盐酸（36.5–38% (w/w)）加入 5 ml 甲醇（MeOH）中。将 HCl-MeOH 溶液储存于带螺口盖的玻璃样品瓶中。轻轻旋转以充分混匀溶液。 
		注意：溶液酸性越强，第一次提取时获得的色素越多。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>色素提取
	<ol>
		<li>将色素颗粒悬液（来自 2.2.2 步骤）在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟，并将上清液弃入塑料废液桶中。</li>
		<li>向每个样品中加入 500 µl HCl-MeOH 溶液，涡旋混匀约 3–4 分钟。随后将样品超声处理 10 分钟（约 40 kHz），再在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>使用移液管将上清液收集至 1 dram 螺口玻璃小瓶中。上清液应呈深红色。</li>
		<li>重复步骤 3.2.2，直至无进一步颜色析出（约洗涤 4–5 次）。 
		注意：每次提取可获得约 1.5 ml 色素。剩余的无色沉淀即为已提取色素的颗粒。注意：无色颗粒和提取的色素均可在 4 °C 水中保存，直至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 提取过程中的表征
<ol>
	<li>扫描电子显微镜
	<ol>
		<li>使用扫描电子显微镜（SEM）对颗粒（来自步骤2.2.1的未反应颗粒和来自步骤3.2.3的色素提取后颗粒）进行成像，以验证提取过程的纯度。</li>
		<li>为制备用于成像的颗粒样品，首先将未反应颗粒和色素提取后的颗粒在14,000 × g条件下离心5分钟，并将上清液弃入塑料废液桶中。用1 ml乙醇重悬颗粒，然后使用移液管将2–3滴颗粒悬液滴加到铝制SEM样品台上。</li>
		<li>样品在室温下干燥过夜后，进行金-铂溅射镀膜，镀膜时间为3分钟，获得约15 nm厚度的导电层。</li>
		<li>使用配备肖特基电子源和二次电子探测器的扫描电子显微镜对样品进行成像，电子束电压设置为5–7 kV，工作距离控制在8–9 mm之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>紫外-可见（UV-vis）分光光度法测量
	<ol>
		<li>使用双光束分光光度计在200–800 nm波长范围内，监测所有三种条件下的吸光度曲线（来自步骤2.2.2的未反应颗粒、来自步骤3.2.3的提取色素以及来自步骤3.2.4的色素提取后颗粒）。</li>
		<li>对于未反应颗粒和色素提取后颗粒，使用去离子水在1 ml比色皿中采集空白对照，然后分别采集两种样品的紫外-可见吸收光谱。</li>
		<li>对于提取的色素，使用酸性甲醇溶液在1 ml比色皿中采集空白对照，并采集样品的紫外-可见吸收光谱。</li>
		<li>通过确定吸光度峰值达到相对最高点时所对应的波长，确定各样品的最大吸收波长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li>
<li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflectins%3A+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li>
<li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li>
<li>Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+basis+for+camouflaged+polarized+light+communication+in+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid.</a> Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malleable+skin+coloration+in+cephalopods%3A+selective+reflectance%2C+transmission+and+absorbance+of+light+by+chromatophores+and+iridophores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores.</a> Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).</li>
<li>Cloney, R. A., Brocco, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+Organs%2C+Reflector+Cells%2C+Iridocytes+and+Leucophores+in+Cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods.</a> Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).</li>
<li>Hanlon, R. T., Messenger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+coloration+in+young+cutttlefish+%28Sepia+officinalis+L%29-+The+morphology+and+development+of+body+patterns+and+their+relation+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).</li>
<li>Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalopod+coloration+model.+II.+Multiple+layer+skin+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects.</a> J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+function+of+cephalopod+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores.</a> Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).</li>
<li>Florey, E., Kriebel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid%2C+Loligo+opalescens%2C+to+nerve+stimulation+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li>
<li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+%28Lepidoptera%3A+Nymphalidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li>
<li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Biol.+Jb.+Dodonaea%22%5BJournal%5D)">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li>
<li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

我们已展示了一种从乌贼色素细胞颗粒中提取色素的方法。通过特异性地靶向这些颗粒，我们的目标是确定其在介导适应性体色变化中的作用。该方法不同于以往使用整体组织样本14或冻干皮肤15来表征头足类色素的研究报道。
尽管该方案在提取色素细胞色素方面是有效的，但其仅适用于小规模反应。解剖一只鱿鱼可获得约 11 mg 纯化的颗粒。其中约 58% 的质量含有可溶性色素，该色素使用 HCl-MeOH 溶液提取12。起始用色素细胞组织的纯度直接影响单次解剖所得产物的产量。如果样品在解剖过程中混入过多表皮组织或虹彩细胞组织而出现污染，则最好将样品内容物分离出来，重新悬浮于额外缓冲液中，并重新开始匀浆步骤。从色素细胞组织中分离出纯的色素颗粒群体可能需要多达八次、每次 4 小时的超声处理循环，整个过程可能持续 4 天。在分离过程中保持耐心至关重要，以确保获得纯的色素颗粒群体。
起始颗粒溶液的纯度也会影响使用 HCl-MeOH 进行的色素提取步骤。如果颗粒被未消化的组织包裹，只需将样品涡旋...

鱿鱼、墨鱼和章鱼等头足类动物能够动态改变其外观，以实现伪装和信号传递功能1-6。这种能力部分依赖于一种称为色素细胞（chromatophores）的着色器官的选择性面积扩张4,7-9。色素细胞是一种柔软的执行器，其内部含有被包裹在细胞弹性囊泡中的纳米结构色素颗粒网络，该囊泡通过放射状排列的肌纤维固定1,3。当色素细胞被激活时，其表面积可扩张至原来的500%，使颗粒在整个器官内均匀分布3,7,10,11。当多个色素细胞协同作用时，动物整体的体色随之改变。尽管已知色素颗粒在这一变色过程中发挥重要作用，但其化学组成仍不清楚。本文描述了一种分离和纯化色素细胞中色素的方法，该方法可为后续的成分分析研究提供支持。
色素颗粒的分离涉及多步提取、匀浆和纯化过程。3,12 通过精细切除从头足类动物中获取含有色素细胞的组织。随后采用消化和匀浆处理，以解离周围组织并分离色素细胞。然后通过反复超声处理和离心，从剩余的色素细胞中分离并纯化出具有纳米结构的颗粒。纯化后，采用经改良的酸性甲醇溶液法提取颗粒中的色素，该方法借鉴自蝴蝶翅膀可见颜色的提取技术。13 采用扫描电子显微镜（SEM）和分光光度法确认该方法可成功提取色素细胞中的色素。
本方法描述了用于研究头足类动物体色分子机制的色素细胞颗粒的分离过程。12 从完整动物体中提取小分子通常是一个耗时且繁琐的过程。本文旨在为后续研究人员提供一种高效且简便的实验方案，用于获取头足类动物中具有纳米结构的颗粒内的色素。

<table><tbody><tr><td>胶原酶</td><td>Alfa Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>无危害</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>刺激性，急性毒性</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>轻度刺激性</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>EMD Chemicals</td><td>7647-01-0</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>k-天冬氨酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>与氧化剂剧烈反应</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>轻度眼刺激</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>高度易燃</td></tr><tr><td>微型蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>对金属和皮肤具有腐蚀性</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>刺激性&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种从鱿鱼 doryteuthis pealeii 中提取色素的方法

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

头足类动物能够快速且适应性地改变皮肤颜色，以实现感知、交流、防御和繁殖等功能。这些能力部分依赖于称为色素细胞的着色器官的面积扩张与收缩。尽管已知色素细胞内含有由色素颗粒构成的锚定网络，但其结构与功能特性尚未被充分阐明。本文介绍了一种从鱿鱼Doryteuthis pealeii的色素细胞中分离纳米结构颗粒的方法，并展示了如何使用酸性溶剂提取其中相关的色素。为此，首先通过表层解剖手动分离含有色素细胞的皮肤层，再利用超声处理、离心和洗涤循环去除色素颗粒。随后，通过酸性甲醇溶液提取纯化后颗粒内的色素，使纳米结构直径减小并失去可见颜色。该提取方法可实现从颗粒中获得58%的可溶性色素产率。利用此方法，可确定色素细胞中色素的组成，进而为理解头足类动物适应性变色机制提供依据。

从D. pealeii背部长腕膜中分离出色素细胞（图1A、1B）。去除后，通过离心和洗涤循环裂解并纯化色素细胞，以分离出含色素的颗粒（图2A、2B）。使用酸性甲醇溶液（HCl-MeOH）从颗粒中提取色素（图2C），得到可溶性色素提取物以及不溶的、无色的脱色颗粒。
提取过程会减小颗粒的平均直径，这一现象可通过扫描电子显微镜（SEM）观察到。在颗粒暴露于 HCl-MeOH 之前，其平均直径为 (527.3 ± 91.8) nm（N = 100，误差为标准偏差；图 3A）。当色素从颗粒中被提取后，颗粒尺寸减小至 (202.6 ± 32.2) nm（N = 100，误差为标准偏差；图 3B）。推测该尺寸减小是...

本文介绍了一种从鱿鱼Doryteuthis pealeii色素细胞的纳米结构颗粒中提取色素的实验方案。

一种从鱿鱼 Doryteuthis pealeii 中提取色素的方法

头足类动物能够快速且适应性地改变皮肤颜色，以实现感知、交流、防御和繁殖等功能。这些能力……

本实验的总体目标是描述如何从新解剖获得的长鳍近海鱿鱼（Doryteuthis pealeii）色素细胞中提取位于其纳米结构颗粒内的色素。头足类动物是一类复杂的海洋生物，能够对其皮肤颜色进行快速且适应性的改变。然而，关于这些系统的工作机制仍有许多未知之处。该技术的主要优势在于能够特异性地靶向色素细胞器官中的纳米结构颗粒，这将使研究人员能够阐明起始于纳米尺度的变色机制。除了对头足类生物学提供深入理解外，该研究还可为合成系统的设计提供指导，这些合成系统旨在利用预包装的色素纳米颗粒，模拟头足类所展示的自适应变色的动态范围。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为色素细胞组织与周围组织位置邻近，难以获取纯净的样品。我们的方法经过优化，可有效减少此类污染物。开始解剖时，首先将约 250 毫升过滤海水倒入解剖盘中。将一个标本放入盘内，使用不锈钢直头精细剪刀，从腹侧外套膜基部沿动物后侧剪开，直至鳍区。用解剖镊子轻轻提起所有内部器官，并用剪刀切断结缔组织，将其移除。将器官丢弃至标本袋中。使用解剖T形针，将外套膜鳍面朝上固定于解剖蜡盘上。用镊子小心去除不透明的表皮层，保留含色素细胞的皮肤层完整。将表皮层弃置于样本袋中。接着，去除色素细胞层。将色素组织切成大小为一厘米乘一厘米的小片。将组织切片放入1.5毫升微量离心管中，每管装入约半管解剖好的组织。最后向各管中加入500 µL过滤海水。为分离色素颗粒，首先以14,000 × g离心5分钟，对色素细胞组织切片进行处理。弃去上层海水。向样品中加入500微升木瓜蛋白酶-胶原酶溶液，在最高转速下涡旋震荡一至两分钟。随后，将样品在40 kHz条件下超声处理五分钟，以分离细胞与周围组织。在14,000 × g条件下再次离心5分钟，然后弃去上清液。重复离心操作两次，每次均弃去上清液。随后，加入胶原酶进行重悬。使用镊子手动去除在继续操作前未消化的任何残留大块组织。起始颗粒溶液的纯度会影响色素提取效果，因此确保起始的色素细胞材料完全消化至关重要。我们发现，约一厘米大小的组织切片最适合收集最纯净的颗粒群体。取一个150毫升带螺口盖的试管，加入适量的HEPES、氯化镁、谷氨酸钾和二硫苏糖醇，配制匀浆缓冲液。加入一片商用小型蛋白酶抑制剂片剂。使用量筒量取 100 ml 去离子水，加入含有匀浆盐的离心管中。涡旋振荡离心管，混匀至溶液变澄清。离心组织样品，然后弃去上清液。向每根试管中加入 500 µL 裂解缓冲液，涡旋振荡 2 分钟以充分混匀。在 40 kHz 条件下超声处理样品 30 分钟。然后再次离心。弃去上清液后，重复进行匀浆添加、超声处理和离心操作两到三次，以确保细胞外组织完全消化。最后，离心管中应含有淡黄色的上清液和由分离的色素颗粒组成的红色沉淀。弃去上清液。首先，在螺口盖玻璃样品瓶中配制酸性甲醇用于提取，加入 5 mL 甲醇和 25 µL 浓盐酸，轻轻旋转混匀溶液。预留一个样品管，该样品管将用于终止反应后的颗粒处理。从含有颗粒的第二个管中移除匀浆缓冲液。向其余各管中加入500 µL酸性甲醇溶液，涡旋振荡3至4分钟。在40 kHz条件下超声处理样品10分钟，然后在14000 × g离心5分钟。使用微量移液器将上清液收集到一个一德拉姆容量的螺口玻璃小瓶中。此即为色素，应呈深红色。重复加入酸性甲醇、超声处理及离心步骤四至五次，每次均收集上清液，直至不再有颜色被提取出来为止。剩余的无色沉淀物即为色素提取后的颗粒。为制备用于成像的颗粒样品，首先将未反应的颗粒等分试样和色素提取后的颗粒分别在14000 × g离心5分钟，弃去上清液，然后将每种沉淀物重新悬浮于1 ml 95%乙醇中。使用移液管将每种颗粒悬液各取2-3滴，分别置于独立的铝制扫描电镜载台（SEM stub）上。将样品置于真空干燥器中过夜干燥。对载片进行3分钟的金铂溅射镀膜，使镀层厚度达到15纳米。使用扫描电子显微镜对样品进行成像。接下来，使用分光光度计采集未反应颗粒、提取后颗粒及提取色素的吸光度谱图。通过在洁净的比色皿中加入 1 ml 去离子水，对颗粒样品进行空白测定。将空白溶液弃入废液容器中。接下来，将含有未反应色素颗粒的悬液加入比色皿中。采集颗粒样品的紫外-可见吸收光谱。使用1 mL酸性甲醇和干净的比色皿，对提取的色素进行第二次空白测定。最后，测定色素的紫外-可见吸收光谱，并确定各样品的最大吸收波长。扫描电子显微镜结果显示，色素提取过程降低了颗粒的平均直径。提取前，颗粒的平均直径为527.3 nm。经过酸性甲醇处理后，该尺寸显著减小至约202.6 nm，这种减小被认为是由色素的提取所致。加入酸性甲醇后，未反应颗粒所呈现的颜色也明显减弱。通过分光光度法获得了对该假设的验证。该图显示了提取前颗粒具有较宽的吸收谱，而提取后颗粒的吸收谱同样较宽但强度较低。相比之下，可溶性提取色素在约500 nm处呈现最大吸收峰（lambda max），并在约380 nm处具有明显的肩峰。综合来看，这些数据表明已成功从颗粒中提取出可见颜色。一旦掌握，该技术从开始到结束大约需要四小时即可完成。在进行该操作时，重要的是要彻底去除含有反射性蛋白片层的组织，以免干扰提取与分析过程。表皮组织还可能干扰匀浆步骤和色素提取过程。通过本方法后，可进一步采用其他技术，如薄层色谱法和质谱法，以进一步纯化色素并表征其组成成分。这些步骤有助于阐明头足类动物体色形成的分子基础。该方法可帮助海洋生物学家、化学家和工程师回答一些关键问题，例如：变色过程中所用色素的成分是什么？这些色素如何影响真皮色素细胞器官内纳米结构颗粒的功能与结构？观看本视频后，您应能够充分掌握如何从新解剖获得的长鳍近海鱿鱼（Doryteuthis pealeii）色素细胞中提取色素。

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