建立有限元模型，研究斑马鱼下颌生物力学

这种建模技术的总体目标是模拟开发斑马鱼下颚所经历的机械环境。这种方法可以帮助回答肌肉骨骼领域的关键问题，例如，机械负荷模式如何随时间变化？以及，这些负荷如何刺激细胞行为。

这项技术的主要优点是，它允许我们在机械环境的背景下分析基因表达模式和细胞行为的变化。这种方法可以提供对骨骼发育的见解。它也可以应用于任何其他承受机械负荷的生物结构，例如高等脊椎动物的骨骼元件或心血管系统。

通常，刚接触这种方法的人可能会很困难，因为术语和软件假定具有工程背景。为了可视化骨骼元素的形状，量化肌肉，并确定肌肉附件的确切位置，在骨骼肌球蛋白和 II 型胶原蛋白的适当年龄对鱼进行免疫染色。首先，将鱼幼虫在 4% 多聚甲醛和 PBS 中固定 1 小时。

然后，使用两次 PBT 洗涤液洗去固定剂。接下来，将幼虫在 50% 甲醇和 PBT 中脱水 5 分钟，然后用 100% 甲醇脱水 5 分钟。然后可以将幼虫储存在 100% 甲醇中，以备不时

需要时，将幼虫在 50% 甲醇和 PBT 中再水化 5 分钟。然后，在 PBT 中洗涤 5 分钟。现在，在冰上用 0.25% 胰蛋白酶和 PBT 透化幼虫 5 到 6 分钟。

然后，在 PBT 中洗涤 5 分钟，再重复 PBT 洗涤 3 次。在应用抗体之前，在 5% 血清和 PBT 中封闭幼虫 2 到 3 小时。然后，将幼虫用兔抗 II 型胶原和小鼠抗肌球蛋白抗体与 5% 血清和 PBT 的推荐稀释液孵育。

在室温下孵育 1 小时，或在 4 摄氏度下过夜。使用一抗后，在 PBT 中洗涤幼虫总共 6 次，每次洗涤 15 分钟。PBT 洗涤后，使用 5% 血清和 PBT 模块一到两个小时。

现在，涂抹二抗，从此尽可能将制剂置于黑暗中。在 5% 血清和 PBT 中使用荧光标记的抗小鼠和抗兔二抗。使用二抗后，在 PBT 中洗涤幼虫 6 次，每次洗涤 10 分钟。

任何如前所述染色或表达荧光标签的幼虫现在都可以使用共聚焦显微镜成像，如下所示。使用具有约 2.5 倍数码变焦的 10 倍物镜拍摄感兴趣区域的共聚焦图像堆栈。使用 488 纳米激光器和 561 纳米激光器激发绿色和红色通道。

然后，使用 1.3 微米的 z 平面间隔和 3 条线平均值拍摄 512 平方像素的图像。大约 100 个 z 部分将填充堆栈。将数据导出为 TIFF 图像堆栈。

打开 TIFF 图像堆栈并在相应的软件中查看所有通道。右键单击软骨通道，选择 orthoslice，然后创建。然后，右键单击软骨通道并选择 Image Processing， Smoothing And Denoising，选择图像滤镜，并切换平滑 Gaussian。

在项目视图中，右键单击筛选后的图像并选择 Image segmentation，然后编辑新标签。为每个材质 （如软骨和关节） 创建一个新标签。然后，使用魔术棒工具选择图像的软骨区域，并打开所有切片，并使用画笔工具去除轮廓中的噪点。

接下来，使用画笔工具选择关节区域，将其分配给关节组件，并在整个关节中重复作。要一次平滑多个切片，请从顶部菜单中选择 Segmentation ，然后选择 Smooth labels 。然后，要生成组件的 3D 表面渲染，请右键单击图像并选择 Generate Surface。

现在，单击渲染的表面，并将数据保存为 HMASCII 文件以进行网格划分software. 3D网格生成是生成良好模型的关键步骤。您需要在表示您尝试建模的结构的真实形状的网格之间做出妥协，但不要包含太多细节以致于引入问题单元，例如角度太小或太大的单元。

要生成网格，请将 3D 模型导入到功能强大的软件包中。要生成软骨和关节表面的二维网格，请使用 2D 菜单下的 shrinkwrap 工具。选择介于 1.5 和 2.5 之间的元素大小。

可以制作一系列不同大小的表面网格来执行 3D 网格优化。为了确保网格在关节和软骨表面之间是连续的，边界上的任何单元都必须共享公共节点。为此，请去除接头的内表面，留下一根空心管。

使用 F2 功能键访问"删除元素"菜单的快捷方式。选择要删除的元素。调整边界节点以匹配软骨表面。

使用 F2、F3 和 F6 功能键的组合可分别删除、移动节点和创建新元素。最后，使用收集器的 organize components 菜单复制关节处的软骨曲面。使用 F2 功能键可删除所有非关节元素。

然后，转到 检查元素 面板。检查网格中是否有重复的单元、插入和穿透。如果找到，请使用 Tools 选项卡对其进行编辑。

使用模型树选项中的 utility 选项卡检查二面角。要从不同单元大小的 2D 表面网格生成 3D 网格，请使用 Tetramesh 工具。比较不同的网格大小，并选择网格大小最小的 FE 模型，该模型在进一步仿真后收敛，并且不会影响特征定义。

接下来，使用 Distance （距离） 工具，变换网格，使钳口模型按比例缩放。通过导出合并模型或使用系带，确保在模型中连接软骨和关节组件。接下来，将载荷、约束和材料属性应用于 FE 模型以模拟钳口功能。

使用标记的共聚焦堆栈作为指导，定义肌肉。首先，分配与肌肉附着点相对应的节点。然后，在节点之间创建表示每块肌肉的起点和插入点的向量。

定义完所有肌肉后，创建一个历史 loadcollector，并将 Cload 应用于每个肌肉。以牛顿为单位指定大小，并分配关联的矢量。然后，根据文献确定，分配适当的弹性各向同性材料属性。

接下来，创建一个边界 loadcollector，并在模型上应用一些初始约束。选择要约束的节点，然后选择一个自由度因子，该因子类似于由这些节点定义的肌肉的自然运动范围。现在，为每种类型的运动创建一个加载步骤以进行仿真。

在分析菜单下，选择所有相关的载荷和约束以模拟指定的运动。然后，从下拉菜单中选择 static。准备就绪后，以适当的文件格式导出模型，包括网格、载荷、约束和材料属性。

在这种情况下，选择 INP 格式。然后，将模型加载到 FE 分析软件中。在其中，为模型创建并执行作业，并分析应力、应变、位移等的输出。

选择 3 到 6 只转基因斑马鱼幼虫，用 0.02% MS-222 轻轻麻醉幼虫，直到它们对触摸停止反应，但它们的心脏仍然跳动。然后，将幼虫横向安装在盖玻片上，加入 Danieeau 溶液中温热的 1% 低熔点琼脂糖。接下来，用镊子小心地从头部和下巴周围去除琼脂糖。

然后，使用巴斯德移液管，将新鲜的 Danieau 溶液冲洗到幼虫的头部以去除麻醉剂。这样做直到恢复正常的嘴巴运动。现在，使用电影捕捉软件拍摄嘴部运动的荧光高速视频。

以最高帧速率拍摄胶片，以记录多个钳口张开周期。稍后，分析钳口的最大位移。选择显示下巴张开最宽的框架，并测量 Mickel 软骨前尖与上颌之间的距离。

上颌点对应于筛骨板的尖端。肌肉和软骨的免疫染色或转基因报告基因的成像可以可视化颌骨的 3D 结构以及相关的肌肉组织。通过高分辨率成像，可以构建捕获下巴 3D 形状的模型。

该模型包含的载荷的位置和大小来自肌肉和软骨的共聚焦图像。从这个模型中，测试了一系列不同的材料特性。利用通过高速视频捕获看到的体内位移，选择了一个最能复制该运动范围的模型。

使用最准确的材料属性、载荷和网格形状数据，FE 模型用于探索对这段时间内所经历的机械环境的最佳估计。例如，测量了应力的大小。可以放大模型以查看图案的精细细节，然后在数字切片中查看以观察所有维度的细节。

观看此视频后，您将很好地了解如何使用共聚焦成像来构建承受机械载荷的生物结构的生理精确 3D 模型。在尝试此过程时，请务必记住，这是一个线性弹性模型，软骨并不完全表现为线性材料。可以合并其他材料属性，例如磁导率，但可能需要对网格进行进一步修改。