Name: 建立有限元模型，研究斑马鱼下颌生物力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: 了解有限元分析方法，通过建立斑马鱼下颌的三维生物力学模型，模拟机械环境对骨骼发育的影响。该技术结合共聚焦成像与有限元分析，为研究肌肉骨骼发育提供重要工具。

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LHB 由惠康信托动态细胞博士项目资助；KAR 由医学研究理事会项目基金 MR/L002566/1（授予 EJR 和 CLH）资助；CLH 由阿尔茨海默病研究英国基金 19479 资助。我们还要感谢沃尔夫森生物成像中心在成像技术方面的指导。

本方案中的所有步骤均遵循布里斯托大学的动物护理与福利指南以及英国政府内政部的相关规定。
1. 骨骼肌肉系统解剖结构的可视化
注意：为了观察骨骼结构的形态、定量分析肌肉并确定肌肉附着点的精确位置，可在适当发育阶段对鱼进行免疫染色（第1.1节），检测骨骼肌球蛋白（用于显示肌肉）和II型胶原蛋白（用于观察软骨）。或者，可利用转基因荧光报告小鼠品系来观察肌肉骨骼系统的解剖结构，例如使用胶原a1报告基因col2a1:mCherry13,14标记软骨，以及使用慢肌球蛋白重链报告基因smyhc:GFP15标记肌肉附着位置（第1.2节）。
标记软骨和肌肉的其他细胞系同样可以很好地发挥作用。
<ol>
	<li>荧光免疫染色
	<ol>
		<li>用过量的4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）固定幼虫1小时。用含0.1% Tween 20的PBS（PBT）洗涤，随后分别用PBT中的50%甲醇（MeOH）和100%甲醇各脱水5分钟。 
		注意：PFA具有毒性，应根据材料安全数据表进行操作。 
		备注：幼虫可在100%甲醇中保存至后续使用。</li>
		<li>用PBT中的50%甲醇重水化幼虫5分钟。再用PBT洗涤5分钟。</li>
		<li>在冰上用PBT中0.25%胰蛋白酶处理幼虫5–6分钟以通透组织。随后用4倍体积PBT每次洗涤5分钟，共洗涤4次。</li>
		<li>用含5%血清的PBT在室温下封闭2–3小时。</li>
		<li>将幼虫置于含5%血清的PBT中，加入推荐稀释比例的兔抗II型胶原抗体和鼠抗肌球蛋白抗体，在室温孵育1小时，或在4 °C过夜。 
		备注：推荐的稀释范围通常可在抗体产品说明书中找到。应选择针对不同物种产生的抗体，且这些物种需与待测组织来源不同。</li>
		<li>用PBT洗涤幼虫6次，每次15分钟。</li>
		<li>用含5%血清的PBT封闭1–2小时。</li>
		<li>避光条件下加入二抗孵育。使用适当稀释比例的荧光标记抗小鼠（550）和抗兔（488）二抗，溶于含5%血清的PBT中，针对特定抗体选择合适稀释度。</li>
		<li>用PBT每次10分钟，共洗涤6次，随后尽快在10倍物镜的共聚焦显微镜下成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨骼肌肉系统形态成像
	<ol>
		<li>将幼虫腹面朝下贴附于盖玻片上，使用温热的Danieau溶液中0.3–0.5%低熔点琼脂糖（LMP）封片16。 
		备注：转基因鱼在固定和成像期间需用0.02% MS222（三卡因甲磺酸盐，pH 7）进行麻醉。</li>
		<li>使用10倍物镜并配合约2.5倍数字放大，对目标区域采集共聚焦图像Z轴序列。分别使用488 nm和561 nm激光获取绿色和红色荧光通道图像。设置图像分辨率为512 × 512像素，Z轴层间间隔为1.3 µm，每层扫描取3次线平均。最终图像序列包含约100个Z轴切片。</li>
		<li>将数据导出为TIFF序列格式。来自5天龄斑马鱼幼虫的肌肉和软骨结构的最大投影图像如图1所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 生成三维表面
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>在3、4和5 dpf时间点中，分别选择一个具有代表性的数据集（在对多个样本进行可视化观察后选择）。</li>
	<li>打开三维 TIFF 图像栈，并在分析软件中选择所有通道。右键单击软骨通道，选择图像滤波与平滑：Gaussian（图2B).</li>
	<li>在项目视图中，右键单击已过滤的图像，选择“图像分割”，然后选择“编辑新标签”。为每种材料创建一个新标签。 即， 软骨与关节。选择图像中的软骨区域（图2C，白色信号，紫色轮廓）使用魔棒工具。使用画笔工具去除轮廓上的噪声。 
	注意：如果使用魔棒工具，请点击“所有切片”。</li>
	<li>使用画笔工具选择关节区域，并分配给关节组件图2C，蓝色轮廓）</li>
	<li>在顶部菜单中选择“分割”并平滑标签，以同时平滑多个切片。在图像上右键单击，选择“生成表面”，以生成该组件的三维表面渲染图。图 2D).</li>
	<li>单击表面，将数据保存为 hmascii 文件，以便导入网格生成软件。</li>
</ol>
3. 计算有限元模型中要使用的肌肉力
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>通过共聚焦显微镜图像统计表达 smyhc:GFP 的转基因斑马鱼肌肉纤维数量（图1A，箭头所示，1C），并测量纤维直径以计算其横截面积（πr2）。</li>
	<li>从文献中确定单位面积肌肉的适宜作用力。本研究采用幼体斑马鱼骨骼肌每单位面积产生的最大肌肉力（40 nN/µm2）17。</li>
	<li>将各解剖学肌肉群的纤维数量与其横截面积相乘，再乘以单位面积作用力，计算各肌肉群的总作用力。见表1。</li>
</ol>
4. 生成网格
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将第2节（上文）生成的3D模型导入具备生成有限元网格功能的软件包中。</li>
	<li>在“2D”菜单下使用包裹收缩（shrink wrap）工具，对软骨和关节表面生成2D网格。选择合适的单元尺寸。 
	注意：单元尺寸建议在1.5–2.5之间。如有必要，可生成一系列不同尺寸的2D表面网格，以进行3D网格优化（第4.4节）。</li>
	<li>在“2D&#62;Tools&#62;Check elements”面板中执行网格质量检查，以检测网格中是否存在重复单元、插入或穿透问题。使用模型树中的工具选项卡修正二面角问题。</li>
	<li>利用“3D&#62;Tetramesh”子面板，基于不同单元尺寸的2D表面网格生成3D网格。 
	注意：比较不同网格尺寸的计算结果，选择在后续模拟中能够收敛且不损害特征定义的最小网格尺寸的有限元模型。如图3所示示例，下颌软骨部分包含150万个四面体单元，其2D单元尺寸为2.0。</li>
	<li>使用“Geometry&#62;Distance”子面板对网格进行变换，使下颌模型与共聚焦图像序列的比例一致。 
	注意：确保通过导出合并后的模型或使用绑定（ties）方式，使模型中的软骨和关节组件相互连接。</li>
</ol>
5. 有限元模型构建
<ol>
	<li>使用商业有限元（FE）软件建立有限元模型。以第1节中生成的三维肌肉和软骨标记共聚焦图像序列作为参考，指定对应于肌肉附着点的节点。在代表每块肌肉起点和止点的两个节点之间创建矢量图3).</li>
	<li>创建类型为“history”的载荷集，以对每块肌肉施加“C载荷”。指定以牛顿为单位的载荷大小（在步骤3.3中计算得出），并分配相应的矢量。 图3 显示了下颌收肌（AM）、舌颌前肌（PH）和下颌间肌（IM）的附着点。 
	注意：对于这些咀嚼肌，最大收缩力分布在起点和止点之间，因此每个位点仅承受负荷的50%。</li>
	<li>根据文献确定，赋予适当的各向同性弹性材料属性。本模型中软骨和中间区的杨氏模量分别为1.1 MPa和0.25 MPa，泊松比均为0.25 18,19.</li>
	<li>创建一个类型为“boundary”的载荷集，以对模型施加初始约束。转到分析选项卡&#62;在创建子面板中，选择您希望施加约束的模型节点。选取自由度（DOF），以最接近其自然活动范围的方式限制模型的运动。 
	注意：模型在 图3 在模型的中点处，通过将角舌骨固定以限制其在所有运动轴（DOF：1、2、3 分别代表 x、y 和 z）上的自由度，同时在腭方骨与斑马鱼头骨其余部分连接处限制其 y 和 z 轴方向的自由度图3, 表1）。该模型必须在至少一个节点上约束所有三个自由度。</li>
	<li>为希望模拟的每种运动类型创建一个“加载步骤”，即， 在分析菜单中选择“打开”和“关闭”，并选中所有相关的载荷（见第5.2节）和约束（见第5.4节）以模拟该运动。当下拉菜单出现时，选择“Static”（静态）。</li>
	<li>以合适的文件格式导出包含网格、载荷、约束和材料属性的模型，在本例中 &#34;.inp&#34; 格式。</li>
	<li>将模型载入有限元分析软件。使用“作业”模块创建并运行该模型的作业。</li>
	<li>分析应力、应变和位移输出结果 等等。 位于结果标签页和可视化菜单中（图4 和 5).</li>
</ol>
6. 颌骨变形/位移距离的验证
<ol>
	<li>选取3-6条Tg(Col2a1aBAC:mcherry)转基因斑马鱼。</li>
	<li>用0.02% MS222轻微麻醉幼鱼，直至其对触碰无反应但心脏仍在跳动。</li>
	<li>将麻醉后的幼鱼侧向固定在盖玻片上，使用温热的1%低熔点琼脂糖（用Danieau溶液配制）包埋。</li>
	<li>用镊子去除头部和下颌周围的琼脂糖。</li>
	<li>使用巴斯德吸管将新鲜的Danieau溶液（不含MS222）冲洗幼鱼头部，以去除麻醉剂，直至口部恢复正常的运动。</li>
	<li>使用视频采集软件拍摄口部运动的明场高速视频。以最高帧率拍摄约一分钟的视频，或确保记录到多个下颌张开周期。</li>
	<li>选择显示下颌张开至最大位移的帧。测量Meckel软骨前尖端与上颌（筛骨板尖端）之间的距离，单位为µm。</li>
	<li>计算多条幼鱼的平均位移。</li>
	<li>从模型中提取位移数据。使用步骤6.8中计算的平均位移来验证模型的位移行为（图4）。如果模型结果与预期不符，通过依次改变材料属性和肌肉载荷进行敏感性分析。</li>
</ol>

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<li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+physiol%22%5BJournal%5D)">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。
图3-5中的部分数据已获爱思唯尔（Elsevier）许可，重新发表自 J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., 《有限元建模预测咀嚼肌应变缺失对下颌发育过程中关节形态及细胞行为的影响》, 3112-3122, 201515。

有限元模型已被用于关联骨骼元件中受应变区域与发生骨形成的区域10，以及绘制软骨内成骨和关节形态发生过程中受应变的区域8,12,21。其他研究也已成功应用理论生长模型来模拟关节发育过程中的变化11,12。本文展示了构建有限元模型的实验方案，研究系统为相对简单的斑马鱼下颌20。与获取有限元模型原始图像的其他方法（如CT扫描22）不同，对转基因品系或免疫染色的斑马鱼进行共聚焦成像可实现对多种组织的同时研究，因此能够提供肌肉附着点与软骨之间关系的直接信息。在脊椎动物模型中，斑马鱼特别适合进行遗传学和药理学操作。斑马鱼颅面软骨有限元模型的建立，为进一步研究生物力学与遗传因素在关节形态发生中的相互作用提供了可能。
创建有限元模型的过程包含多个关键步骤；第一步是生成系统的精确三维表示。这需要足够高分辨率的成像，以清晰界定边界。需要注意的是，即使采用高分辨率成像来构建良好的表面，也可能需要对某些区域进行平滑处理。另一个关键步骤是正确定义载荷的施加位置和约束条件。约束不足的模型将无法求解，而载荷位置设置不当则会导致异常位移。
原始数据的某些处理（图2）是必要的，因为由原始数据生成的表面难以进行网格化处理（图2B）。我们使用高斯滤波器对数据进行过滤（图 2C）并对曲线进行了一些手动平滑处理，以获得一组可转换为三维曲面的清晰轮廓。过度平滑可能会导致 &#34;熔化的&#34; 表面已失去许多原有特征。选择合适的单元尺寸是一个迭代过程，因为单元尺寸过小会导致网格过大，计算量显著增加；而单元尺寸过大则会产生无法准确再现结构真实形态的网格。理想的网格应采用能够准确捕捉下颌形态并收敛于正确解的最小单元尺寸，并通过下颌位移情况进行验证。此外，可能还需要调整材料属性或载荷计算，以更真实地模拟不同年龄和物种间存在显著差异的位移行为。
需要始终牢记的是，任何假设模型及其用于运行有限元（FE）模型的假设都存在一定的局限性。当仅对一个或少量样本进行建模时，至关重要的是确保所选样本具有代表性，因为个体之间可能存在细微差异。由于模型中仅包含了部分颌部结构和肌肉，因此该模型是对斑马鱼颅面肌肉骨骼系统的简化表达。因此，必须设置约束条件，以模拟颌部结构与颅骨其余部分的连接位置，同时在模型中心人为施加约束，以将其固定在“空间”中。这种人为约束并未影响从模型中得出的结论，因为研究并未对角鳃骨（ceratohyal）本身进行分析。若能纳入更多的颅面结构，特别是其他参与张颌的肌肉（如胸鳃肌）及其附着的软骨23，可能有助于提升模型的完整性，但受限于较大模型在有限元软件中运行的能力，这些扩展存在实际困难。
另一个局限性在于我们尚未模拟韧带附着点，尽管这可以通过引入弹簧来实现。 8另一个在此情况下所做的假设是，该模型将呈现线性行为。模型上的应变幅度与已发表模型中的应变幅度相当，并被施加于 体外 细胞 10,24，且在远离约束和肌肉附着点的区域，应变值介于+3,500至-5,000 µɛ之间。因此，模型中相关区域的应变被认为处于线性模型可接受的范围之内。软骨并不完全表现为线性材料，以往曾被建模为多孔弹性材料，从而能够对模型中的流体行为进行分析。 25将肌肉附着点分散到一组局部节点上，可分散峰值受力，并更准确地表示某些肌肉的肌腱止点。
有限元（FE）可用于评估作用在结构上的应变和应力。作为一种技术，它广泛应用于多种生物科学领域，包括骨科、古生物学，以及近年来的发育生物学。本文描述了如何构建斑马鱼下颌的有限元模型。未来，这些模型可进一步扩展至整个颌部，包括腭部。类似的技术也可用于构建鱼类脊柱生物力学模型，而迄今为止，鱼类脊柱生物力学主要通过运动学方法进行研究。

有限元（FE）建模是一种工程学技术，可通过计算方法确定并绘制作用于结构上的应变大小和位置1。该模型由三维结构组成，该结构通过由&#34;有限元&#34;构成的网格表示，分析的最终结果受多种因素影响，包括网格中单元的结构与数量、机械载荷的大小和位置以及材料属性。材料属性用于描述材料在特定类型载荷作用下的某些行为特征；杨氏模量（E）描述材料的弹性，而泊松比则描述样品被拉伸时其横向收缩与纵向伸长之间的比例关系。有限元建模可通过综合考虑结构形状、载荷位置与大小以及特定材料属性等独特输入数据，计算作用于模型上的多种变量，包括位移、应力、压力和应变。
有限元（FE）建模在工程领域中被广泛应用2，并 increasingly 用于骨科3和古生物学研究4。在发育过程中，生物力学力已被证实可作为多种细胞的刺激信号，引发细胞响应5-8；因此，预测发育中器官系统内力学刺激的相对位置及其大小具有重要意义。然而，目前有限元建模在斑马鱼发育研究中的应用仍较少。
已有研究表明，软骨和骨均为对力学刺激敏感的材料。例如， 体外 压缩已被发现可激活软骨生成通路，而张力则被证明是骨形成所必需的 9有限元分析（FEA）已被用于模拟作用于生物样本上的应变，包括骨形成过程中作用于骨骼结构上的应变。 10其他发育学应用包括利用该方法预测关节在受到理论生物力学力作用后所形成的形态 11,12 以展示雏鸡膝关节形态发生过程中存在的应变模式 8.
本方案旨在分享从共聚焦图像生成三维表面、网格及有限元模型的经验，以期理解发育组织的力学特性。我们还展示了通过获取真实关节位移信息来验证有限元模型的方法。 体内虽然我们以斑马鱼的颌部作为示例，但相同的技术可应用于任何可通过共聚焦或多光子成像获得肌肉骨骼系统结构三维信息的小型生物系统。

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>II型胶原抗体——可标记所有软骨</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>A4.1025</td><td>骨骼肌肌球蛋白抗体——可标记所有骨骼肌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>用于固定斑马鱼样品</td></tr><tr><td>MS222（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>用于制备麻醉剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>样品通透处理</td></tr><tr><td>Dylight 488 小鼠 IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Dylight 550 兔 IgG</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>84541</td><td>二抗</td></tr><tr><td>SP8/SP5 或 SPE 共聚焦显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>用于成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leica 采集软件</td><td>Leica</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>Aviso（版本 7.0.0）</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>三维图像分析软件（第2节）</td></tr><tr><td>Hyperworks 软件包中的 Hypermesh 模块（版本 10）</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>有限元模型生成软件（第4-5节）</td></tr><tr><td>Abaqus（版本 6.14）</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>有限元分析软件（第5.7-5.8节）</td></tr></tbody></table>

构建有限元模型以研究斑马鱼颌骨生物力学

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

骨骼形态发生是在发育过程中通过严格调控的细胞行为实现的；许多细胞类型会响应机械应变而改变其行为。骨骼关节会受到动态的机械负荷作用。有限元分析（Finite Element Analysis, FEA）是一种计算方法，工程领域常用该方法预测材料或结构对机械输入的响应。通过将整个系统（本例中为斑马鱼颌骨骨骼）划分为由更小的“有限单元”组成的网格，FEA可用于计算该结构对外部载荷的机械响应。结果可通过多种方式可视化，例如以“热图”形式显示最大和最小主应变的位置（正主应变表示拉伸，负主应变表示压缩；最大和最小分别指代最大和最小的应变值）。这些信息可用于识别在颌部运动过程中哪些颌骨区域以及哪些细胞可能承受特别高的拉伸或压缩负荷，从而有助于揭示机械应变与细胞行为之间的关系。本实验方案描述了如何利用共聚焦图像数据构建肌肉骨骼系统的有限元模型，以斑马鱼下颌作为实际示例。本方案引导读者完成一系列步骤：1）对肌肉骨骼组分进行染色，2）成像肌肉骨骼组分，3）构建三维（3D）表面模型，4）生成有限元网格，5）求解有限元分析，最后 6）通过与鱼类颌部运动中观察到的实际位移进行比较，验证分析结果。

肌肉免疫染色图1A）和软骨（图1B）或转基因报告基因的成像（图1C) 可以可视化颌骨的三维结构及其相关肌肉组织。通过高分辨率成像，能够构建出同时捕捉颌骨三维形态（图2）以及载荷的位置和放置方式（图3）。利用 体内 通过高速视频捕捉观察到的位移（图4我们验证了模型的活动范围处于合理范围内。
运行有限元模型后，可用于显示多种数据，例如应力（图 5A）、最小和最大主应变（图 5B–K）。这些结果具有三维特性，因此可放大模型以观察细节的精细分布模式（图 5E、图 5I），旋转以获得相关视角（图 5F、图 5G、图 5J、图 5K），并进行数字切片（图 5E'、图 5E''、图 5I'、图 5I''），以展示应力、应变或压力在模型内部的变化情况。此外，还可从模型中提取定量数据（未显示）。通过验证模型，并采用最精确的材料属性、载荷和网格形状，有限元模型可用于推断细胞在特定发育阶段所经历的力学环境的最佳估计值。模型的结果可直接与细胞行为和基因表达的变化进行比较 20。
<img alt="昆虫肌肉结构的荧光显微图像；绿色的肌动蛋白丝和红色的外骨骼。" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 斑马鱼下颌骨骼肌肉结构在5天后受精（5 dpf）的代表性图像。 所示为5 dpf幼鱼下颌的代表性共聚焦图像堆栈，图像方向均为前方朝上。（A）A4.1025免疫染色，标记所有骨骼肌球蛋白；（B）II型胶原免疫染色，标记所有软骨；（C）来自活体幼鱼的图像堆栈，该幼鱼表达转基因报告基因col2a1:mCherry标记软骨（红色）和smyhc:GFP标记慢肌（绿色）。IA：前下颌间肌，PH：舌颌前肌，AM：颌舌肌，HI：下舌肌，HS：上舌肌，CH：胸舌肌，MC：迈克尔软骨，PQ：腭方软骨，CH：角舌软骨。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="骨骼成像过程；滤波显微镜与三维重建；关节、软骨分析。" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2： 从共聚焦数据生成三维表面。 图像显示斑马鱼下颌从共聚焦数据转换为三维表面的过程，其中关节区域为高倍放大图像。（A）原始共聚焦数据；（B）应用高斯滤波后的数据集；（C）滤波后的轮廓；（D）三维表面。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="口部力学示意图；静态力；矢量，5 dpf 鱼类颌部，口部开合受力。" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 显示约束条件和力矢量的代表性网格图。 5 dpf 幼鱼的代表性网格，分别对应（A）口部闭合和（B）口部张开。白色圆点表示模型中施加约束的位置及其受约束的维度（例如，x 和 y 方向，或 x、y 和 z 方向）。白色线条表示肌肉位置，肌肉力的方向由白色箭头表示。红色表示软骨，黄色表示中间区。该图改编自 Brunt et al. 15 之前发表的补充材料。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流场可视化，变量 c=1.1–6.1，i=0.25–1.0，以开/闭状态标注的彩色深度图" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4： 敏感性测试。 模拟不同软骨和连接区杨氏模量下5 dpf斑马鱼下颌位移的有限元模型。下颌位移（从张开到闭合） µm）在下颌上标记，并使用色键记录。每个模型（A-L) 具有不同的软骨（c = 1.1、3.1 或 6.1 MPa）或间充质区（i = 0.25、0.5、0.75 或 1 MPa）属性组合。水平黑色箭头指示下颌在麦克尔软骨尖端（由垂直黑色箭头表示）的位移值。 M 和 N 5 dpf幼虫视频中的静止图像显示最小值，即 下颌闭合（M) 和最大值， 即， 下颌完全张开（N）与两个重叠的（O）— O 上的白线代表位移（的 43 µm）。在此情况下，软骨相对属性为1.1，中间区为0.25（A）时，最接近活体鱼类中观察到的位移情况O）。该图的 A-L 面板此前已发表于 Brunt 等 15. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="生物力学应变分析，用颜色编码的有限元模型图示应力分布。" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：有限元模型的代表性数据。 对5 dpf幼鱼中所有肌肉施加的有限元模型模拟结果（A–C）。（A）Von Mises 应力（EMaxmin）；（B）最小主应变（E Min. P, µɛ）；（C）最大主应变（E Max. P., µɛ）。有限元模型模拟下颌张开过程中最大与最小主应变的分布。（D–K）：最大主应变（E Max. P., µɛ）在（D）下颌腹侧视图和（E）关节腹侧视图中的分布；（E）显示通过Meckel软骨关节和中间区的近-远端切面位置，分别对应于（E'）和（E''）；（F）：下颌侧视图；（G）：关节侧视图。（H–K）：最小主应变（E Min. P, µɛ）在（H）下颌腹侧视图和（I）关节腹侧视图中的分布；（I）显示通过Meckel软骨关节和中间区的近-远端切面位置，分别对应于（I'）和（I''）；（J）：下颌侧视图；（K）：关节侧视图。该图此前已发表于 Brunt et al. 15。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>肌纤维数量</td>
			<td>肌纤维面积 (µm2)</td>
			<td>肌群面积 (µm2)</td>
			<td>力 (N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 dpf 前部间颌肌</td>
			<td>5</td>
			<td>23.8</td>
			<td>119</td>
			<td>4.76e-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 dpf 舌颌前肌</td>
			<td>6</td>
			<td>23.8</td>
			<td>142.8</td>
			<td>5.71e-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 dpf 颌闭肌</td>
			<td>9</td>
			<td>23.8</td>
			<td>214.2</td>
			<td>8.57e-6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 肌肉定量分析。 使用40 nN/µm2（来自参考文献17的单位面积取值）计算得出在5 dpf时下颌前肌（Intermandibularis Anterior）、下颌提肌（Adductor Mandibulae）和舌骨前肌（Protractor Hyoideus）的平均肌肉力。（Lorga et al., 2011）（n = 3）。

有限元分析是研究结构在载荷作用下力学性能的常用工具。在此，我们将该方法应用于斑马鱼颌骨生物力学的建模。

骨骼形态发生通过发育过程中严格调控的细胞行为实现；多种细胞类型会响应机械刺激而改变其行为……

该建模技术的总体目标是模拟斑马鱼颌部发育过程中所经历的力学环境。该方法有助于回答肌肉骨骼领域中的关键问题，例如：力学负荷的模式如何随时间变化？以及这些负荷如何刺激细胞行为？该技术的主要优势在于，它能够让我们在力学环境的背景下分析基因表达模式以及细胞行为的变化。该方法可为骨骼发育研究提供重要见解，也可应用于其他承受力学负荷的生物结构，例如高等脊椎动物的骨骼组分或心血管系统。通常，刚接触该方法的人员可能会遇到困难，因为相关术语和软件默认使用者具备工程学背景。为了观察骨骼元件的形态、量化肌肉，并确定肌肉附着点的精确位置，需在适当发育阶段对鱼类进行骨骼肌球蛋白和II型胶原蛋白的免疫染色。首先，将一条鱼幼体用4%多聚甲醛和PBS固定1小时。然后，用两轮 PBT 清洗去除固定剂。接着，将幼虫在 50%甲醇和 PBT 中脱水 5 分钟，再在 100%甲醇中脱水 5 分钟。之后可将幼虫保存在 100%甲醇中，直至需要时使用。必要时，将幼虫在50%甲醇和PBT中重新水化五分钟。随后，在PBT中洗涤五分钟。接着，将幼虫置于冰上，用0.25%胰蛋白酶和PBT处理五至六分钟以进行通透。然后用PBT清洗5分钟，并重复PBT清洗三次。在施加抗体之前，用含5%血清的PBT对幼虫进行封闭，封闭时间为2至3小时。随后，将幼虫置于推荐稀释度的兔抗II型胶原抗体和小鼠抗肌球蛋白抗体溶液中孵育，溶液中含有5%血清和PBT。在室温下孵育一小时，或在4摄氏度下孵育过夜。加入一抗后，用PBT缓冲液总共洗涤幼虫六次，每次15分钟。PBT洗涤后，加入5%血清与PBT的封闭液，封闭一至两小时。现在加入二抗，并从此时起尽量将样品避光。使用含5%血清和PBT的荧光标记抗小鼠和抗兔二抗。加入二抗后，用PBT清洗幼虫，每次10分钟，共清洗六次。按照上述方法染色或表达荧光标签的任何幼虫，现在均可按照以下步骤使用共聚焦显微镜进行成像。使用10倍物镜并配合约2.5倍数字放大，对目标区域采集共聚焦图像序列。分别采用488纳米激光激发绿色荧光通道，561纳米激光激发红色荧光通道。然后，使用1.3微米的z平面间隔，采集512×512像素的图像，每帧取三次线平均。约100个z层面可填满整个图像栈。将数据导出为TIFF图像栈。在适当的软件中打开 TIFF 图像堆栈并查看所有通道。右键单击软骨通道，选择正交切片（orthoslice），然后创建。接着，再次右键单击软骨通道，选择图像处理（Image Processing）、平滑与去噪（Smoothing And Denoising），选择图像滤波器，并启用高斯平滑（smoothing Gaussian）。在项目视图中，右键单击已过滤的图像，选择图像分割，然后选择编辑新标签。为每种材料（如软骨和关节）创建一个新标签。接着，在启用“所有切片”切换的情况下，使用魔棒工具选择图像中的软骨区域，并使用画笔工具去除轮廓上的噪声。接下来，使用画笔工具选择关节区域，并将其分配给关节组件，然后在整个关节范围内重复此操作。若需同时平滑多个切片，请从顶部菜单中选择“分割”（Segmentation），然后选择“平滑标签”（Smooth labels）。接着，为生成该组件的三维表面渲染图像，右键点击图像并选择“生成表面”（Generate Surface）。现在，单击渲染后的表面，并将数据保存为用于网格生成软件的 HMASCII 文件。三维网格生成是构建良好模型的关键步骤。您需要在网格能够准确反映所建模结构真实形状的同时，避免包含过多细节，以免引入问题性单元，例如角度过小或过大的单元。为了生成网格，将三维模型导入具备相应功能的软件包中。使用二维菜单下的包裹（shrinkwrap）工具，对软骨和关节表面生成二维网格。选择1.5至2.5之间的单元尺寸。可制作多种不同尺寸的表面网格以进行三维网格优化。为确保关节面与软骨面之间的网格连续性，边界上的任何单元必须共享公共节点。为此，需移除关节的内表面，形成一个中空管状结构。使用 F2 功能键进入“删除元素”菜单的快捷方式。选择要删除的元素。调整边界节点以匹配软骨表面。分别使用 F2、F3 和 F6 功能键来删除、移动节点以及创建新元素。最后，通过收集器组织组件菜单复制关节处的软骨表面。使用 F2 功能键删除所有非关节元素。随后，进入“检查元素”面板执行质量检查。检查网格中是否存在重复的单元、插入和穿透问题。如果发现问题，使用“工具”选项卡进行编辑。使用模型树选项中的工具栏检查二面角。要从不同单元尺寸的二维表面网格生成三维网格，请使用四面体网格工具。比较不同的网格尺寸，选择在进一步模拟后收敛且不损害特征定义的最小网格尺寸的有限元模型。接下来，使用距离工具调整网格，使下颌模型按比例缩放。通过导出合并后的模型或使用绑定连接，确保模型中的软骨和关节组件相互连接。然后，向有限元模型施加载荷、约束和材料属性，以模拟下颌功能。以标记的共聚焦图像序列作为参考，界定肌肉结构。首先，标注与肌肉附着点相对应的节点。然后，在代表每块肌肉起点和止点的节点之间创建矢量。在定义所有肌肉后，创建一个历史载荷收集器，并为每块肌肉施加一个集中载荷（Cload）。指定载荷大小，单位为牛顿，并分配相应的矢量方向。然后，根据文献确定的结果，指定适当的各向同性弹性材料属性。接下来，创建一个边界载荷集，并在模型上施加一些初始约束。选择需要约束的节点，并选取一个自由度因子，使其接近由这些节点定义的肌肉的自然活动范围。然后，为每种需要模拟的运动类型创建一个载荷步。在分析菜单下，选择所有相关的载荷和约束，以模拟指定的运动。然后，从下拉菜单中选择静态分析。准备就绪后，以适当的文件格式导出模型，包括网格、载荷、约束和材料属性。在此情况下，选择 INP 格式。然后，将模型载入有限元分析软件中。在软件中为该模型创建作业并运行，分析输出的应力、应变、位移等结果。选取三至六条转基因斑马鱼幼鱼，用0.02% MS-222轻度麻醉幼鱼，直至其对触碰无反应，但心脏仍保持跳动。随后，将幼鱼侧向固定在盖玻片上，使用温热的、含1%低熔点琼脂糖的Danieau溶液。接着，用镊子小心去除头部和下颌周围的琼脂糖。然后，使用巴斯德移液管将新鲜的Danieau溶液冲洗至幼虫头部，以去除麻醉剂。重复此操作直至幼虫口部运动恢复正常。接着，使用视频采集软件拍摄口部运动的荧光高速视频。以最高帧率拍摄，直至记录到多个下颌张开周期为止。随后分析下颌的最大位移。选取下颌张开最宽的帧图像，测量Meckel软骨前尖与上颌之间的距离。上颌的参考点对应筛骨板的尖端。通过对肌肉和软骨进行免疫染色，或对转基因报告基因进行成像，可实现颌部三维结构及其相关肌肉组织的可视化。通过高分辨率成像，能够构建出精确呈现颌部三维形态的模型。该模型纳入了基于肌肉和软骨共聚焦图像所确定的位置和大小的载荷。通过该模型，测试了多种不同的材料属性。结合高速视频捕捉观察到的体内位移，最终选择了一个最能复制该运动范围的模型。利用最精确的材料属性、载荷和网格形状数据，有限元模型被用于探究在此时间段内所经历的力学环境的最佳估计值。例如，测量了应力的大小。该模型可进行放大以观察图案的精细细节，然后通过数字切片方式从各个维度观察其详细结构。观看本视频后，您将充分了解如何利用共聚焦成像技术构建在机械载荷作用下的生物结构的生理准确三维模型。在实施该操作过程中，需牢记这是一个线性弹性模型，而软骨并不完全表现为线性材料。其他材料特性（如渗透性）也可被纳入模型，但可能需要对网格进行进一步修改。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

建立有限元模型，研究斑马鱼下颌生物力学

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通过子代检测改变斑马鱼致死性骨骼突变体的外显率

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斑马鱼鳞片中细胞动态的体外培养技术

本文所述方案提供了一种简单且易于操作的方法，用于对5日龄斑马鱼幼鱼的颅面软骨进行染色和解剖。该方法可用于在不同发育条件下研究这些结构的解剖形态、形状和大小。...

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构建有限元模型以研究斑马鱼颌骨生物力学

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