利用腔室盖玻片模型可视化痰液对生物膜形成的影响

本实验的总体目标是观察并量化生物膜在痰液和抗生素作用下的变化。研究人员可利用该方法解答一些关键问题，例如痰液的存在如何影响不同抗生素对细菌生物膜的抗菌效果。该方法的主要优势在于能够直观地观察到生物膜在不同因素作用下所发生的变化。

开始实验时，记录先前获取的痰液样本的体积。加入磷酸盐缓冲液（PBS），加入量为样本体积的两倍。接着，使用移液管充分混匀样本。

将样品在最高转速下涡旋震荡一分钟，以充分混匀。取一毫升混合液分装至1.5毫升微量离心管中。然后离心沉淀管中物质。

离心后，保留上清液并弃去沉淀。使用0.22微米滤器对上清液进行过滤除菌，并收集到干净的微量离心管中。将痰液上清液于-80°C保存，以备后续使用。

将40微升先前制备的菌液加入4毫升新鲜的LB培养基（Luria broth）中，在600纳米波长下培养至光密度达到0.55。接着，取100微升OD值为0.5的菌液，加入400微升已制备的含10%痰滤液的LB培养基中进行稀释。取200微升该稀释菌液接种至载玻片培养腔的孔中。在37摄氏度下静置培养4小时，使细菌贴壁。

孵育四小时后，移除培养基，并用 1X 新鲜 LB 培养基轻轻冲洗生物膜。将剩余培养基替换为 200 微升新鲜 LB 培养基。在 37°C 条件下静置培养生物膜，每 12 小时更换一次培养基，无需冲洗，直至生物膜达到显微镜观察要求。清洗载玻片时动作务必轻柔，以避免破坏任何附着的细菌。

培养结束后，移除腔室孔中的培养基，并用 300 微升无菌 PBS 轻柔洗涤每个腔室两次。接着，配制生物膜染色液：根据所需溶液的体积，每毫升加入活性检测试剂盒中提供的各染料 1 微升，并混匀。每种生物体所需的染料最佳用量和染色时间需通过实验确定。

向玻璃培养小室的每个孔中加入 200 微升染色液。孵育盖玻片。孵育后，从各孔中移除染色液，并用 300 微升无菌 PBS 洗涤每个孔。

用新鲜培养基替换 PBS。最后，通过共聚焦显微镜进行观察。在腔室盖玻片中单独使用培养基或添加 10% 痰液滤液培养 48 小时后，伯克霍尔德菌胞变群（Burkholderia cepacia complex，BCC）临床分离株的代表性图像表明，这些成分的存在可改变生物膜的结构。

采用 Comstat 软件对图像进行分析，以获得关键的生物膜参数，包括生物膜的平均厚度，该参数在使用 10% 痰液处理后有所增加。为了评估不同因素对生物膜生长的影响，将临床分离株分别在仅含培养基、含痰液的培养基中培养，并进一步分为接受或不接受抗生素处理的组别。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在腔室盖玻片上形成和处理生物膜，并为其染色及共聚焦显微分析做好准备。