Name: 可视化痰生物膜发展影响使用腔室盖玻片型号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 了解如何使用腔室盖玻片模型可视化和量化痰液与抗生素对生物膜发育的影响。该方法支持实时观察生物膜变化并进行定量分析，有助于研究抗生素疗效及宿主因素对细菌生物膜的作用机制。

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TB 感谢加拿大囊性纤维化基金会提供的研究奖学金。

请注意，收集和储存人类受试者的痰液样本需经研究伦理委员会（REB）批准。本研究已获病童医院研究伦理委员会（REB#1000019444）批准。
1. 准备CF痰液样本
<ol>
	<li>在囊性纤维化门诊的常规就诊期间采集患者的痰液样本，并置于冰上保存。</li>
	<li>采集后一小时内将痰液样本冰上运输至研究实验室，进行后续处理。</li>
</ol>
2. 痰液处理
<ol>
	<li>记录所获取痰液样本的体积。加入磷酸盐缓冲液（PBS）至样本体积的2倍即， 2 份 PBS，1 份样品</li>
	<li>用移液管充分混匀样品。将样品在最高转速下涡旋振荡1分钟，以确保完全混匀。</li>
	<li>将上述混合物每1 ml分装至适量的1.5 ml微量离心管中，在4 °C、5,000 × g条件下离心20 min。</li>
	<li>离心后，移除上清液并弃去沉淀。</li>
	<li>通过0.22 µm滤器对上清液进行过滤除菌，并收集至洁净的微量离心管中。 
	注意：滤液的无菌性通过涂布于LB琼脂平板并接种液体培养基进行检测。</li>
	<li>将痰液上清液于 -80 °C 保存，以备后续使用。 
	注意：多名患者的痰液在过滤后也可进行混合。</li>
	<li>使用前，将痰液滤液用所需培养基按1/10（v/v）稀释（100 μl 痰液 + 900 μl 培养基）。 
	注意：此处使用了标准的溶菌肉汤（LB）培养基。</li>
</ol>
3. 生物膜形成的多室盖玻片法
<ol>
	<li>在所需培养基中，于37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养目标细菌分离株。 
	注意：使用了多种不同的细菌，包括临床分离株 铜绿假单胞菌, 金黄色葡萄球菌, 洋葱伯克霍尔德菌 复杂且 Achromobacter xylosoxidans 培养基的选择取决于所研究的菌株和条件，但初始实验可使用LB培养基。</li>
	<li>从过夜培养物中，取40 μl培养液加入4 ml新鲜培养基中，于37 °C振荡培养3–4小时（200 RPM），以获得在600 nm处光密度（OD600约为 0.5–0.6。</li>
	<li>将步骤3.2中的培养物用含10%痰滤液或不含痰滤液（作为对照）的目标培养基稀释至1/5。可测试其他浓度的痰滤液（即， 50% 或 100%</li>
	<li>使用200 μl稀释液接种至载玻片培养室的孔中。</li>
	<li>在37 °C下静置培养4小时，使细菌贴壁。</li>
	<li>4小时后，吸除培养基，用200 μl新鲜培养基轻轻冲洗生物膜，然后更换为200 μl新鲜培养基。 
	注意：为了研究痰液对生物膜的影响，新鲜培养基中应含有痰液上清液。</li>
	<li>在37 °C条件下静置培养生物膜，根据需要培养相应时间，每12小时更换一次培养基，直至显微镜观察前均不进行洗涤。 
	注意：为了研究痰液上清液对生物膜抗生素敏感性的影响，需在生物膜培养24小时后将抗生素加入培养基中，并在生物膜染色与成像前持续保留在培养基中。</li>
</ol>
4. 生物膜染色与共聚焦显微镜观察
<ol>
	<li>在合适的培养时间后（24–48 小时效果最佳），移除腔室孔中的培养基，并用 300 μl 无菌 PBS 轻柔地清洗每个腔室两次。</li>
	<li>通过将每毫升所需溶液中加入 1 µl 的每种染料（来自活性检测试剂盒）来配制用于生物膜染色的混合液。将染料溶于水或培养基溶液中。 
	注意：制造商建议使用水。</li>
	<li>向每个载玻片腔室孔中加入 200 µl 染色混合液，在室温下避光孵育 45 分钟。</li>
	<li>从腔室中移除染色液，并用 300 μl 无菌 PBS 清洗每个孔。移除 PBS 后，加入新鲜的水或培养基。</li>
	<li>通过共聚焦显微镜观察生物膜。</li>
</ol>
5. 使用共聚焦显微镜观察生物膜
<ol>
	<li>染色后立即（1小时内）读取载玻片上的生物膜。每次仅对1至2个8孔板进行染色，以尽量减少观察切片时的延迟。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜，配备激发激光器和采集用滤光片组进行成像。 
	注：此处使用配备光谱Borealis激光器的转盘共聚焦系统（绿色：491 nm，红色：561 nm）进行激发，采用515/40和624/40发射滤光片组来观察生物膜活性检测试剂盒的染色结果。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜配备相机及25倍水镜采集图像。</li>
	<li>使用Z轴堆栈（Z-Stacks）对生物膜进行建模。从生物膜首个清晰对焦平面开始，至最后一个清晰对焦平面结束，每隔0.5–1 μm采集一次图像（对于培养48小时的生物膜，通常覆盖30–80 μm范围）。</li>
	<li>从每个孔中采集3–5张图像。 
	注：因此，对于一个8孔腔室盖玻片，将生成24–40张图像。</li>
	<li>保存图像以供分析。 
	注：图像应保存为OME-TIFF格式，以便使用COMSTAT18,19进行分析。生物膜图像分析的操作说明可访问 http://www.comstat.dk/。导入图像后，可分析各通道（红色和绿色）的平均厚度、生物量和表面覆盖率等参数。</li>
</ol>

<ol><li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+biofilm+formation%3A+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.Infect.Dis.J%22%5BJournal%5D)">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giving+structure+to+the+biofilm+matrix%3A+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li>
<li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Microbial+coaggregation%3A+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation%3A+a+clinically+relevant+microbiological+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li>
<li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li>
<li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li>
<li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Adv%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).</li>
<li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Respir.Crit.Care+Med%22%5BJournal%5D)">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li>
<li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li>
<li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms
 . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVorregaard%2C+M+%22Informatics+and+Mathematical+Modelling%22">Informatics and Mathematical Modelling</a>. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).</li>
<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).</li>
</ol>

本文所述方法可用于可视化在存在外源性产物条件下生长的细菌生物膜。使用此类系统时，外源产物的生成具有重要意义，这一点并不意外。例如，二硫苏糖醇（DTT）常用于人痰液样本以促进样本液化。然而，单独使用 DTT 可能会降低生物膜的发育能力与活性（数据未显示）。因此，针对所有实验条件设置适当的对照组是必要的。此外，由于每位患者的痰液具有独特的微生物组，添加人痰液产物会为实验带来固有的变异性。为校正这一因素，我们采用混合痰液样本，以避免得到仅针对特定患者的实验结果。另外，在使用任何模型系统时，选择合适的培养基也至关重要。建议在系统初始建立时，使用目标生物体生物膜生长的标准培养基。如果实验目的是研究外源性产物如何影响生物膜形成，则推荐使用营养丰富的培养基，以支持充分的生物膜形成。这将确保生物体获得充足营养的同时，评估外源性因素对生物膜的影响。其他类型的培养基，如最低培养基或成分明确培养基，也可用于更好地模拟特定条件。在本系统中，其他培养基也已被成功使用（数据未显示）。生物膜在带腔室盖玻片上的附着较为牢固，但在更换或添加培养基以及对生物膜进行洗涤操作时，必须格外小心，以防止破坏生物膜结构。
按照...

细菌生物膜是由相互附着并包裹在自身分泌的基质中的一类微生物群体。1,2 传统上，它们表现为在流动条件下附着于非生物或生物表面的细菌。研究也发现，生物膜可在静态条件（无流动）下生长，并远离表面形成，例如在热池的气液界面或试管中形成的菌膜。这类生物膜在自然环境中早已被认知，对工业过程造成严重危害，因其可在水库或管道中形成，导致生物污垢、腐蚀和堵塞。3,4
生物膜在医疗环境中也至关重要，因其已被证实与导管相关感染、囊性纤维化患者的肺部感染以及其他多种感染有关。5,6 生物膜感染的一个显著特征是细菌对抗生素的敏感性降低，并且难以被先天免疫系统清除。7-9 最为深入研究且具有临床意义的生物膜感染情况出现在囊性纤维化（CF）患者中，这些患者长期感染铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜。P. aeruginosa 在建立慢性感染过程中可发生多种变化，使其极难治疗。10,11 生物膜可差异性地激活先天免疫并引发炎症反应。12-14 由于这些感染导致CF患者发病率和死亡率升高，因此深入了解在此背景下影响生物膜形成的各类因素至关重要。
最近一项研究表明，宿主因子在铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜聚集体的形成过程中起着关键作用15。这些生物膜会降低对抗生素和宿主防御机制的敏感性。来源于宿主的因子（如中性粒细胞弹性蛋白酶）以及囊性纤维化（CF）患者肺部共存微生物分泌的产物，均可能显著调控生物膜的形成与发展16。此外，生物膜还会与宿主相互作用，调节多种信号通路的表达并引发炎症反应。尽管高通量方法（如标准结晶紫染色法）可提供有关生物膜过程的部分信息，但对这些因子作用下生物膜的可视化观察则能提供更为深入的信息。
在本文中，我们描述了一种利用囊性纤维化（CF）患者痰液中的因子来研究生物膜形成的方法 体外 该方法利用商用生物膜活性检测试剂盒，可快速可视化含有宿主因子的痰液处理后的生物膜。该技术可用于直观识别外源性物质存在条件下生物膜生长过程中发生的变化，代表了一种改进的分析不同条件下生物膜发育变化的方法。

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II 培养皿盖玻片，#1.5 硼硅玻璃，8 孔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Live/Dead 生物膜活力检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>血琼脂平板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>通过菌落形成单位（CFU）计数确认活性，或挑选菌落用于接种</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>可在线获取的软件</td><td></td><td>COMSTAT 是用于分析生物膜图像的软件，可从 www.comstat.dk 获取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Miller's LB 肉汤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>用于过夜培养/生物膜生长的标准培养基</td></tr><tr><td>Millex-GV 注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>用于过滤痰液上清</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（Dulbecco A）</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>更换培养基后清洗生物膜培养腔</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Borealis</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>该软件使用说明可从以下网址获取：http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

利用腔室盖玻片模型可视化痰液对生物膜形成的影响

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

生物膜是由细菌群体及其自身分泌的基质包裹形成的结构。它们在工业污染以及多种与健康相关感染的发生和持续过程中发挥着重要作用。在人类疾病中，研究最为深入的生物膜之一是囊性纤维化患者慢性肺部感染中的生物膜。在宿主环境下研究生物膜时，多种宿主因素可能影响生物膜的形成与发展。为了明确宿主因素如何影响生物膜的形成与发育，我们采用静态腔室盖玻片法，在含有宿主来源物质（如痰液上清液）的条件下培养生物膜。将细菌接种至腔室内，并暴露于痰液滤过液中。经过48小时培养后，使用商用生物膜活性检测试剂盒对生物膜进行染色，随后进行共聚焦显微镜观察与分析。在获取图像后，可利用不同软件平台评估生物膜的特性。该方法使我们能够在包括抗生素在内的不同物质存在下，直观地观察生物膜生长的关键特性。

实验的整体设计如图1所示。本方案提供了一种便捷的方法，用于观察不同培养时间（例如，24、48 或 72 小时）下生物膜的变化。重要的是，可添加外源性信号分子（如痰液滤液），以观察其对生物膜发育过程的影响。如图2所示，10% 痰液滤液的存在可改变生物膜的结构（图2A，下方图示）16。这些图像可使用 COMSTAT 软件进行分析，以获得关键的生物膜参数，包括生物膜的平均厚度、总生物量和表面覆盖率。这体现在生物膜厚度的整体增加（图2B 和 图3）16。在痰液存在条件下抗生素对生物膜的影响如图3所示。通过直观观察生物膜发育过程中的变化，可以更深入地理解各种因素对生物膜生长的影响，其效果远优于传统的生物膜检测方法（如结晶紫染色法）。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

本方案描述了利用载玻片培养室模型，在暴露于宿主因子后对生物膜形成过程进行可视化观察的方法。该模型可实现对生物膜发育过程的直接观察，并可利用计算机软件对生物膜参数进行分析。

生物膜由被自身分泌的基质包裹的细菌群落组成。它们在工业污染以及……中起着重要作用。

本实验的总体目标是观察并量化生物膜在痰液和抗生素作用下的变化。研究人员可利用该方法解答一些关键问题，例如痰液的存在如何影响不同抗生素对细菌生物膜的抗菌效果。该方法的主要优势在于能够使研究者直观地观察到生物膜在不同因素作用下所发生的变化。实验开始时，记录先前获得的痰液样本体积。加入磷酸盐缓冲液（PBS），加入量为样本体积的两倍。接着，使用移液管充分混匀样本。将样品在最高转速下涡旋震荡一分钟，以充分混匀。取一毫升混合液分装至1.5毫升微量离心管中。然后离心沉淀管中物质。离心后，保留上清液并弃去沉淀。使用0.22微米滤器对上清液进行过滤除菌，并收集到干净的微量离心管中。将痰液上清液于-80°C保存，以备后续使用。将40微升预先制备的菌液加入4毫升新鲜的LB培养基（Luria肉汤）中，培养细菌至其在600纳米处的光密度达到0.55。接着，将100微升OD值为0.5的菌液加入400微升已制备的含10%痰液滤液的LB培养基中进行稀释。取200微升该稀释菌液接种到载玻片培养腔的孔中。在37摄氏度下静置培养4小时，使细菌贴壁附着。孵育四小时后，移除培养基，并用 1X 新鲜 LB 培养基轻轻冲洗生物膜。将剩余培养基替换为 200 微升新鲜 LB 培养基。在 37 摄氏度条件下静置培养生物膜。每 12 小时更换一次培养基，无需冲洗，直至生物膜准备好进行显微镜观察。非常重要的是，冲洗载玻片时必须轻柔，以免破坏已附着的细菌。培养后，从培养 chamber 的孔中移除培养基，并用 300 µL 无菌 PBS 轻柔洗涤每个 chamber 两次。接着，为配制生物膜染色混合液，根据所需溶液每 1 mL 加入活性检测试剂盒中提供的各 1 µL 染料，并充分混匀。每种生物体所需的最佳染料用量和染色时间需通过实验确定。向玻璃培养小室的每个孔中加入 200 µL 染色液。孵育盖玻片。孵育结束后，从各孔中移除染色液，并用 300 µL 无菌 PBS 洗涤每个孔。用新鲜培养基替换PBS。最后，通过共聚焦显微镜进行观察。在腔室盖玻片中单独使用培养基或添加10%痰液滤液培养48小时后，伯克霍尔德菌胞群复合体（Burkholderia cepacia complex，BCC）临床分离株的代表性图像显示，痰液滤液的存在可改变生物膜的结构。使用 Comstat 软件对图像进行分析，以获得关键的生物膜参数，包括生物膜的平均厚度，该参数在使用 10% 痰液处理后有所增加。为了评估不同因素对生物膜生长的影响，将临床分离株在仅含培养基或含痰液的培养基中培养，并分别接受或不接受抗生素处理。观看本视频后，您应能充分理解如何在腔室盖玻片上形成和处理生物膜，并为其染色及共聚焦分析做好准备。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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WinCF 模型——一种经济且易于操作的黏液阻塞细支气管微环境系统，用于研究肺部感染的微生物学

本方案描述了使用可定制的自动化微流控装置来观察生物膜形成的实验方法 Candida albicans...

生物膜形成的可视化 白色念珠菌 使用自动化微流控装置

我们描述了一种用于在流动条件下实时成像真菌生物膜形成的流动装置的组装、操作和清洗方法。同时，我们还提供并讨论了用于分析所获取图像的定量算法。...

利用双相循环流动系统对真菌生物膜发育进行实时成像与定量分析

抗菌剂诱导的变化 铜绿假单胞菌 不同临床分离株在囊性纤维化及慢性肺部感染患者培养物中的生物膜结构存在差异。经共聚焦显微镜观察后，可利用 COMSTAT...

量化抗菌剂的影响 体外 使用 COMSTAT 软件分析生物膜结构

了解如何使用腔室盖玻片模型可视化和量化痰液与抗生素对生物膜发育的影响。该方法支持实时观察生物膜变化并进行定量分析，有助于研究抗生素疗效及宿主因素对细菌生物膜的作用机制。

利用腔室盖玻片模型可视化痰液对生物膜形成的影响

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