利用腔室盖玻片模型可视化痰液对生物膜形成的影响

本实验的总体目标是观察并量化生物膜在痰液和抗生素作用下的变化。研究人员可利用该方法解答一些关键问题，例如痰液的存在如何影响不同抗生素对细菌生物膜的抗菌效果。该方法的主要优势在于能够使研究者直观地观察到生物膜在不同因素作用下所发生的变化。

实验开始时，记录先前获得的痰液样本体积。加入磷酸盐缓冲液（PBS），加入量为样本体积的两倍。接着，使用移液管充分混匀样本。

将样品在最高转速下涡旋震荡一分钟，以充分混匀。取一毫升混合液分装至1.5毫升微量离心管中。然后离心沉淀管中物质。

离心后，保留上清液并弃去沉淀。使用0.22微米滤器对上清液进行过滤除菌，并收集到干净的微量离心管中。将痰液上清液于-80°C保存，以备后续使用。

将40微升预先制备的菌液加入4毫升新鲜的LB培养基（Luria肉汤）中，培养细菌至其在600纳米处的光密度达到0.55。接着，将100微升OD值为0.5的菌液加入400微升已制备的含10%痰液滤液的LB培养基中进行稀释。取200微升该稀释菌液接种到载玻片培养腔的孔中。在37摄氏度下静置培养4小时，使细菌贴壁附着。

孵育四小时后，移除培养基，并用 1X 新鲜 LB 培养基轻轻冲洗生物膜。将剩余培养基替换为 200 微升新鲜 LB 培养基。在 37 摄氏度条件下静置培养生物膜。每 12 小时更换一次培养基，无需冲洗，直至生物膜准备好进行显微镜观察。非常重要的是，冲洗载玻片时必须轻柔，以免破坏已附着的细菌。

培养后，从培养 chamber 的孔中移除培养基，并用 300 µL 无菌 PBS 轻柔洗涤每个 chamber 两次。接着，为配制生物膜染色混合液，根据所需溶液每 1 mL 加入活性检测试剂盒中提供的各 1 µL 染料，并充分混匀。每种生物体所需的最佳染料用量和染色时间需通过实验确定。

向玻璃培养小室的每个孔中加入 200 µL 染色液。孵育盖玻片。孵育结束后，从各孔中移除染色液，并用 300 µL 无菌 PBS 洗涤每个孔。

用新鲜培养基替换PBS。最后，通过共聚焦显微镜进行观察。在腔室盖玻片中单独使用培养基或添加10%痰液滤液培养48小时后，伯克霍尔德菌胞群复合体（Burkholderia cepacia complex，BCC）临床分离株的代表性图像显示，痰液滤液的存在可改变生物膜的结构。

使用 Comstat 软件对图像进行分析，以获得关键的生物膜参数，包括生物膜的平均厚度，该参数在使用 10% 痰液处理后有所增加。为了评估不同因素对生物膜生长的影响，将临床分离株在仅含培养基或含痰液的培养基中培养，并分别接受或不接受抗生素处理。观看本视频后，您应能充分理解如何在腔室盖玻片上形成和处理生物膜，并为其染色及共聚焦分析做好准备。