可视化斑马鱼肾间组织类固醇生成组织及其血管微环境

本实验的总体目标是通过一种简单的整体酶活性检测方法，检测发育中斑马鱼体内的分化间肾类固醇生成细胞。该染色方法有助于解答有关间肾腺形成与发育异常的分子和细胞机制的关键问题。该染色检测的主要优势在于其快速、简便且可靠，使其成为斑马鱼遗传学或化学筛选中的有力工具。

该操作可用于标记肾脏和血管的转基因荧光报告基因品系，从而能够分析同一胚胎中的多种组织。结合振动切片、免疫组织化学和共聚焦显微镜技术，还可对间肾组织的血管微环境进行可视化观察。根据文本方案配制三种β-Hsd活性染色的储备溶液后，将发育中的斑马鱼胚胎置于含0.03% PTU的养鱼用水中，以抑制色素形成。

用含 0.1% Tween 20 的 2% 或 4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液（即 PFAT）固定去壳胚胎或幼虫。用 PBST 洗涤胚胎，每次 10 分钟，共洗涤四次，确保样品在洗涤间隙不干燥。在染色反应前，分别在不同的离心管中新鲜配制 A 液和 B 液，然后涡旋振荡并离心处理溶液。

必须在不同的试管中分别配制A部分和B部分。若将所有组分直接加入同一试管中，会立即产生严重沉淀。将A部分整管内容加入B部分整管中，充分混匀，并立即取一毫升分装至每个含有固定并洗涤过的胚胎的微量离心管中。

用铝箔包裹试管，并将其置于室温下的旋转仪或摇床上，轻轻振荡。通过显微镜观察显色信号，凭经验确定反应时间。随着时间推移，可能会出现轻微沉淀，但不会干扰反应过程。

使用 PBST 洗涤胚胎 4 次，每次 10 分钟，以终止反应，然后在室温下用 4% PFAT 对染色后的胚胎进行后固定，持续 60 分钟。对于整体封片显微观察，使用含 50% 甘油的 PBS 透明胚胎。随后，将胚胎背侧朝上定位，利用正置显微镜在明场照明下观察样品。

去除胚胎的卵黄，利用胚胎制备平铺装片。随后，拍摄肾间组织形态的高分辨率图像。为了分析类固醇生成组织的血管微环境，使用2%PFA对染色后的胚胎进行后固定。

在4°C条件下加入1%Triton X-100孵育一小时，并用PBST-X在室温下洗涤胚胎四次，每次10分钟。为包埋胚胎，通过在95°C条件下将琼脂糖溶解于PBS中制备4%低熔点琼脂糖。然后分装至微量离心管中，于4至8°C保存。

将4%低熔点琼脂糖 aliquot 在70摄氏度下加热融化10分钟，随后保持在47摄氏度。使用一个1.5毫升微量离心管的离心管盖作为模具，将胚胎包埋于熔化的琼脂糖中，并冷却至凝固。为进行振动切片，将一片纸胶带粘附在振动切片机干燥的平台上。

然后，使用刀片将凝固的琼脂糖块从模具中取出。在平台的纸胶带上涂抹瞬间胶，将琼脂糖块固定在纸胶带上，使样品的腹侧朝上。接着，将琼脂糖块修整成梯形棱柱状，上下两个面的每一边长约4至8毫米。

使用滴管吸取含0.5% Triton X-100的冷PBS冲洗琼脂糖块。然后根据制造商说明书，使用振动切片机制备100微米厚的切片。用26号针头将切下的组织片从振动切片机中取出，转移至多孔板中，每孔加入500微升含0.5% Triton X-100的冷PBST。

在解剖显微镜下检查，收集三份β-Hsd活性呈阳性的组织切片，并使用移液器吸头将切片转移至含有冷的0.5% PBST-X的96孔板中。随后根据正文中的实验方案对切片进行进一步染色和成像。为了确定类固醇生成性的间肾组织如何与前肾肾小球及其初生血管系统共同发育，在双转基因斑马鱼胚胎中进行了β-Hsd酶活性检测，该胚胎同时表达肾脏特异性和内皮特异性荧光蛋白。

如图所示，三处β-Hsd阳性的类固醇生成组织位于中线右侧，并紧邻前肾肾小球。部分类固醇生成细胞也开始跨过中线迁移。这些来自表达内皮GFP的转基因胚胎的振动切片经β-Hsd染色后，通过免疫组织化学方法分析纤维连接蛋白及其下游效应分子——磷酸化黏着斑激酶的表达情况。

纤维连接蛋白在背主动脉周围区域的沉积对于支持间肾血管的生长至关重要。对于鱼类胚胎或幼体，如果操作得当，整体组织化学染色可在一天内完成。尽管该染色方法简单快速，但需要牢记的是，它仅能检测类固醇合成途径中的单一酶。

若需对间质肾组织进行发育分析，除本实验外，还需进行原位杂交，以检测参与类固醇生成的其他关键基因的表达。