可视化Interrenal类固醇合成组织及其血管微环境斑马鱼
December 21st, 2016
在斑马鱼的interrenal腺是哺乳动物的肾上腺的硬骨鱼类的对应。此协议引入了如何执行3-β羟基类固醇脱氢酶（Δ5-4异构酶;3β-HSD）的酶活性测定法，其检测在显影斑马鱼分化类固醇合成的细胞。
该程序的总体目标是通过简单的整装酶活性测定检测发育中的斑马鱼中分化的肾内类固醇生成细胞。这种染色程序可以帮助回答有关肾间腺形成和畸形的分子和细胞机制的关键问题。这种染色测定的主要优点是快速、简单、可靠，使其成为斑马鱼遗传或化学筛选的有力工具。
该程序可以在转基因荧光报告基因系上进行，标记肾脏和血管，以便可以分析同一胚胎中的多个组织。结合振动切片机切片、免疫组化和共聚焦显微镜检查，还可以可视化肾间组织的血管微环境。根据文本方案制备用于三种 β-Hsd 活性染色的储备溶液后，将发育中的斑马鱼胚胎置于鸡蛋水中的 0.03% PTU 中以抑制色素形成。
将去绒毛膜的胚胎或幼虫固定在含 0.1% 吐温 20 或 PFAT 的 PBS 中的 2% 或 4% PFA 中。使用 PBST，将胚胎洗涤 4 次，每次 10 分钟，确保样品在两次洗涤之间不会变干。在染色反应之前，在单独的试管中新鲜制备 A 和 B 部分，然后涡旋并离心溶液。
必须在单独的试管中准备 A 和 B 部分。将所有组分直接添加到一根管中会立即导致严重沉淀。将 A 部分的整管加入 B 部分的整管中，充分混合，并立即将 1 毫升分配到每个包含固定和洗涤胚胎的微量离心管中。
使用铝箔包裹管子，并在室温下将它们放在旋转器或摇摆平台上，轻轻摇晃。通过使用显微镜监测显色信号来经验性地确定反应时间。随着时间的推移，会产生轻微的沉淀，但不会干扰反应过程。
使用 PBST 洗涤胚胎 4 次，每次 10 分钟，然后在室温下用 4% PFAT 后固定染色的胚胎 60 分钟，以终止反应。对于整体显微镜检查，使用 PBS 中的 50% 甘油清除胚胎。然后，将它们的背面朝上定向后，在明场照明下使用正置显微镜观察样品。
将胚胎去蛋黄，然后用它来准备一个平面支架。然后，捕获肾内组织形态的高分辨率图像。为了分析类固醇生成组织的血管微环境，用 2% PFA 后固定染色的胚胎。
在 4 摄氏度下补充 1% Triton X-100 1 小时，并使用 PBST-X 在室温下洗涤胚胎 4 次，每次 10 分钟。要包埋胚胎，通过在 4 摄氏度下将琼脂糖溶解在 PBS 中来制备 95% 低熔点琼脂糖。然后，分装在微量离心管中，并在 4 至 8 摄氏度下储存。
将4% 低熔点琼脂糖的等分试样在 70 摄氏度下熔化 10 分钟，然后将等分试样保持在 47 摄氏度。使用 1.5% mlml 微量离心管上脱落的盖子作为模具，将胚胎嵌入熔融琼脂糖中，并使其冷却至凝固。要进行振动切片机切片，请将一条纸带粘在振动切片机的干燥平台上。
然后，使用剃须刀片从模具中取出硬化的琼脂糖块。将强力胶涂在平台上的纸带上，并将琼脂糖块固定在纸带上，样品的前侧朝上。接下来，将琼脂糖块修剪成梯形棱柱形状，上下刻面的每一侧分别约为 4 至 8 毫米。
使用装满 0.5% Trident X-100 的冷 PBS 的滴管冲洗琼脂糖块。然后，根据制造商的说明使用振动切片机准备 100 微米切片。用 26 号针头，从振动切片机上取下切块，并将它们转移到每孔含有 500 微升冷 0.5% PBST-X 的点板上。
通过在解剖显微镜下检查收集三个 β-Hsd 活性阳性组织切片，并使用移液器吸头将切片转移到含有冷 0.5% PBST-X 的 96 孔板中。根据文本协议对切片进行进一步染色和成像。为了确定产类固醇的肾内组织如何与肾前肾小球及其新生脉管系统共同发育，对双转基因斑马鱼胚胎进行了三种 β-Hsd 酶活性测定，同时表达肾脏特异性和内皮特异性荧光。
如图所示，三个 β-Hsd 阳性类固醇生成组织位于中线右侧，并立即附着在肾前肾小球。一些类固醇生成细胞也开始越过中线迁移。通过免疫组织化学分析这些来自表达内皮 GFP 的转基因胚胎的振动切片，经得上 3 个 beta-Hsd 测定，以检测纤连蛋白及其下游效应子磷酸化黏着斑激酶。
纤连蛋白的背侧主动脉周围沉积对于支持肾间血管生长至关重要。对于鱼胚胎或幼虫，如果作得当，可以在一天内完成整装组织化学染色。虽然这种染色方法简单快速，但重要的是要记住，它只检测类固醇生成途径的一种酶。
如果旨在对肾内组织进行发育分析，除了该测定外，还必须进行原位驯化以检测参与类固醇生成的其他关键基因的表达。
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概览
该协议描述了一种方法，用于使用整体酶活性测定检测发育中斑马鱼中分化的肾上腺皮质类固醇生成细胞。这种技术对于研究肾上腺皮质腺体的形成和畸形非常有价值。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 内分泌学
背景
- 斑马鱼的肾上腺皮质腺体类似于哺乳动物的肾上腺腺体。
- 理解肾上腺皮质腺体对于洞察类固醇生成至关重要。
- 该测定允许在发育过程中可视化类固醇生成细胞。
- 它可以应用于转基因系进行增强分析。
研究目的
- 检测斑马鱼中分化的类固醇生成细胞。
- 研究肾上腺皮质腺体发育的分子机制。
- 提供一种可靠的方法用于基因和化学筛选。
使用的方法
- 用于3-β-羟基类固醇脱氢酶的整体酶活性测定。
- 使用0.03% PTU抑制胚胎中色素形成。
- 与振动切片和免疫组织化学相结合。
- 使用共聚焦显微镜观察血管微环境。
主要结果
- 成功检测到分化的肾上腺皮质类固醇生成细胞。
- 证明了快速和可靠的染色程序。
- 能够分析同一胚胎中的多个组织。
- 对肾上腺皮质组织的血管微环境有了洞察。
结论
- 该测定是研究肾上腺皮质腺体发育的有力工具。
- 它促进了对类固醇生成的遗传和化学影响的探索。
- 这种方法增强了我们对脊椎动物内分泌系统形成的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This enzymatic activity assay enables rapid visualization of steroidogenic tissue in zebrafish embryos, supporting early-stage target validation in endocrine pathway research. By detecting 3β-Hsd activity without reliance on antibodies, the method provides a reliable readout for mechanistic de-risking of compounds affecting steroidogenesis. Its compatibility with transgenic reporter lines and vascular microenvironment analysis enhances predictive confidence in preclinical safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of steroidogenic tissue differentiation through direct enzyme activity detection.
- Operational Value: Provides antibody-independent readout for target engagement in zebrafish-based mutant or chemical screens.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of genetic or chemical disruptions in the steroidogenic pathway.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chromogenic readout correlating with 3β-Hsd enzymatic activity in intact tissues.
- Operational Value: Compatible with whole-mount imaging and sectioning for multiplexed tissue analysis in single embryos.
- Scalability: Rapid staining procedure allows integration into high-throughput screening workflows for endocrine disruptor detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Permits co-localization of steroidogenic tissue with vascular markers to assess microenvironmental influences on hormone production.
- Operational Value: Enables sequential staining for enzyme activity followed by immunohistochemistry to map fibronectin and phosphorylated FAK in vascular niches.
- Translational Relevance: Models interrenal-adrenal axis conservation, supporting cross-species extrapolation of steroidogenesis findings.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows where functional readouts of endocrine tissue maturation are required prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports interrogation of steroidogenic lineage specification and tissue morphogenesis in vivo.
- Screening: Delivers enzyme-based phenotypic readout suitable for compound library screening in zebrafish.
- Analytics: Generates spatially resolved activity maps that can be co-registered with vascular or glomerular markers.
- Translational Research: Enables analysis of tissue-stromal interactions critical for endocrine tissue maturation and vascular support.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for developmental endocrinology and toxicology applications across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in steroidogenic tissue identification through direct enzymatic detection.
- Operational Value: Standardizes whole-mount staining across laboratories using defined reagent preparation and reaction timing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early biomarker of pathway disruption in vertebrate models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on steroidogenic tissue integrity and vascular niche formation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, fixation, and whole-mount staining techniques.
- Dependent on access to vibratory microtome, confocal microscopy, and immunohistochemistry infrastructure for vascular analysis.
- Necessitates standardization of reaction timing and chromogenic development across batches for reproducible quantification.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of permeability and staining conditions.
- Limitation: Detects only one enzymatic step (3β-Hsd) in the steroidogenic pathway, necessitating complementary assays for full pathway assessment.
