Name: 开发和鉴定人的中性粒细胞源性巨噬细胞新型亚群体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学习从人中性粒细胞体外培养巨型吞噬细胞的方法，用于研究其在炎症免疫反应中的作用。该技术有助于探索免疫细胞活化与可塑性，为细胞生物学和免疫学研究提供新工具。

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作者感谢 Edith Suss-Toby 博士在共聚焦显微镜研究中提供的宝贵帮助。本研究由移民吸收部及高等教育委员会规划与预算委员会在 KAMEA 项目框架下提供资助（LD 和 AP）。我们还衷心感谢 Lady Davis 基金会博士后研究奖学金（OR）对本研究的支持。

该方案已根据《赫尔辛基宣言》获得当地人类伦理委员会批准，所有参与者均签署了知情同意书。
1. 中性粒细胞的分离及在培养中诱导粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Gϕ）的生成
注意：所有步骤均须在生物安全超净工作台中使用无菌组织级无脂多糖（LPS）溶液进行。请勿向罗斯韦尔·帕克纪念研究所（RPMI）-1640 培养基中添加抗生素、细胞因子或生长因子。
<ol>
	<li>从年轻健康成人处使用无菌头皮静脉采血套装采集至少 40 ml 静脉血。将血液抽入含有乙二胺四乙酸 K 的真空采血管中。3 盐（K3EDTA）并轻轻混匀。将血液置于室温下保存。</li>
	<li>使用密度分别为1.119 g/ml和1.077 g/ml的多蔗糖溶液，通过两步不连续密度梯度离心法分离中性粒细胞。使用前将溶液恢复至室温。 
	注意：离心过程中，红细胞（RBCs）会被聚蔗糖聚集并快速沉淀。单个核细胞（单核细胞/淋巴细胞）位于上层血浆与聚蔗糖-1,077 的界面之间，而中性粒细胞则位于红细胞上方，处于聚蔗糖-1,077 与 1,119 的界面处（参见 图2该方法可从同一个体中同时分离单个核细胞和中性粒细胞。</li>
</ol>
<img alt="血细胞分离、离心示意图；多聚蔗糖梯度、血浆、单个核细胞层。" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：从人全血中分离中性粒细胞。 将密度为 1.077 g/ml 的多聚蔗糖小心地铺在密度为 1.119 g/ml 的多聚蔗糖上方，形成不连续梯度。然后将稀释后的全血铺在 1.077 g/ml 多聚蔗糖上方。立即将离心管在室温下以 700 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。可见三个明显的条带：（A）单个核细胞，（B）多形核细胞（PMN），以及（C）位于离心管底部的红细胞（RBC）。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>向一个50 ml无菌聚丙烯圆锥形离心管底部加入12 ml 聚蔗糖-1119。</li>
	<li>小心地将12 ml的聚蔗糖-1077叠加到聚蔗糖-1119上。</li>
	<li>将10–12 ml全血用含2%热灭活胎牛血清（HI-FCS）的无离子磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至终体积24 ml。将24 ml稀释后的全血小心地铺加到离心管上层梯度液表面。</li>
	<li>在室温（20 - 24 °C) 无刹车装置。 
	注意：较低温度下离心可能导致细胞结块和回收率降低。</li>
	<li>小心地从离心机中取出试管，避免扰动密度梯度。应观察到两个不透明的层（A：单个核细胞和B：中性粒细胞，如图所示） 图2).</li>
	<li>吸弃层A上方0.5 cm处的液体。将此层的细胞转移（或弃去）至标记为“单个核”的试管中。</li>
	<li>吸弃并移除B层上方0.5 cm处的剩余液体。将该层中的细胞转移至标记为“PMN”的离心管中。</li>
	<li>合并每两个梯度管中的PMN，用含2% HI-FCS的PBS洗涤至终体积30 ml。200 × g离心12分钟，弃去上清液。</li>
	<li>为去除污染的红细胞（RBC），在冰上用1 ml无菌移液枪头轻轻吹打重悬沉淀，同时加入3 ml冰冷的0.2%低渗无菌NaCl溶液，冰上静置30秒。</li>
	<li>30秒后，向管中加入3 ml无菌的冰冻1.6% NaCl溶液，恢复等渗状态。</li>
	<li>向6 ml等渗盐水中加入6 ml预热（37 °CRPMI-1640 培养基中添加 2% HI-FCS，250 × g 离心 12 分钟，弃上清液。中性粒细胞沉淀应无红细胞污染。 
	注意：若被红细胞污染，中性粒细胞沉淀呈红色。</li>
	<li>如果仍有部分污染的红细胞残留，请重复步骤9和10一次。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于4 ml RPMI-1640培养基中，该培养基需添加10%热灭活胎牛血清，使用台盼蓝排斥法计数细胞，以确定细胞浓度和活力。</li>
	<li>调整浓度至 1.25 - 1.5 x 106 PMN/ml（根据实验需求），每孔接种1.0 mL至24孔板中。 
	注意：通过瑞氏-吉姆萨染色和光学显微镜评估，粒细胞群体中中性粒细胞的纯度始终超过95%。</li>
	<li>接种后，将细胞置于 加湿的5% CO₂2 孵育箱于 37 °C.</li>
	<li>每3天更换一次培养基，轻轻吸出一半培养基，加入等体积的新鲜RPMI-1640培养基，其中添加10% HI-FCS。使用无LPS的溶液和化合物，并确保HI-FCS中的LPS水平较低（≤0.05 ng/ml）。 
	注意：轻柔更换培养基至关重要，因为培养过程中形成的Gϕ并未牢固贴附于培养皿上，剧烈洗涤可能导致正在发育的细胞被冲走。Gϕ的出现通常在PMN培养后3 - 4天可见，具体时间取决于血液供体。本文所述的大多数分析和检测均在培养第6 - 7天进行，此时Gϕ体积显著增大。需注意，在RPMI-1640培养基中添加1 - 10 ng/ml LPS对Gϕ在培养过程中的发育无显著影响。14</li>
</ol>
2. 共聚焦激光扫描显微镜
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>从新分离的中性粒细胞以及第7天发育的Gϕ培养物（按第1节方法制备）制备细胞离心涂片16。 
	注意：为增加培养皿中Gϕ的浓度以进行各种分析，轻轻移除一半培养基。通过光学显微镜检查去除的培养基，确保其中未检测到Gϕ。然后，用移液器剧烈吹打剩余培养基，以去除轻度贴壁的Gϕ。将培养基在200 × g条件下离心10分钟，并将沉淀重悬于100 - 120 µl培养基中。
	<ol>
		<li>每张载玻片使用含细胞的100 - 120 µl培养基。为每种处理条件制备双份或三份重复样本。在84 × g条件下离心7分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将离心后的细胞干燥，并在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟（在通风橱中操作）。用PBS洗涤3次（每次约100 µl，每次数秒）。如需进行胞内染色，使用含0.5% Triton X-100的PBS在室温下通透细胞10分钟，随后用PBS洗涤5次。 
	注意：在所有步骤中，应使用适量的缓冲液/溶液以覆盖载玻片上细胞的整个区域。可使用疏水屏障笔划定细胞区域。 
	警示：多聚甲醛具有毒性，避免接触皮肤和眼睛。请佩戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>用含10%正常山羊血清的RPMI-1640培养基封闭细胞，4 ºC过夜或室温孵育40分钟。随后用PBS洗涤。</li>
	<li>加入单克隆抗体（Ab）或小鼠与兔源一抗（Abs）的组合，按1:100稀释（约100 µl），4 °C孵育过夜（18 - 20小时）。 
	注意：本实验中使用的小鼠单克隆抗体包括：抗CD14、抗CD63、抗CD66b、抗CD1c、抗CD15以及抗细胞色素b-245轻链（p22-phox鉴定）。兔多克隆抗体包括：抗CD68、抗CD36、抗LC3B、抗髓过氧化物酶、抗中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）以及抗Nox2/gp91-phox抗体。同型对照抗体包括纯化的小鼠IgG1和IgG2以及兔IgG。请根据制造商说明书配制抗体，并使用适当体积（约100 µl）覆盖细胞区域。</li>
	<li>洗涤细胞后，加入1/400稀释的Cy2-CF（488A）标记的山羊抗兔IgG（绿色）和/或Cy5（CF 647）标记的山羊抗小鼠IgG（红色）二抗，在室温下避光孵育40分钟。 
	注意：请根据制造商说明书稀释和配制抗体。</li>
	<li>洗涤后，每张载玻片滴加一滴含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂用于细胞核染色，立即加盖盖玻片。</li>
	<li>使用共聚焦激光扫描系统配合荧光显微镜及Plan Apo 40X油镜物镜观察载玻片。建议在制片后30分钟至2小时内完成成像分析，或于4 °C避光保存过夜。
	<ol>
		<li>使用图像分析软件（例如 Image J）计算细胞面积和荧光强度。对于共定位分析，采用Manders重叠系数（MOC）17进行定量。 
		注意：仅MOC >0.6的细胞可被视为具有显著共定位。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 中性粒细胞跨内皮细胞迁移：IL-8对巨大吞噬细胞（Gϕ）形成的影响
注意：细胞跨膜迁移实验应使用24孔可渗透细胞培养小室。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>在插入物的上室中加入150 µl浓度为50 µg/ml的纤维连接蛋白，室温孵育30分钟。</li>
	<li>在上室中加入5 × 104个EA.hy926内皮细胞/孔，重悬于150 µl配制好的杜尔贝科改良伊格尔培养基（完全生长培养基）中。 
	注意：使用前应确保内皮细胞单层达到融合状态。</li>
	<li>向下室中加入700 µL完全生长培养基。</li>
	<li>将可渗透的细胞培养插入物放入多孔板支架中，在37 °C、5% CO2条件下培养EA.hy926内皮细胞2天。 
	注意：同时，在第2天平行准备新鲜的中性粒细胞（PMN）（见第1节描述）。</li>
	<li>培养2天后，更换插入物上室和下室中的培养基。
	<ol>
		<li>向下室中加入含10%灭活人胎牛血清（IH-FCS）和白细胞介素（IL）-8的RPMI-1640培养基，IL-8终浓度为50 nM/ml。对照组下室中不添加IL-8。</li>
		<li>向上室中每孔加入106个新鲜PMN，重悬于100 µl含10% IH-FCS的RPMI-1640培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将多孔板支架置于37 °C、5% CO2条件下孵育90分钟。</li>
	<li>孵育90分钟后，分别收集上室和下室中的细胞，并对各亚群进行计数。以所加总细胞数为基准，计算各室中细胞所占百分比。 
	注意：用移液器轻柔吹打上室细胞以避免刮除内皮细胞，并将细胞转移至无菌离心管中；通过移液并用500 µl培养基冲洗下室的方式收集下室细胞，转移至另一无菌离心管中。</li>
	<li>合并多个孔中发生跨膜迁移（下室）和未迁移（上室）的PMN组分，每组取106个细胞，在无生长因子条件下培养7天，具体操作见第1节步骤14–16。</li>
	<li>将细胞离心涂片至载玻片上16，并按照第2节所述方法，通过共聚焦显微镜分析不同培养条件下所形成的细胞。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

巨大吞噬细胞（Gϕ）是一类新定义的来源于中性粒细胞的细胞亚群，表达CD66b/CD15/CD63/MPO/NE等基本且特异的中性粒细胞标志物。这类来源于中性粒细胞的吞噬细胞此前在文献中尚未被描述。与寿命较短并发生凋亡的中性粒细胞不同，Gϕ呈Annexin-V阴性，并具有较长的生命周期。然而，与中性粒细胞相似的是，Gϕ也能内吞颗粒物质，并在颗粒刺激或PMA刺激下产生活性氧（ROS），该过程依赖于NADPH氧化酶。但Gϕ内吞氧化型低密度脂蛋白（OxLDL）并随之产生ROS的能力，是其独有的特征14。
已发现多种因素会影响它们在培养过程中的发育。培养基中缺乏外源性细胞因子或生长因子至关重要（特别是GM-CSF/IL-4）。然而，中性粒细胞向IL-8的迁移能力被证明是区分能否发育为Gϕ细胞的关键因素。此外，吞噬凋亡中性粒细胞来源的碎片、自噬相关蛋白（LC3B）的表达以及功能性NADPH氧化酶的存在，均被证实对其发育至关重要，因为抑制这些过程会阻止Gϕ细胞的形成。图1）。显然，这些由中性粒细胞形成的巨细胞的发育过程不同于单核细胞/巨噬细胞系巨细胞形成的特征。后者与多种慢性炎症性疾病相关的多核巨细胞形成。,20,21 而本文所述的嗜中性Gϕ通过自噬作用发育，吞噬细胞残余物，并在整个发育过程中主要保持单核状态。14 （然而极少数情况下，有时可观察到第二个细胞核）。此外，多项对照实验验证了其嗜中性粒细胞来源：（1）表达特异性嗜中性粒细胞标志物，且不表达树突状细胞和单核细胞谱系标志物；（2）在单核细胞/中性粒细胞共培养体系中其发育受到抑制；（3）在培养中其运动模式与巨噬细胞不同（通过活细胞成像和延时显微镜观察证实）。14 (4) 它们对塑料培养皿的轻度贴壁性，以及 (5) 它们起源于纯CD15+/CD14- 通过流式细胞术获取中性粒细胞。
一些已鉴定的功能 体外 可能为我们揭示其潜在功能提供线索 体内例如，Gϕ 消耗大量中性粒细胞颗粒和碎片的能力、大空泡的存在，以及 LC3B 的表达——一种自噬相关蛋白，可通过与天然免疫信号通路的调节性相互作用来减轻炎症反应，22 - 均支持其具有清除能力。因此，这些发现还表明，Gϕ 可能在单核吞噬细胞/树突状细胞（Mϕ/DC）系统功能不足或不堪重负的炎症部位发挥作用，从而促进炎症的消退。这一观点可能得到以下事实的支持：在单核细胞与中性粒细胞的混合培养体系中，Gϕ 的发育受到抑制。14 此外，由于Gϕ表达oxLDL清道夫受体（CD36、CD68），可内化oxLDL并对其产生ROS，这可能表明其参与动脉粥样硬化过程以缓解炎症。由于Gϕ仅由向IL-8迁移的中性粒细胞发育而来，而中性粒细胞向IL-8方向穿越内皮单层的跨膜迁移代表了中性粒细胞向急性炎症部位的募集，该发现也可能支持Gϕ具有抗炎功能。相反，Gϕ在某些炎症条件下的表现可能使其释放颗粒成分和ROS，从而促进持续性炎症和组织损伤。20 然而，总体而言，它们的自噬能力表明，Gϕ可能参与减弱炎症反应，而非持续促进炎症反应。
有趣的是，我们最近在人类动脉粥样硬化斑块中鉴定出了Gϕ的存在（正在准备中）。然而，仍有大量问题有待阐明。例如，Gϕ是促炎性还是抗炎性的？决定其形成与功能的因素有哪些？ 体外 或 体内? 哪一类特定的中性粒细胞亚群是促进其发育为Gϕ的前体细胞？它们是否与某些病理状态相关，具体是哪些？这些问题共同引发了关于其来源及潜在功能的深入思考。
然而，应牢记方案中的关键步骤和潜在陷阱。方案中的一个关键步骤是&#160;Gϕ的发育是将纯化的中性粒细胞培养在不含细胞因子、生长因子或抗生素的培养基中。另一个关键步骤是排除Gϕ由污染的单核细胞发育而来，并确认Gϕ的中性粒细胞来源。因此，在通过不连续密度梯度法分离血液后，中性粒细胞进一步通过流式细胞术进行额外的纯化步骤，利用粒细胞门控及CD15进行分选。+/CD14- 标记物。通过流式细胞术分离进一步纯化中性粒细胞后获得的发育中Gϕ与未经此纯化步骤的样本相比并无差异。因此，由于流式细胞术步骤会导致额外的细胞损失，大多数实验均未进行该纯化步骤。值得注意的是，在极少数情况下，培养物中可见少量嗜酸性粒细胞，其大小在培养期间保持不变。还应指出，尽管存在多种从人血液中分离中性粒细胞的方法，但本研究仅采用了此处描述的方法，因此无法比较其他中性粒细胞分离方法对Gϕ发育的影响。
研究Gϕ时的一个主要障碍在于无法获得足够数量且纯度适合多种生物化学检测的Gϕ细胞群体。在我们实验所采用的条件下，这基本上是不可能实现的。首先，Gϕ的产量很低。从接种的1.0 × 106个PMN细胞出发，经过七天培养后，仅能生成约100至200个Gϕ，具体数量取决于供血者。其次，目前尚难以将培养皿中已形成的Gϕ与残留的中性粒细胞碎片有效分离。这些限制使得通过生物化学或分子生物学方法对细胞进行分析在实际操作中几乎不可行。因此，本实验方案的重点是通过光学显微镜和共聚焦显微镜来描述Gϕ的鉴定及其功能。此外，还通过活细胞成像和延时显微技术观察了中性粒细胞在培养过程中形态学上向Gϕ转化的过程14。显然，若要应用生物化学或分子生物学方法，并克服产量低以及从培养皿中将存活Gϕ与中性粒细胞碎片分离的问题，可能需要更大体积的血液样本。
总之，我们最近首次描述了在培养条件下Gϕ的发育过程，Gϕ是一类源自中性粒细胞的长寿命吞噬细胞亚群。因此，目前唯一可用于在体外培养获得Gϕ的方法即为此法，尽管上述两个主要局限性仍有待克服（培养所得Gϕ产量较低，以及无法将发育成熟的Gϕ与培养皿中的中性粒细胞碎片分离）。尽管如此，本实验方案中所展示的Gϕ制备与鉴定方法，对于关注炎症反应以及中性粒细胞生物学特性与可塑性的科研人员而言至关重要，有助于进一步探究Gϕ的潜在意义及其功能。

多形核中性粒细胞（PMN）是血液中数量最多的白细胞群体，通过产生多种细胞毒性分子，在抵御病原体入侵中发挥第一道防线的作用。传统观点长期以来认为，中性粒细胞是寿命短暂、在血液中循环的专业吞噬细胞，能够最先到达急性炎症部位，以对抗感染并协助清除病原体及有害颗粒。1 在未活化状态下，中性粒细胞会持续进入凋亡程序。当中性粒细胞从血液迁移至炎症部位时，会被激活以促进炎症的消退。它们通过产生活性氧（ROS）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）以及具有强效杀菌活性的组织蛋白酶等裂解酶类，吞噬并杀灭入侵的微生物。为了捕获病原体，中性粒细胞还会释放由含抗菌肽和多种裂解酶的核染色质纤维组成的胞外诱捕网（NETs）。然而，中性粒细胞不受控制地释放这些细胞毒性分子也可能持续引发炎症反应，并对周围组织造成损伤。2 因此，巨噬细胞（Mϕ）和树突状细胞（DC）有效清除凋亡的中性粒细胞，对于炎症的消退至关重要。3,4,5,6
然而近年来，中性粒细胞是多功能细胞这一观点日益明确，其功能远不止吞噬作用和杀灭病原体。6,7 通过启动或活化过程，中性粒细胞的可塑性正逐渐受到关注。例如，受到细菌和分枝杆菌刺激的中性粒细胞被证实可分泌白细胞介素（IL）-10并调控炎症反应，提示存在免疫调节反应。8 有丝分裂后的中性粒细胞在细胞因子和生长因子处理下，可转分化为类似巨噬细胞（Mϕ-like）或类似树突状细胞（DC-like）的细胞，并具有消化和呈递抗原片段的能力。9,10 因此，在整合先天免疫与适应性免疫应答中发挥关键作用。3,6 生长因子的激活促进了凋亡中性粒细胞或细胞碎片的吞噬，从而有助于清除炎症部位的碎片并促进炎症消退。3,9 特别是当巨噬细胞/树突状细胞清除系统功能不足或超负荷时，11,12 提示可能存在“自我调节”机制，有助于缓解炎症反应。这是因为凋亡是一种受调控的自主性细胞死亡形式，可抑制细胞毒性物质向胞外释放，从而防止对周围组织造成损伤。6
延长存活时间是中性粒细胞活化的另一特征，可通过多种宿主来源因子处理得以证明，例如粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、炎症性细胞因子如干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α，以及/或者病原体来源的产物，从而使得中性粒细胞能够调节其存活反应。6 事实上，中性粒细胞的存活是其可塑性的前提，并与其执行吞噬作用的能力相关。6,13 相应地，该过程还被发现与表型和功能的改变相关，这些改变依赖于基因表达的上调，通过诱导合成参与延长中性粒细胞寿命及抑制凋亡的新蛋白而实现。10
与寿命较短、在培养中会持续发生凋亡的中性粒细胞，或如上所述需依赖细胞因子/生长因子激活从而延长寿命的中性粒细胞不同，我们近期发现了一类新的、稀有的中性粒细胞亚群，这类细胞可在标准培养条件下从新鲜分离的人外周血中性粒细胞中自发形成，无需外源添加任何细胞因子或生长因子。14 这些此前文献中未见报道的中性粒细胞来源的细胞被称为巨噬样吞噬细胞（Giant phagocytes, Gϕ）。Gϕ在体外培养中具有较长的寿命，通常在5–7天内完全发育成熟，并表现出独特的形态学特征、表型表达及功能特性。其体积显著增大，这是由于对死亡中性粒细胞残余物进行自吞噬所致；细胞内含有大量空泡结构，并存在吞噬溶酶体。Gϕ表达特异性的中性粒细胞颗粒标志物——分化簇（CD）66b，嗜天青颗粒标志物CD63和髓过氧化物酶（MPO），以及其他中性粒细胞标志物，如CD11b、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、CD15、NADPH氧化酶亚基gp91-phox和p22-phox，以及自噬标志物LC3BII14,15。在功能方面，Gϕ能够主动吞噬乳胶微球和酵母聚糖颗粒，并在酵母聚糖或佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸盐（PMA）刺激下产生活性氧（ROS）。有趣的是，与新鲜中性粒细胞不同，Gϕ还强烈表达清道夫受体CD68和CD36，能够摄取氧化型低密度脂蛋白（oxLDL），并在oxLDL刺激下产生ROS。此外，Gϕ不表达单核细胞系标志物CD14、CD16和CD163，也不表达树突状细胞标志物CD1c和CD141。更重要的是，吞噬作用、自噬过程以及功能完整的NADPH氧化酶是Gϕ发育所必需的前提条件。这是因为吞噬抑制剂细胞松弛素B、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和巴佛洛霉素（BafA1），以及NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘𬭩盐（DPI）均能阻断其发育。此外，单核细胞/中性粒细胞共培养体系以及间歇性缺氧环境也会抑制Gϕ的形成，而中性粒细胞对持续性缺氧的适应则有利于其发育14,15。Gϕ在体外培养中的推测发育过程如图1所示。本文所述实验方案详细描述了从新鲜分离的人外周血中性粒细胞制备Gϕ的步骤，包括其发育、鉴定及部分基本特性分析。该方案可用于进一步研究这些新发现且具有重要意义的中性粒细胞来源Gϕ的广泛功能谱及其生物学作用，以明确其潜在功能与科学价值。
<img alt="中性粒细胞凋亡过程示意图；显示凋亡、凋亡碎片及巨大中性粒细胞。" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 7天中性粒细胞培养中巨细胞发育的示意图 建议在炎症部位（1) 中性粒细胞发生凋亡性细胞死亡，且（2释放包含核碎片、颗粒（绿色和红色点状物）及其他细胞内组分的膜包被片段，从而触发自噬机制。3) 巨型吞噬细胞（Gϕ）可在缺乏细胞因子或生长因子的长期中性粒细胞培养中通过内吞凋亡小体和中性粒细胞碎片而形成，同时保持功能性NADPH氧化酶。它们的特征包括多种中性粒细胞标志物CD66b+/CD63+/MPO+/CD15+/CD11b+/NE阳性，含有颗粒和细胞碎片的大吞噬体，以及清道夫受体CD36和CD68。Gϕ多为单核细胞，能够内吞多种颗粒和氧化型低密度脂蛋白（oxLDL），并产生活性氧（ROS）。填充Gϕ的空泡膜中含有LC3B（深蓝色标记），这是自噬体膜的标志物，提示自噬与巨型吞噬细胞形成之间存在密切关联。在含有GM-CSF/IL-4的培养基中，Gϕ无法形成。此外，NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘𬭩盐（DPI）、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和巴佛洛霉素（BafA1），以及吞噬抑制剂细胞松弛素B（Cyto. B）均可阻断其形成。4) 潜在的 Gϕ 函数 体内 可能具有抗炎或促炎特性，并参与动脉粥样硬化过程（此图基于我们的研究结果）14,15 并根据随附的贝尔顿社论进行了修改20). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>无菌头皮静脉输液器（21G×3/4）&amp;nbsp;</td><td>Bio Diagnostics Ltd.</td><td># 20080312</td><td>用于静脉穿刺的无菌针头</td></tr><tr><td>VACUETTE HOLDEX 一次性持针器 PP</td><td>Greiner Bio-One</td><td># 450263</td><td>用于固定静脉穿刺时的部位&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VACUETTE 管 K3E K3EDTA（16 x 100/9 mL）</td><td>Greiner Bio-One</td><td># 455036</td><td>用于血液采集的无菌管</td></tr><tr><td>Nunclon 多孔培养皿（24 孔 × 1 ml）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td># 142475</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯锥形离心管（50 ml）</td><td>Greiner Bio-One</td><td># E14103PJ</td><td></td></tr><tr><td>Transwell-24 孔（跨膜迁移实验）</td><td>康宁</td><td># CA-3415</td><td>聚碳酸酯膜，6.5 mm 直径，3 &amp;mu;微米级孔隙&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>生物产业</td><td># 01-100-1A</td><td>不要添加抗生素&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EA.hy926 (ATCC CRL2922)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>生物产业</td><td># CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>ATCC 配制的杜尔贝科培养基&amp;rsquo;s&amp;nbsp; 改良型伊格尔培养基&amp;rsquo;s 培养基</td><td>生物产业</td><td># 302002</td><td>完全培养基</td></tr><tr><td>聚蔗糖-淋巴细胞分离液1119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 1119-1</td><td>组织培养级</td></tr><tr><td>聚蔗糖-淋巴细胞分离液1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 1077-1</td><td>组织培养级&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（PBS）— 无离子</td><td>生物产业</td><td># 02-023-1A</td><td>细胞生物学和分子生物学级别</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（HI-FCS）</td><td>生物产业</td><td># 04-121-1B</td><td>细胞生物学级或组织培养级，低内毒素</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td># S3014</td><td>分子生物学级别，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>多聚甲醛，16%</td><td>电子显微镜科学公司</td><td># 15710</td><td>细胞生物学级或组织培养级（仅含16% PFA）</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td>分子生物学级&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>生物产业</td><td># 04-009-1</td><td>细胞生物学和分子生物学级别</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>生物产业</td><td># 031021B</td><td>组织培养级&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>梅-格雷夫斯病&amp;uuml;nwald</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># MG500</td><td>细胞生物学级别-（操作编号 GS-10）</td></tr><tr><td>吉姆萨染色试剂盒</td><td>Sigma</td><td># 48900</td><td>细胞生物学级别－（程序编号 GS-10）</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>生物产业</td><td># 03090105</td><td></td></tr><tr><td>人白细胞介素-8（CXCL8）</td><td>PeproTech</td><td># 200-08-5</td><td></td></tr><tr><td>抗CD14（克隆5A3B11B5）</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-58951</td><td>小鼠IgG2b；由&amp;nbsp; 单核细胞</td></tr><tr><td>抗CD63（克隆号 MX-49.129.5）</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-5275</td><td>小鼠 IgG1；由中性粒细胞表达</td></tr><tr><td>抗CD66b（克隆80H3）</td><td>AbD Serotec</td><td># MCA216</td><td>小鼠IgG1；由中性粒细胞表达</td></tr><tr><td>抗CD1c（BDCA-1）（克隆AD5-8E7）</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-090-695</td><td>小鼠IgG2a；由&amp;nbsp; 树突状细胞</td></tr><tr><td>抗CD15（克隆MY-1）</td><td>Abcam</td><td># ab754</td><td>小鼠IgM；由中性粒细胞表达</td></tr><tr><td>抗细胞色素 b-245 轻链（p22-phox）（克隆 44.1）</td><td>BioLegend</td><td># 650001</td><td>小鼠 IgG2a；用于识别中性粒细胞 NADPH 氧化酶复合物</td></tr><tr><td>抗CD68</td><td>蛋白质技术</td><td># 16192-1-AP</td><td>兔IgG；用于识别氧化型低密度脂蛋白清道夫受体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗LC3B</td><td>Sigma</td><td># L7543</td><td>兔IgG&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗髓过氧化物酶</td><td>Abcam</td><td># ab45977</td><td>兔IgG</td></tr><tr><td>抗中性粒细胞弹性蛋白酶</td><td>Calbiochem</td><td># 481001</td><td>兔IgG&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗NOX2（gp91-phox）</td><td>Abcam</td><td># ab131083</td><td>兔IgG</td></tr><tr><td>抗CD36（SR-B3）</td><td>Novus Biologicals</td><td># NB400-144</td><td>兔IgG</td></tr><tr><td>纯化的鼠IgG1 &amp;kappa; 同型对照（克隆 MG1-45）</td><td>BioLegend</td><td># 401401</td><td>用作同型对照的抗体</td></tr><tr><td>纯化的鼠IgG2a &amp;kappa; 同型对照（克隆 MOPC-173）</td><td>BioLegend</td><td># 400263</td><td>用作同型对照的抗体</td></tr><tr><td>正常兔 IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-2027</td><td>用作同型对照的抗体</td></tr><tr><td>CF488A 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>Biotium&amp;nbsp;</td><td># 20012</td><td>带有绿色荧光染料 CF488A 的抗兔 IgG</td></tr><tr><td>CF647 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>Biotium&amp;nbsp;</td><td># 20043</td><td>带有红色荧光染料 CF647 的抗兔 IgG</td></tr><tr><td>CF488A 山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Biotium&amp;nbsp;</td><td># 20010</td><td>抗小鼠 IgG（绿色荧光染料 CF488A 标记）</td></tr><tr><td>CF647 山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Biotium&amp;nbsp;</td><td># 20040</td><td>带有红色荧光染料 CF647 的抗小鼠 IgG</td></tr><tr><td>含DAPI的荧光封片剂</td><td>Vectashield H-1000；Vector Lab Inc.</td><td># E19-18</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜（LSM 700）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>卡尔·蔡司</td><td>序号 3523000380</td><td>Plan Apo 40X 浸油物镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蔡司共聚焦激光扫描显微镜软件（ZEN 2010）</td><td>卡尔蔡司显微成像有限公司</td><td>6.0 版本</td><td>用于共定位分析</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>Wayne Rasband，美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>版本 1.49k</td><td>用于细胞的测定&amp;nbsp; 区域和荧光强度</td></tr><tr><td>倒置显微镜（Axiovert 25）</td><td>卡尔·蔡司</td><td>序号 201060153</td><td>培养细胞的观察</td></tr><tr><td>离心机（Megafuge 1.0 R）</td><td>Heraeus Instruments</td><td># D-37520</td><td>从血液中分离细胞；细胞涂片制备</td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜（Zeiss Axio Observer Z.1）</td><td>卡尔·蔡司</td><td>序号 3834001470</td><td>巨噬细胞发育的演示</td></tr><tr><td>温度控制培养系统（Cube&amp;&盒)</td><td>生命成像服务</td><td></td><td>显微镜温控系统</td></tr><tr><td>高&amp;nbsp;高分辨率数字CCD相机（AxioCam HRm）</td><td>卡尔·蔡司</td><td>编号 117090279</td><td>用于捕捉高对比度&amp;nbsp; 被检细胞对象的图像数据</td></tr><tr><td>疏水屏障笔（Elite PAP Pen）</td><td>诊断生物系统</td><td># K039</td><td>用于免疫荧光染色中细胞边界的界定</td></tr></tbody></table>

一种新型人中性粒细胞来源的巨大吞噬细胞亚群的建立与鉴定 体外

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

中性粒细胞（PMN）最广为人知的功能是针对入侵病原体和微生物的吞噬作用。在白细胞中，它们的半衰期最短，在未活化的状态下会持续性地走向凋亡。当被募集到炎症部位以消除炎症时，它们会产生一系列具有强效抗菌杀伤能力的细胞毒性分子。然而，当这些强效的细胞毒性分子不受控制地释放时，可能对周围组织造成损伤。近年来，越来越多的证据表明中性粒细胞具有多功能性，展现出可塑性和免疫调节功能。我们最近鉴定出一种新的中性粒细胞来源的亚群，该亚群在标准培养条件下无需添加细胞因子或生长因子（如粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）或白细胞介素（IL）-4）即可自发形成。这些细胞通过吞噬中性粒细胞残余物显著增大体积，因此被称为巨噬细胞（Gϕ）。与中性粒细胞不同，Gϕ在体外培养中寿命较长。它们表达分化簇（CD）中性粒细胞标志物CD66b/CD63/CD15/CD11b/髓过氧化物酶（MPO）/中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），但不表达单核细胞系标志物CD14/CD16/CD163以及树突状细胞标志物CD1c/CD141。它们还能摄取乳胶颗粒和酵母聚糖，并在经调理的酵母聚糖和PMA刺激下产生氧化爆发反应。此外，Gϕ表达清道夫受体CD68/CD36，与中性粒细胞不同的是，它们能够内吞氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）。更重要的是，与新鲜中性粒细胞或培养的单核细胞不同，它们在摄取oxLDL后会增强活性氧（ROS）的产生。此外，这些吞噬细胞含有微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）包被的空泡，提示自噬被激活。使用特异性抑制剂的研究表明，吞噬作用和自噬均为其发育所必需，并且可能依赖于NADPH氧化酶产生的ROS。本文介绍了一种在体外培养中制备这种长寿、中性粒细胞来源的吞噬细胞亚群的方法，以及其鉴定手段和目前已知的特征。该实验方案对于获得并表征Gϕ，进而深入研究其生物学意义和功能至关重要。

中性粒细胞自噬作用及在培养中的发育
中性粒细胞自噬及其在培养7天内发育为Gϕ的过程如图3和图4所示。培养第4至7天时，细胞体积显著增大，15 自噬现象在中性粒细胞与荧光膜染料（PKH-26，红色；PKH-67，绿色）共培养后90分钟内即已明显可见14。作为该中性粒细胞亚群的对照，部分中性粒细胞培养物还接受了GM-CSF/IL-4处理。如先前所述18,19，经细胞因子处理的细胞在培养7至14天后体积增大，但其体积仍小于Gϕ，且具有类似树突状细胞（DC样）的胞质突起（图5），这与Oehler et al.19先前报道的结果一致。此外，经GM-CSF/IL-4处理的细胞CD66b表达呈阴性或低表达15，进一步明确显示出形态学上以及潜在功能上的差异。
<img alt="延时显微镜、细胞荧光、示意图；追踪蛋白质定位，红色-绿色标记。" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 体外培养中发育中的巨大吞噬细胞（Gϕ）的自噬吞噬作用。 在零时间点，将 freshly isolated purified neutrophils 用 PKH-67（绿色）或 PKH-26（红色）膜荧光染料标记，随后进行共培养并持续观察达七天。细胞被离心至玻片上，细胞核经 DAPI 染色后，使用共聚焦显微镜分析样品。自噬吞噬现象在共培养 90 分钟后即可明显观察到。在发育中的 Gϕ 中，红色与绿色信号合并形成黄色和橙色的现象清晰可见。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="七天内的细胞分化过程，显微镜图像，细胞形态变化，20 μm 比例尺。" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4： 培养过程中巨大吞噬细胞（Gϕ）的发育。 对 freshly isolated purified neutrophils 进行长达 7 天的培养观察。在指定时间点将细胞离心至玻片上，使用 May Grunewald-Giemsa 染色，并通过明场显微镜进行分析。图中同时展示一名嗜酸性粒细胞较少的个体作为对照。请注意，嗜酸性粒细胞在培养过程中大小保持不变。放大倍数 100X 油镜。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="May-Grunwald-Giemsa 染色；经 GM-CSF/IL-4 处理的细胞荧光显微镜图像，标尺为 20 μm。" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5： 体外培养中巨噬细胞样吞噬细胞（Gϕ）与经 GM-CSF/IL-4 处理的中性粒细胞发育的比较。 （A）经 May-Grunwald-Giemsa 染色的中性粒细胞，在无细胞因子（Gϕ）或含 GM-CSF/IL-4 的培养基中培养 7 天。样本通过明场显微镜进行分析，放大倍数为 ×40。在添加 GM-CSF/IL-4 的培养基中发育的细胞表现出广泛的胞质突起，但体积小于 Gϕ。 （B）新鲜分离的中性粒细胞用 PKH-26（红色）染料标记后，在无细胞因子培养基中培养 7 天；或用 PKH-67（绿色）染料标记后，在添加 GM-CSF/IL-4 的培养基中培养 7 天。随后，将两种发育后的细胞以 1:1 的比例混合并共培养 2 小时。细胞经固定后通过共聚焦显微镜分析。本图已根据参考文献修改。15 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了进一步研究Gϕ的发育过程，还通过延时显微镜观察了其形态学变化。视频1（第3天至第4天）和视频2（第4天至第5天）展示了在纯化的中性粒细胞培养物中Gϕ的发育过程。这些Gϕ为非贴壁或轻微贴壁细胞，运动能力有限，并主动吞噬周围的中性粒细胞残余物和碎片。在视频3中，在混合的单核细胞/中性粒细胞培养物中比较了单核细胞来源的Mϕ与Gϕ的运动情况。Mϕ活跃爬行（左侧，未标记细胞）；Gϕ（右侧）为明亮的PKH-26标记细胞。
<img alt="细胞显微镜图像，以灰度显示细胞结构，用于生物学研究分析。" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
视频-1：通过延时显微镜展示第3至第4天纯化PMN培养物中巨噬细胞的发育过程。通过延时显微镜对中性粒细胞在培养第3天至第4天的过程进行了追踪观察。延时显微镜系统由倒置电动荧光显微镜、高分辨率黑白CCD相机以及载物台式培养箱组成。延时图像采集间隔为每10分钟一次。原始发表于参考文献14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-1.mpg" target="_blank">请点击此处观看该视频。</a>
<img alt="用于生物学研究的细胞形态学单层细胞显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
视频-2：通过延时显微镜观察第4至第5天纯化PMN培养物中巨大吞噬细胞的形成过程。 通过延时显微镜对中性粒细胞在培养第4天至第5天的过程进行追踪观察。延时显微镜系统由倒置电动荧光显微镜、高分辨率黑白CCD相机以及载物台式培养箱组成。延时图像采集间隔为每10分钟一次。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-2.mp4" target="_blank">请点击此处观看该视频。</a>
<img alt="微生物、细胞结构、显微分析、生物研究的显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
视频-3：共培养中形成的巨大吞噬细胞与巨噬细胞。 通过延时显微镜对单核细胞/中性粒细胞共培养体系从第4天至第5天进行连续观察。左侧为单核细胞来源的巨噬细胞；右侧为明亮（PKH-26染色）的中性粒细胞来源的巨大吞噬细胞。该视频所用延时显微镜系统由倒置电动荧光显微镜、高分辨率黑白CCD相机及载物台培养箱组成。延时图像采集间隔为每10分钟一次。原始发表于参考文献14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-3.mp4" target="_blank">请点击此处查看该视频。</a>
巨噬细胞中标志物的表达
通过检测以下中性粒细胞标志物 CD66b/CD63/MPO/NE/CD15 的阳性表达，证实了 Gϕ 的中性粒细胞来源（图6）。Gϕ 还表达 NADPH 氧化酶、氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）清道夫受体 CD68 和 CD36，并含有 LC3B 包被的空泡和聚集体（通过 Western 印迹鉴定为 LC3BII15），表明存在自噬标志物。然而，Gϕ 对单核细胞系（CD14、CD16 和 CD163）以及树突状细胞（CD1c 和 CD141）标志物呈阴性，提示 Gϕ 并非来源于污染的单核细胞。
<img alt="中性粒细胞颗粒标记物、免疫荧光显微镜图像，显示细胞蛋白。" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 6"> 
图6： 培养7天后巨噬细胞（Gϕ）中中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞多种标记物的表达。 巨噬细胞呈阳性表达中性粒细胞特异性颗粒标记物CD66b、嗜天青颗粒标记物CD63和MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶以及CD15；对树突状细胞标记物CD1c和CD141，以及单核细胞系标记物CD14、CD16和CD163呈阴性表达。此外，巨噬细胞还表达自噬标记物LC3B、清道夫受体CD68和CD36，以及NADPH氧化酶亚基gp91-phox/p22-phox。细胞核用DAPI染色，并通过共聚焦显微镜进行样本分析。本图已根据参考文献修改。14,15 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
Gϕ 的功能——NADPH 氧化酶激活、活性氧产生和吞噬作用：
Gϕ细胞对乳胶珠和调理过的酵母聚糖表现出明显的吞噬作用。Gϕ细胞还能产生基础水平的活性氧（ROS）（图7A），并在酵母聚糖和PMA刺激下发生氧化爆发反应（图7B-D）。然而，与单核细胞或中性粒细胞不同，Gϕ在oxLDL刺激下也能产生ROS，并可被油红O染色（图7B, F）。值得注意的是，用NADPH氧化酶抑制剂DPI处理新鲜中性粒细胞不仅抑制了ROS的产生，还阻止了体外培养中Gϕ的形成，表明ROS信号通路对Gϕ的形成至关重要。14,15
<img alt="经处理细胞的荧光显微镜图像；ROS、LysoTracker染色、吞噬作用检测。" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7： 巨噬细胞（Gϕ）的氧化爆发、吞噬作用及氧化低密度脂蛋白（oxLDL）摄取。 （A）Gϕ溶酶体中可见基础活性氧（ROS）生成。（B）Gϕ在氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）、佛波酯（PMA）和酵母聚糖（zymosan）刺激下的ROS生成（酵母聚糖颗粒清晰可见）。（C）Gϕ的氮蓝四唑（NBT）试验，显示在无PMA和有PMA刺激下的呼吸爆发活性（切片未染色，但插图为May-Grünwald-Giemsa染色）。（D）经PMA及PMA/DPI（DPI抑制NADPH氧化酶和ROS生成）处理的Gϕ的NBT试验与May-Grünwald-Giemsa染色结果。（E）PKH-26（红色）标记细胞对乳胶颗粒及IgG调理酵母聚糖的吞噬作用。（F）未经处理与oxLDL处理的Gϕ的油红O染色。本图已根据参考文献修改。14,15 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
中性粒细胞跨内皮细胞迁移
为了鉴定可能分化为Gϕ的中性粒细胞亚群，检测了中性粒细胞穿过内皮细胞单层的迁移能力（图8A）。90分钟后，有62.3 ± 12.2%的中性粒细胞迁移穿过内皮细胞，向下方隔室中的IL-8移动。值得注意的是，表达CD66b/CD15/LC3B的Gϕ仅来源于已迁移的中性粒细胞群体，而由未迁移的中性粒细胞群体发育而来的细胞体积较小，且不表达中性粒细胞标志物CD66b/CD15（图8B、8C）。
<img alt="跨内皮迁移示意图；IL-8对中性粒细胞的作用。共聚焦图像：LC3B/CD66b，CD15表达。" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 8"> 
图8： IL-8依赖性中性粒细胞经内皮细胞跨膜迁移对巨噬细胞样细胞（Gϕ）形成的影响。 （A）示意图，展示中性粒细胞在IL-8趋化作用下穿过内皮细胞单层的迁移实验。该实验可作为模拟中性粒细胞募集至急性炎症部位的模型。（B-C）在细胞迁移实验中（见方案3），将发生跨膜迁移的（B）和未迁移的（C）中性粒细胞组分分别在无生长因子条件下培养七天（同方案1）。随后，细胞经离心沉降至载玻片，进行共聚焦显微镜分析。固定后的细胞使用CD66b（红色）、LC3B（绿色）和CD15（红色）抗体染色，细胞核用DAPI染色（蓝色）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种获取并鉴定新近表征的中性粒细胞来源巨噬细胞亚群的方法。这些细胞由新鲜的人类血液中性粒细胞在体外培养中发育而成，具有吞噬作用、自噬能力、体积巨大以及寿命显著延长等特征。该方法对于进一步研究这一独特的中性粒细胞来源亚群至关重要。

中性粒细胞（PMN）最广为人知的功能是针对入侵病原体和微生物的吞噬作用。在所有……中，它们的半衰期最短。

本方法的总体目标是生成并鉴定由循环人中性粒细胞体外培养而来的巨大吞噬细胞，以研究其在炎症性和抗炎性免疫应答中的作用。该方法可用于获取并鉴定一种由人中性粒细胞发育而来、可在长期培养条件下维持的新亚群巨大吞噬细胞。该技术可用于进一步探究巨大吞噬细胞的意义和功能，并解答有关其活化与可塑性的关键科学问题。演示该实验操作的是来自我实验室的研究助理 Eva Leder 和博士后 Oksana Rogovoy。使用无菌头皮静脉穿刺套件，从一名健康的年轻志愿者体内采集至少 40 毫升静脉血。随后在生物安全水平层流罩内轻轻混匀血液。取10至12毫升全血样本，用预热的含2%热灭活FCS的无离子PBS稀释至终体积24毫升。然后将12%毫升的聚蔗糖1119加入到每个50毫升无菌聚丙烯圆锥形离心管底部（每份血样对应一管），随后小心地将12毫升聚蔗糖1077覆盖在聚蔗糖1119梯度溶液上方。用移液器小心地将24毫升稀释后的血液加至各管密度梯度溶液上层，通过离心分离细胞。应观察到两层不透明的液体。弃去每根试管中单个核细胞层上方0.5厘米内的液体。然后将每个样本中的单个核细胞转移至同一根新的试管中。接下来，弃去距离多形核细胞或PMN层上方0.5厘米处的剩余液体，并将每个样本中的PMN转移至不同的新离心管中。用终体积为30毫升、含2%热灭活FCS的PBS洗涤PMN，随后加入3毫升无菌冰上预冷的低渗0.2%氯化钠溶液裂解红细胞。冰上孵育30秒后，加入3毫升无菌冰上预冷的1.6%氯化钠溶液以恢复等渗状态。然后加入6毫升37摄氏度的RPMI 1640培养基（添加热灭活胎牛血清），通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于4毫升RPMI 1640培养基中，该培养基含有10%热灭活胎牛血清。计数后，将细胞浓度调整为每毫升培养基含1.25至1.5×10⁶个中性粒细胞，并将1毫升细胞悬液接种至24孔板的各个孔中。然后将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的加湿培养箱中，在每三天用新鲜的RPMI 1640培养基（添加10%热灭活FCS）轻柔地更换一半培养液的条件下进行培养。中性粒细胞将在培养7天内分化为巨大的吞噬细胞。在培养的第7天，小心地从每个孔中移除一半的培养液。然后用力吹打剩余的培养基，以去除轻度贴壁的巨噬细胞。将每组处理组中两到四个孔中脱落的细胞转移至各自的15毫米锥形管中，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于每管100至120微升的培养基中。随后，为每组处理组配备两到三个载玻片架，以及滤纸卡片和漏斗。接下来，将每根试管中的全部细胞体积加入相应的细胞离心涂片机漏斗中。然后将样品架装入细胞离心涂片机，离心使细胞沉降到载玻片上。将离心后的载玻片干燥10分钟。然后使用防水标记笔在细胞周围绘制疏水屏障，并在室温下于通风橱中用4%多聚甲醛固定样本。10分钟后，用PBS缓冲液清洗载玻片三次，每次约100 µL，每次冲洗时间宜短。接着在室温下用含0.5% Triton X-100的PBS处理细胞10分钟以进行透化，随后按上述方法用PBS洗涤五次。用含10%正常山羊血清的RPMI 1640培养基封闭非特异性结合位点，作用适当时间后，用PBS洗涤一次。随后，在容器中加入少量水以维持湿度，然后在湿润、避光的环境中，加入约100微升目标一抗，4摄氏度孵育过夜。接着，进行一次PBS洗涤，再加入相应的荧光标记二抗。室温避光孵育40分钟后，洗涤样本以去除多余的抗体，每个样本滴加一滴封片剂，并加盖盖玻片。在30至120分钟内，使用40倍油浸物镜通过共聚焦激光扫描荧光显微镜观察样本。随后使用适当的软件计算细胞面积、荧光强度及共定位情况。这些图像显示，在培养7天后可观察到中性粒细胞发育为巨大的吞噬细胞。使用荧光膜染料标记后，自噬现象在中性粒细胞培养90分钟时即已明显，而在培养第4至第7天时，细胞直径显著增大。然而，如果在中性粒细胞培养体系中添加GM-CSF和IL-4，则细胞总体直径较小，并出现类似树突状细胞的胞质突起。在培养第3至第4天以及第4至第5天进行的延时显微镜观察显示，这些巨大的吞噬细胞无附着或仅有轻微附着，运动能力有限，但能够主动吞噬周围的中性粒细胞残余物和碎片。在此类单核细胞与中性粒细胞混合培养体系中，可将活跃爬行的巨噬细胞的迁移行为与同一培养孔中荧光标记的巨大吞噬细胞近乎静止的运动状态进行比较。巨大吞噬细胞的中性粒细胞来源可通过其表达中性粒细胞标志物而缺乏单核细胞及树突状细胞标志物的表达特征加以验证。巨大的吞噬细胞还能产生活性氧基团，并对酵母多糖和佛波酯刺激产生氧化爆发反应。然而，与单核细胞或中性粒细胞不同，它们还会对氧化型低密度脂蛋白刺激产生氧化爆发反应。一旦掌握该技术，可在六到七天内完成。在进行该操作时，需注意在喂养中性粒细胞培养物时应轻柔地更换一半的培养基。完成该操作后，可进一步采用其他染色技术，以研究这些引人关注的细胞在体外及体内条件下的其他功能。该技术可为中性粒细胞生物学领域的研究人员探索中性粒细胞的活化与可塑性，以及在人体生理和病理生理条件下识别这些细胞提供新的途径。观看本视频后，您应该能够充分了解如何在培养物中获取并鉴定巨型吞噬细胞。请务必注意，处理人血时可能存在潜在感染风险，因此在进行该操作时，必须采取预防措施，例如佩戴手套，并将所有液体及一次性器材丢弃至适当的生物危害容器中。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

开发和鉴定人的中性粒细胞源性巨噬细胞新型亚群体外

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一种重要的先天免疫机制，可抵御致病性细菌、真菌和寄生虫。本文描述了从人血液中分离中性粒细胞并激活其形成NETs的方法。我们还介绍了在光学显微镜和电子显微镜下观察NETs的制备技术。...

中性粒细胞胞外诱捕网：如何产生并可视化观察

我们展示了如何使用双光子显微镜观察感染肺组织中中性粒细胞的动态行为，包括其中性粒细胞吞噬病原体或形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过程。...

利用双光子显微镜直接观察感染肺组织中中性粒细胞的吞噬作用及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成

关键词：中性粒细胞，吞噬作用，中性粒细胞胞外诱捕网（NET），双光子显微镜，肺部感染，活体成像

一种体外生成人中性粒细胞胞外诱捕网的技术

中性粒细胞不仅在宿主防御侵入性微生物方面发挥重要作用，还参与对肿瘤细胞的免疫监视。本文描述了具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离技术，以及监测抗肿瘤中性粒细胞功能的方法。 体外 和 体内.

具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征

中性粒细胞是最丰富的白细胞类型。本文介绍了通过密度梯度分离法从人血液中分离中性粒细胞，以及将人早幼粒细胞（HL60）沿粒细胞途径进行分化的方法；用于检测它们在淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性中的作用。...

中性粒细胞分离与分析以确定其在淋巴瘤细胞对治疗药物敏感性中的作用

本文描述了一种利用比率荧光指示剂S-1（seminaphthorhodafluor，SNARF-1）来测量人和小鼠中性粒细胞吞噬体pH值与面积以及细胞质pH值的简单方法。该方法通过活细胞共聚焦荧光显微镜结合图像分析实现。...

使用比率型pH指示剂对中性粒细胞吞噬体和细胞质进行成像

本文介绍了一种检测固定和通透处理的组织切片中中性粒细胞存在情况，以及评估活体纯化中性粒细胞活化状态的实验方案。其中，MUB40 肽可结合存在于中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中的乳铁蛋白。通过通透处理或中性粒细胞活化暴露颗粒内容物，即可实现对中性粒细胞的标记。...

用于检测中性粒细胞介导的炎症事件的 MUB40 肽

本方案详细描述了一种从全血、血沉棕黄层或白细胞单采膜中分离中性粒细胞的方法，可获得较高的细胞得率、高纯度以及最低程度的细胞活化。我们采用梯度纯化、红细胞（RBC）沉降和红细胞裂解法，以获取高质量/高纯度的中性粒细胞制备物。...

从全血和血沉棕黄层中分离人中性粒细胞

本方案包含一系列中性粒细胞功能检测方法，可作为筛选手段，用于评估不同信号通路相关的功能。该方案包括细胞活力、纯度、活性氧生成、实时迁移、吞噬作用的初步且简单的评估，以及对中性粒细胞胞外诱捕网的初步分析建议。...

一套用于快速评估中性粒细胞功能的筛选技术

本文概述了一种从小鼠骨髓中分离中性粒细胞并构建ATAC-seq文库的实验方案，旨在确保中性粒细胞的高存活率和高质量文库的制备。文章提供了骨髓细胞制备、免疫磁珠分选及文库构建的详细步骤，为中性粒细胞研究领域的新手研究人员提供了有价值的参考指南。...

小鼠骨髓来源中性粒细胞的ATAC-Seq文库制备

低密度中性粒细胞（LDN）在多种疾病中显著增加。通常通过细胞分选来分离LDN。本文介绍一种获取高纯度且具有活性的LDN的实用方法。外周血经密度梯度离心后，细胞与磁性微珠孵育，随后通过磁性柱分离LDN。...

快速磁珠法高效纯化低密度中性粒细胞

学习从人中性粒细胞体外培养巨型吞噬细胞的方法，用于研究其在炎症免疫反应中的作用。该技术有助于探索免疫细胞活化与可塑性，为细胞生物学和免疫学研究提供新工具。

一种新型人中性粒细胞来源的巨大吞噬细胞亚群的建立与鉴定体外

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