一种新型人中性粒细胞来源的巨大吞噬细胞亚群的建立与鉴定 体外

本方法的总体目标是生成并鉴定由循环人中性粒细胞体外培养而来的巨大吞噬细胞，以研究其在炎症性和抗炎性免疫应答中的作用。该方法可用于获取并鉴定一种由人中性粒细胞发育而来、可在长期培养条件下维持的新亚群巨大吞噬细胞。该技术可用于进一步探究巨大吞噬细胞的意义和功能，并解答有关其活化与可塑性的关键科学问题。

演示该实验操作的是来自我实验室的研究助理 Eva Leder 和博士后 Oksana Rogovoy。使用无菌头皮静脉穿刺套件，从一名健康的年轻志愿者体内采集至少 40 毫升静脉血。随后在生物安全水平层流罩内轻轻混匀血液。

取10至12毫升全血样本，用预热的含2%热灭活FCS的无离子PBS稀释至终体积24毫升。然后将12%毫升的聚蔗糖1119加入到每个50毫升无菌聚丙烯圆锥形离心管底部（每份血样对应一管），随后小心地将12毫升聚蔗糖1077覆盖在聚蔗糖1119梯度溶液上方。用移液器小心地将24毫升稀释后的血液加至各管密度梯度溶液上层，通过离心分离细胞。

应观察到两层不透明的液体。弃去每根试管中单个核细胞层上方0.5厘米内的液体。然后将每个样本中的单个核细胞转移至同一根新的试管中。

接下来，弃去距离多形核细胞或PMN层上方0.5厘米处的剩余液体，并将每个样本中的PMN转移至不同的新离心管中。用终体积为30毫升、含2%热灭活FCS的PBS洗涤PMN，随后加入3毫升无菌冰上预冷的低渗0.2%氯化钠溶液裂解红细胞。冰上孵育30秒后，加入3毫升无菌冰上预冷的1.6%氯化钠溶液以恢复等渗状态。

然后加入6毫升37摄氏度的RPMI 1640培养基（添加热灭活胎牛血清），通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于4毫升RPMI 1640培养基中，该培养基含有10%热灭活胎牛血清。计数后，将细胞浓度调整为每毫升培养基含1.25至1.5×10⁶个中性粒细胞，并将1毫升细胞悬液接种至24孔板的各个孔中。

然后将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的加湿培养箱中，在每三天用新鲜的RPMI 1640培养基（添加10%热灭活FCS）轻柔地更换一半培养液的条件下进行培养。中性粒细胞将在培养7天内分化为巨大的吞噬细胞。在培养的第7天，小心地从每个孔中移除一半的培养液。

然后用力吹打剩余的培养基，以去除轻度贴壁的巨噬细胞。将每组处理组中两到四个孔中脱落的细胞转移至各自的15毫米锥形管中，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于每管100至120微升的培养基中。随后，为每组处理组配备两到三个载玻片架，以及滤纸卡片和漏斗。

接下来，将每根试管中的全部细胞体积加入相应的细胞离心涂片机漏斗中。然后将样品架装入细胞离心涂片机，离心使细胞沉降到载玻片上。将离心后的载玻片干燥10分钟。

然后使用防水标记笔在细胞周围绘制疏水屏障，并在室温下于通风橱中用4%多聚甲醛固定样本。10分钟后，用PBS缓冲液清洗载玻片三次，每次约100 µL，每次冲洗时间宜短。接着在室温下用含0.5% Triton X-100的PBS处理细胞10分钟以进行透化，随后按上述方法用PBS洗涤五次。

用含10%正常山羊血清的RPMI 1640培养基封闭非特异性结合位点，作用适当时间后，用PBS洗涤一次。随后，在容器中加入少量水以维持湿度，然后在湿润、避光的环境中，加入约100微升目标一抗，4摄氏度孵育过夜。接着，进行一次PBS洗涤，再加入相应的荧光标记二抗。

室温避光孵育40分钟后，洗涤样本以去除多余的抗体，每个样本滴加一滴封片剂，并加盖盖玻片。在30至120分钟内，使用40倍油浸物镜通过共聚焦激光扫描荧光显微镜观察样本。随后使用适当的软件计算细胞面积、荧光强度及共定位情况。

这些图像显示，在培养7天后可观察到中性粒细胞发育为巨大的吞噬细胞。使用荧光膜染料标记后，自噬现象在中性粒细胞培养90分钟时即已明显，而在培养第4至第7天时，细胞直径显著增大。然而，如果在中性粒细胞培养体系中添加GM-CSF和IL-4，则细胞总体直径较小，并出现类似树突状细胞的胞质突起。

在培养第3至第4天以及第4至第5天进行的延时显微镜观察显示，这些巨大的吞噬细胞无附着或仅有轻微附着，运动能力有限，但能够主动吞噬周围的中性粒细胞残余物和碎片。在此类单核细胞与中性粒细胞混合培养体系中，可将活跃爬行的巨噬细胞的迁移行为与同一培养孔中荧光标记的巨大吞噬细胞近乎静止的运动状态进行比较。巨大吞噬细胞的中性粒细胞来源可通过其表达中性粒细胞标志物而缺乏单核细胞及树突状细胞标志物的表达特征加以验证。

巨大的吞噬细胞还能产生活性氧基团，并对酵母多糖和佛波酯刺激产生氧化爆发反应。然而，与单核细胞或中性粒细胞不同，它们还会对氧化型低密度脂蛋白刺激产生氧化爆发反应。一旦掌握该技术，可在六到七天内完成。

在进行该操作时，需注意在喂养中性粒细胞培养物时应轻柔地更换一半的培养基。完成该操作后，可进一步采用其他染色技术，以研究这些引人关注的细胞在体外及体内条件下的其他功能。该技术可为中性粒细胞生物学领域的研究人员探索中性粒细胞的活化与可塑性，以及在人体生理和病理生理条件下识别这些细胞提供新的途径。

观看本视频后，您应该能够充分了解如何在培养物中获取并鉴定巨型吞噬细胞。请务必注意，处理人血时可能存在潜在感染风险，因此在进行该操作时，必须采取预防措施，例如佩戴手套，并将所有液体及一次性器材丢弃至适当的生物危害容器中。