Name: 在P10大鼠新生儿中风的短暂大脑中动脉栓塞模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学习在P10大鼠中建立短暂大脑中动脉栓塞模型，用于研究新生儿缺血性脑损伤机制与修复过程。该方法提供生理性准确的局灶性动脉缺血性卒中模型，包含再灌注成分，有助于探索治疗策略。

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本研究由NIH K08 NS064094和加州大学旧金山分校（UCSF）REAC基金资助。作者感谢Nikita Derguin、Zinalda Vexler和Joel Faustino在本技术开发过程中提供的帮助。

所有动物实验均经加州大学旧金山分校动物研究委员会批准，并依照相关规范进行。 实验动物护理和使用的指南 （美国卫生与公共服务部，出版物编号85-23，1985年）。动物由经AAALAC认证的加州大学旧金山分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的兽医密切监测。获取一只8日龄幼崽的雌性Sprague-Dawley大鼠（每窝10只幼崽）。母鼠及其幼崽均提供食物和饮水 随意摄取 在中国台湾，根据IACUC方案，幼崽在温度和光照受控的动物护理设施中饲养，并每日进行环境丰富化，直至出生后10天。本操作中使用的所有外科器械均经过高压灭菌以确保无菌。手术过程中始终保持器械尖端的无菌状态。
1. 大脑中动脉闭塞
<ol>
	<li>称重幼鼠，确保其体重在正常范围内（19–21 g）。使用3%异氟烷与100%氧气混合气体对幼鼠进行麻醉2 并确保对足部夹捏无反应。使用手术台下的加热垫，将体表温度维持在35.5 °C至37 °C之间。</li>
	<li>将动物仰卧位固定，用胶带固定于肩部区域。使用无菌棉签，先用聚维酮碘溶液擦拭颈部腹侧区域，随后用双蒸水中配制的70%乙醇棉签擦拭，两种溶液交替使用，共擦拭四次。</li>
	<li>在预定切口部位局部浸润0.25%布比卡因。在体视显微镜下，于颈前正中作5至7 mm切口，暴露颈总动脉（CCA）。放置2–4个牵开器以保持术野开放并充分暴露动脉。</li>
	<li>找到颈内动脉（ICA）、枕动脉（OA）和颈外动脉（ECA）。清理动脉周围组织以获得清晰视野。注意勿损伤迷走神经。 
	注意：对于假手术组幼鼠，切口保持开放并暴露动脉后，将切口缝合关闭。总麻醉时间与闭塞手术组相当。</li>
	<li>剪取1.5 cm的6-0编织丝线缝合线。将缝合线拆解，抽出单股纤维。确保单股纤维整齐，无散开或毛边。 
	注意：如有必要，可将单链末端浸入无菌水中，再用镊子尖端整理毛糙末端，使其平滑。</li>
	<li>用45度持针钳夹住缝合线，以弧形扫动的方式移动持针钳，使其从颈内动脉（ICA）下方穿过，钳尖最终位于颈内动脉（ICA）与眼动脉（OA）之间。 
	注意：如果解剖操作得当，此步骤将相对容易。若颈内动脉（ICA）与眼动脉（OA）相互接触，使用镊子分离ICA时需小心，避免刺破动脉。若发生出血，应用镊子对动脉施加压力，直至出血停止，并用无菌棉签吸除血液。</li>
	<li>用镊子夹住缝合线的一端并轻轻拉出，使线端便于操作。松开镊子对缝合线的夹持，将镊子从颈内动脉（ICA）下方退出，动作方向与步骤1.5相反。图1A).</li>
	<li>在颈内动脉（ICA）起始处（最靠近其与颈总动脉（CCA）分叉的位置）结扎一根临时缝线。 
	注意：打结时应确保用于拆除结的线头长度适中（大于1 mm且小于3 mm），以便用镊子轻松夹住，同时保证结的另一侧留有适量的缝合线以利于回缩。</li>
	<li>小心地将颈外动脉（ICA）向侧方牵拉，并使用夹子将牵拉线固定在切口对侧腋区附近的多余皮肤上。确保该牵拉线足够紧绷，以阻断血流后再进行下一步操作，从而最大限度降低失控性出血的风险。观察动脉是否变得扁平且颜色苍白。 
	注意：切勿过度牵拉，以免导致颈内动脉部分或完全撕裂。可在切开动脉前，通过牵拉夹子对侧的线束来调整牵拉程度。</li>
	<li>使用45°镊子夹住另一根未编织的缝合线，将其环绕在颈内动脉（ICA）下方并绕其一周，如同步骤1.5所示。将此缝合线置于牵拉线的外侧图1B). 
	注意：此步骤也可在回缩前进行。若对回缩质量不确定，可在进行下一步前将此结非常松地打上。</li>
	<li>在结扎线与未结扎线之间的中点处做一切口，切口位置应稍靠近结扎线一侧，切开0.2 mm的动脉切口。 
	注意：结扎动脉中残留的血液可能通过动脉切口流出，但不应超过5 µL。若出血持续，应小心牵拉回缩线以增加回缩，注意避免因张力过大而损伤动脉。</li>
	<li>使用公制直尺测量阻塞缝线，并在再灌注时为取出阻断器预留 2–3 mm 的额外长度，剪断缝线。用 45 度角镊子夹住阻断器，用直镊在适当长度处弯折，以确保其可到达大脑中动脉（MCA），并标记推进的终止点。 
	注意：对于此体重范围内的P10 Sprague Dawley或Long Evans幼鼠，使用从硅胶头端到弯曲处10 mm的阻塞长度。</li>
	<li>使用45°止血钳，将硅胶包被的尼龙阻塞缝线插入动脉切口，并推进缝线至预设弯折处，该位置标记了到达大脑中动脉的预定距离图1C）。确保推进过程顺畅；一旦感到阻力，立即停止推进。推进过程中，将缝线方向对准颈总动脉/颈外动脉（CC/ECA）平行方向，朝向头部。 
	注意：如果缝线向背侧推进，朝向动物脊柱方向，可能会遇到翼腭动脉（PTA）。当推进3–5 mm后感到阻力时，说明缝线已触及PTA分叉处。此时应将阻断器从动脉中后退，直至硅胶头端接近动脉切口，再调整推进方向。无需将阻断器完全撤出动脉切口。</li>
	<li>使用步骤 1.10 中的线材，通过打结临时结扎固定阻断器图1D).</li>
	<li>移除牵开夹。修剪两根临时结扎线的线头，使抽拉结节以拆除结扣的一端易于用直血管钳夹住，且比用于收紧结扣的一端更长。 
	注意：引物链必须足够短，以免在封闭后于腔室内发生缠绕。</li>
	<li>移除牵开器，使用6-0编织丝线行3至4针间断缝合关闭术区。</li>
	<li>将幼崽移出麻醉环境，置于室温下的加热垫上。在幼崽恢复足够的意识以维持胸卧位之前持续监测，并确保其完全恢复后再放回母鼠身边。保持幼崽体表温度在35.5 °C至37 °C之间。</li>
	<li>在闭塞期间，可在异氟烷麻醉下采用扩散加权磁共振成像（DW-MRI）验证损伤是否被正确诱导。 图2 通过弥散加权磁共振成像检测到的tMCAO期间持续性缺血性损伤9. 
	注意：在再灌注前10–15分钟进行扩散加权自旋回波平面成像。采用以下脉冲序列参数，对整个脑部进行连续2 mm厚的冠状面扫描：TR/TE = 5,000/60 ms，信号平均次数为4次，视野 = 35 mm，数据矩阵 = 128×128，扩散梯度持续时间 = 20 ms，梯度间隔 = 29.7 ms，梯度幅度 = 70 mT/m，b值 = 1,045 s/mm²2排除表现出皮层未受累或非典型缺血性损伤（如脑干区域）的动物。</li>
</ol>
2. 再灌注
注意：阻塞持续 3 小时，以造成涉及纹状体和皮层的中至重度损伤。
<ol>
	<li>在大脑中动脉（MCA）阻塞后约 2 小时 50 分钟，使用 3% 异氟烷与 100% O2 对幼鼠进行麻醉。通过在手术台下使用加热垫，维持体表温度在 35.5 °C 至 37 °C 之间。</li>
	<li>拆除步骤 1.16 中的间断缝线，并定位由两条结扎线标记的连接处以及阻塞缝线的尾端。 
	注意：假手术动物应接受与阻塞动物相同持续时间的麻醉。再次打开切口并重新缝合关闭。对于假手术动物，继续进行步骤 2.11。</li>
	<li>通过拉动较长的一端，小心解开步骤 1.14 中先前打结的最外侧结。 
	注意：如果解结时遇到阻力，应暂停操作以确认正在拉动的是结的正确线端。若阻力持续存在，应增加放大倍数以获得更清晰的视野。解结时需格外小心，因为此步骤可能损伤动脉。</li>
	<li>将缝线从体腔中取出。</li>
	<li>在 MCA 阻塞后恰好 3 小时时，缓慢将阻塞缝线从动脉中退出。此过程应无阻力。 
	注意：大多数情况下不会出现出血。若发生少量出血，应在动脉切开部位对动脉施加压力止血。</li>
	<li>使用镊子对动脉切开部位施加压力，因为下一步将恢复颈外动脉（ICA）血流以实现再灌注。</li>
	<li>采用与步骤 2.3 相同的方法，小心解开内侧的结。</li>
	<li>将缝线从体内完全取出，并在动脉切开部位应用止血剂以停止出血。</li>
	<li>确认出血已完全停止。 
	注意：动脉恢复原有形态和红色外观，表明 ICA 血流已成功恢复。</li>
	<li>移除牵开器，并使用 3 至 4 道 6-0 编织丝线间断缝合关闭体腔。</li>
	<li>将幼鼠从麻醉中移出，置于室温空气中的加热垫上。持续监测直至其恢复足够的意识以维持胸卧位，并在完全恢复后将其送回母鼠身边。确保幼鼠体表温度维持在 35.5 °C 至 37 °C 之间。</li>
	<li>每日检查幼鼠，持续 5 天。记录其体重，并密切观察切口部位的愈合情况。在术后 7–14 天拆除缝线。如有需要，可通过 MRI 对 tMCAO 后的脑损伤进行成像9。 
	注意：动物在术后第一天体重可能减少最多 1 g，但通常无需干预即可恢复，并在第 4–5 天时体重接近对照组水平。极少数情况下，幼鼠可能出现过度体重下降或进食困难，需通过口服灌胃支持喂养 2–3 天。</li>
	<li>在出生后第 21 天（P21），可通过感觉运动行为学测试（如转棒实验或圆筒直立实验）可靠地评估脑损伤。认知功能测试可在 4–6 周龄时尽早开展，常用方法包括新物体识别实验或 Morris 水迷宫实验13。</li>
	<li>通过腹腔注射 Euthasol（50 mg/kg）处死大鼠，以获取脑组织11,12。</li>
	<li>可通过焦油紫（cresyl violet）或 H&amp;#38;E 染色对脑组织进行组织学分析，以评估损伤体积或干预措施的效果（图 3）10。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

方案中的关键步骤
首先，在从麻醉开始直至完全恢复的整个过程中，维持正常体温至关重要，因为低体温17和高体温18均已被证实会对未成熟和成熟动物脑损伤的进展产生影响。其次，在固定动物并牵拉切口时，必须进行最佳体位摆放，以便监测呼吸，并确保气管未受压迫。第三，应避免挤压或牵拉迷走神经，以免因迷走神经刺激引起心率改变。第四，由于在动脉切开术中需要牵拉颈内动脉（ICA）以控制出血，因此必须注意牵拉时的张力程度，以防损伤动脉。若因牵拉导致动脉撕裂，或动脉切口质量不佳，应将该动物排除在分析之外，因其存在出血和再灌注不良的风险。
修改与故障排除
以磁共振成像（MRI）作为引导，可优化缝线长度，以确保硅胶头端恰当地阻塞大脑中动脉（MCA），从而产生局灶性缺血。若无法获得MRI，可在再灌注前处死幼鼠，进行解剖以观察缝线位置，并根据需要调整缝线长度。幼鼠体重与阻塞所需缝线长度高度相关。可通过调整阻塞时间来改变损伤程度的严重性。
此外，缝线的形状和长度至关重要。根据我们的经验，对于体重为 19–21 g 的 P10 Sprague-Dawley 和 Long Evans 大鼠，插入长度以 10 mm 为最佳。若进一步插入阻塞缝线，可能导致大脑中动脉（MCA）穿孔。此外，每次手术中阻塞丝线形状的一致性将提高损伤模式的一致性19,20。因此，我们建议使用专为此用途制造的专业缝线。还需注意的是，由于操作技术上看似微小的差异，不同操作者之间的损伤模式可能有所不同。
该技术的局限性
在小型发育期啮齿类动物中实施该技术需要丰富的经验。若操作得当，外科医生能够在不同体型的动物中造成高度一致的损伤模式，并实现超过95%的存活率。此外，合适的外科器械至关重要。手术器械必须得到良好维护，以确保所有器械尖端能够准确贴合。
该技术相对于现有或替代方法的重要性
尽管缺氧缺血（即Rice-Vannucci模型2）最常用于研究发育中大脑的缺氧缺血性损伤，但需要注意的是，该tMCAO模型与缺氧缺血（HI）不同，其特点是存在短暂的局灶性缺血而无全身性缺氧，随后在阻塞解除、血流恢复时进入再灌注阶段。这种方法可导致更一致且可重复的损伤，且在临床转化方面更具优势，因其造成的损伤模式与足月新生儿脑卒中所见的损伤模式相似。这使得研究人员能够研究局灶性损伤模式以及未受损组织中的代偿性反应。
掌握此项技术后的未来应用
该模型类似于人类新生儿卒中最常见的病因，即围产期发生的短暂阻塞性血栓11,21。其病因尚不完全明确，极有可能是多因素所致，但在大多数情况下被认为是由来自胎盘的栓子通过所致11。此外，许多疑似围产期卒中的新生儿常表现为后期癫痫发作或轻微的局灶性神经系统检查异常22。因此，采用一种稳定且具有转化意义的损伤模型，以明确损伤进展的机制并探索可能的治疗策略，显得至关重要。

新生儿期卒中是导致死亡和残疾的重要原因，每2300例活产婴儿中就可能发生1例1。该病症可导致中枢神经系统发育异常以及长期发病率升高，包括癫痫、脑性瘫痪、智力障碍及其他类型的运动或认知功能障碍发生率增加。早期卒中的终身影响使得转化性动物模型对于研究此类人群中的损伤与修复机制至关重要，包括保护受损大脑或促进修复的策略研究。
已采用多种缺血模型来研究成年动物的脑损伤，而Rice-Vannucci（改良Levine）2方法常用于研究发育中脑组织的缺氧-缺血性损伤。相比之下，局灶性缺血-再灌注是一种独特的损伤机制，可导致局灶性损伤，其特征为存在损伤核心、半暗带以及未受损的远端脑组织。Koizumi3和Longa4模型是在成年大鼠中建立的，分别通过颈总动脉（CCA）和颈外动脉（ECA）实现短暂性大脑中动脉闭塞。在这两种模型中，对动脉分支进行永久性结扎和电凝至关重要，这有助于减少术中出血并简化手术流程，但也会对动物受伤后的摄食能力和体重增长产生不利影响。此外，未成熟脑组织具有独特的损伤机制，并表现出特定的损伤模式。
近年来，光化学血栓性脑卒中（Rose-Bengal 法）5 和永久性大脑中动脉结扎6 已被用于研究新生儿及成年脑卒中。光化学血栓性脑卒中和大脑中动脉结扎均会导致脑血流发生永久性改变，从而造成再灌注缺失。再灌注是局灶性损伤发生与发展过程中的关键环节，其伴随兴奋性毒性增强、自由基生成以及一氧化氮产量增加，进而引发延迟性细胞死亡，涉及与缺血期不同的信号转导通路7。缺氧-缺血模型则通过单侧颈总动脉永久结扎后施加全身性低氧实现，该模型在致伤机制上也不同于人类缺氧-缺血性损伤，且无法产生一致的局灶性损伤模式，使得对损伤核心区及半暗带的研究更加困难。
我们先前已描述了一种在未成熟大鼠中建立的非出血性缺血-再灌注脑卒中模型，该模型采用短暂性大脑中动脉阻塞（MCAO）方法8,9,10。该方法为微创操作，通过颈内动脉途径对大脑中动脉进行暂时性阻塞，无需永久结扎或电凝。该模型所导致的脑损伤与围产期脑卒中最常见的病因相似11,12。这种缺血-再灌注损伤模型可导致同侧纹状体及顶颞皮层受损。该tMCAO模型还可通过调节阻塞持续时间来控制损伤的严重程度。对损伤核心区与半暗带、以及未损伤的同侧和对侧脑组织中的信号通路和组织学变化进行研究，有助于进一步阐明未成熟脑组织中损伤与修复的机制。本研究将展示这一针对发育中脑组织的重要损伤模型。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td><td>麻醉剂，使用浓度为3%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三目手术显微镜</td><td>World Precision Instruments</td><td>PSMT5N</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td><td>低至中等档位</td></tr><tr><td>红外测温仪</td><td>Extech Instruments</td><td>72-5270</td><td></td></tr><tr><td>小型动物牵开器套装&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>CermaCut 剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>112522-00</td><td>2个</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2个</td></tr><tr><td>B-2 微型夹钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>00398-02</td><td></td></tr><tr><td>用于夹钳操作的持钳器</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>微型Vannas剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2 mm 刃口</td></tr><tr><td>阻断缝合线</td><td>Doccol</td><td>602123PK10</td><td>701712PK5Re</td></tr><tr><td>尺子</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>止血剂&amp;nbsp;</td><td>Avitene</td><td>DVL1010590</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Silk 反向切割缝线</td><td>Ethicon</td><td>769G</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠安乐死溶液（Euthasol）</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>0.22 mL/kg</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Henry Schein</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>实验室胶带</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr></tbody></table>

p10大鼠新生期脑卒中短暂性大脑中动脉阻塞模型

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

已有多种动物模型被用于研究未成熟和成熟大脑中的缺氧缺血性损伤、创伤性损伤、全身性缺氧或永久性缺血。中风在人类围产期较为常见，而短暂性缺血-再灌注是新生儿中风最常见的形式。再灌注阶段是损伤进展（可持续数天至数周）以及机体对损伤的内源性反应的关键组成部分。这种出生后第10天（p10）大鼠的短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型可产生单侧、非出血性的局灶性缺血-再灌注损伤，可用于研究足月儿等效脑组织中局灶性损伤与修复的机制。tMCAO所导致的损伤模式具有一致性和高度可重复性，可通过磁共振成像（MRI）或组织学分析加以确认。通过调整闭塞时间及其他将在下文讨论的方法，可调控损伤的严重程度。

tMCAO 造成的损伤严重程度高度依赖于阻塞时间和外科医生的操作经验。90 分钟的阻塞通常产生轻度至中度的损伤模式，而 3 小时则导致中度至重度的损伤。损伤严重程度可通过多种方法进行评估，包括 MRI、组织学检查或短期或长期的行为学分析。图 2 展示了在 90 分钟阻塞过程中 75 分钟时进行的 DW-MRI 示例，证实了同侧半球的缺血性损伤。弥散加权成像显示，在急性缺血期，同侧纹状体及同侧皮层的大部分区域弥散增强，而对侧无相应改变。这与涉及皮层和深部灰质的中度长期损伤程度相一致。
大脑中动脉阻塞会导致细胞死亡，轻度损伤时始于纹状体，随着阻塞时间延长和损伤加重，皮质和海马的损伤逐渐加剧。在优化手术技术（例如确定缝线插入长度）过程中，强烈推荐使用磁共振成像（MRI），因其可确认缝线位置是否正确，并可在阻塞期间可视化水肿及损伤进展。14,15,16如果无法进行 MRI 检查，H&amp;E 或焦油紫染色是简单可靠的组织学方法，可用于确定损伤形态，并可在tMCAO后早期和晚期时间点均适用。 图3 在3小时闭塞后，组织病理学检查显示同侧纹状体和皮层出现中度至重度损伤模式，表现为囊肿形成及体积增大。
通过无偏立体学方法定量分析经焦油紫染色的脑切片，计算同侧与对侧半球体积的比值，以确认同侧缺血-再灌注损伤。具体而言，使用 Euthasol 麻醉动物后，经心脏灌注 0.1 M PBS 中含 4% 多聚甲醛的固定液获取脑组织。经 4% 多聚甲醛过夜后固定并置于 30% 蔗糖溶液中平衡后，将整个脑组织以 50 µm 间隔连续切片，每隔第十二张切片被选中并贴片，随后用焦油紫染色10。
即使损伤较轻，在闭塞期间也会出现运动功能改变，例如环形行走和偏瘫。当损伤更为严重时，这些改变将在再灌注后持续存在。可采用其他行为学测试来评估损伤的严重程度，包括用于感觉运动功能评估的转棒试验或圆筒直立试验，以及用于认知功能评估的莫里斯水迷宫试验。13.
<img alt="分步展示显微血管吻合手术过程，外科缝合技术。" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 大脑中动脉阻断（tMCAO）手术的实时手术图像。 （A）第一根缝线环绕颈内动脉（ICA），如步骤1.6所述。（B）打结第一根临时结扎线并牵拉颈内动脉。第二根缝线在第一根缝线外侧环绕颈内动脉，如步骤1.9所述。（C）将涂有硅胶的阻塞缝线插入动脉切开部位，如步骤1.12所述。（D）打结第二根临时结扎线以固定阻断器位置，如步骤1.14所述。比例尺 = 1 mm。
<img alt="MRI脑部扫描序列，矢状位，动态变化，神经学研究，医学影像。" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2： 阻塞期间的MRI显示适当的单侧损伤。 在90分钟阻塞期间进行的弥散加权MRI（DW-MRI）从前至后的冠状位图像切片，显示同侧半球弥散增强（箭头），符合急性期持续发生的缺血性损伤。经《Stroke》11许可转载。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示冠状切片的脑组织学切片示意图；实验性病灶分析，5mm比例尺。" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 经大脑中动脉闭塞（tMCAO）后4周涉及纹状体和皮层的单侧损伤。 从P38动物获取的后向前排列的焦油紫染色冠状脑切片（每片50 µm），显示在P10时经历3小时tMCAO后出现较严重的损伤（箭头指示同侧囊腔形成以及皮层和纹状体体积减小）。左侧的圆形孔洞用于标识对侧半球。比例尺 = 5 mm。经《疾病神经生物学》12许可重印。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

新生儿卒中是导致早期脑损伤的重要原因，需要建立具有稳定局灶性损伤模式和高可重复性的转化模型以开展相关研究。本研究详细描述了在足月等效啮齿类动物中建立非出血性单侧局灶性缺血-再灌注损伤的手术操作步骤。

P10大鼠新生期脑卒中短暂性大脑中动脉阻塞模型

已采用多种动物模型研究未成熟脑组织中的缺氧缺血性损伤、创伤性损伤、全身性缺氧或永久性缺血……

新生大鼠短暂性大脑中动脉阻塞的总体目标是为足月新生儿中风提供一种可转化的模型。该方法通过揭示发育中大脑的损伤与修复机制，以及如何利用不同的治疗策略来调控这些过程，从而帮助解答新生儿缺血性脑损伤领域的关键科学问题。该技术的主要优势在于，它能够提供一种生理上准确的新生儿局灶性动脉缺血性中风模型，并且包含再灌注过程，而再灌注是人类新生儿脑损伤进展中的重要组成部分。该模型的可视化演示至关重要，因为这种手术的步骤可能非常难以掌握。动脉解剖结构的二维图像并不能充分展示大鼠体内复杂的三维分支结构。首先称量幼鼠体重，确保其在19至21克之间。根据批准的方案，使用吸入式异氟烷对幼鼠进行麻醉后，确保其对足部夹捏无反应。在手术台上使用加热垫以维持动物体表温度。用胶带固定动物肩部区域，使其保持仰卧位。使用无菌棉签先用70%乙醇擦拭颈前区域，随后用聚维酮碘溶液棉签擦拭。接下来，在计划切口部位局部浸润0.25%布比卡因。然后，在体视显微镜下操作，沿颈前正中做5至7毫米的切口，以暴露颈总动脉。放置两到四个牵开器，以保持术野开放并暴露动脉。接着，定位颈内动脉、枕动脉和颈外动脉。清除动脉周围的结缔组织和脂肪，以获得清晰的视野。剪取1.5厘米长的6-0编织丝线缝合线后，将缝合线拆解，抽出单股丝线。确保单股丝线整齐且无散开。用45度持针器夹住丝线，将持针器沿圆弧方向在颈内动脉（ICA）下方穿过，使持针器尖端从颈内动脉（ICA）与眼动脉（OA）之间穿出。接着，夹住丝线末端并将其拉出，以便于后续操作。松开镊子中的细线，将镊子沿原路径反向退出颈内动脉（ICA）下方。在颈内动脉起始处靠近其与颈总动脉（CCA）分叉的位置，结扎一道临时结扎线。小心地将颈内动脉向侧方牵拉，然后使用夹子将牵拉用的细线固定于切口对侧腋区附近的多余皮肤上。确保回缩的缝线足够紧绷以阻断血流后，再进行下一步操作。动脉应变得扁平且颜色苍白。使用45度角镊子夹住另一根未编织的缝线，像之前一样将其环绕于颈内动脉下方并打结。将此缝线置于牵拉缝线的外侧。然后在结扎与未结扎的结扎线之间中点处做一条0.2毫米的动脉切口，位置应稍靠近结扎侧的结扎线。接着，使用公制直尺测量10毫米长的硅胶涂层尼龙缝线作为阻断缝线。在再灌注时预留额外的2至3毫米长度以方便拆除缝线。用45度角镊子夹住阻断缝线，使用直镊子将其弯曲，标记推进的终止点。将阻断缝线经动脉切口送入，使其方向与颈外动脉平行并朝向头部。平稳推进缝线直至到达弯曲处。随后利用位于牵开缝线外侧的线束打一个临时结扎，以固定阻断缝线。移除牵开夹，然后剪除两个临时结扎的线头，保留用于拆除结扎的线头长于用于收紧的线头。移除牵开器，使用6-0编织丝线做3到4个间断缝合关闭术野。将幼鼠从麻醉状态中取出，置于室温下的加热垫上。监测幼鼠直至其恢复足够的意识以维持胸卧位，并确保其完全恢复后再将其放回母鼠身边。在闭塞期间，可采用弥散加权磁共振成像来验证是否成功诱导了损伤。这些图像显示了通过短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）期间的DW-MRI检测到的正在进行的缺血性损伤，箭头所示即为损伤区域。在大脑中动脉闭塞约2小时50分钟后，准备手术材料，然后按照之前的方法进行麻醉，开始再灌注操作。移除间断缝线，找到由两条结扎线和阻塞缝线尾端标记的分叉处。通过牵拉较长的线段，小心解开最外侧的临时结扎线的结，并将缝线从体腔中取出。在大脑中动脉阻塞后的精确三小时，缓慢将阻塞缝线退出动脉。不应有阻力。用镊子对动脉切口施加压力，然后小心地解开内侧的结以恢复血流。将缝合线从体内取出后，在动脉切口处应用止血剂以止血。动脉恢复原有的形态和红色，表明颈内动脉血流已恢复。移除牵开器，使用6-0编织丝线行3至4针间断缝合关闭术腔。将幼鼠从麻醉状态中移出，并在密切监测下使其恢复，之后放回原饲养笼中。每天检查幼鼠一次，持续五天。记录其体重，并密切观察手术切口部位的愈合情况。这些取自P-38动物的后向前50微米厚焦油紫染色冠状脑切片显示，P-10时经历三小时大脑中动脉闭塞（TMCAO）后出现较严重的脑损伤。箭头指示同侧囊肿形成以及皮层和纹状体体积减小。左侧的圆形孔洞代表对侧半球标识。在尝试此操作时，需要牢记：尽管该操作在概念上较为简单，但成功掌握可能需要数小时的优化与练习。一旦掌握，阻断操作可在10分钟内完成，而再灌注操作可在5分钟内完成。

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科研

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医学

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来源：Larpthaveesarp, A.，等．P10大鼠新生期卒中短暂性大脑中动脉闭塞模型．J. Vis. Exp.

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P10大鼠新生期脑卒中短暂性大脑中动脉阻塞模型

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