Name: 差异甲基化的测量 INS DNA种人血清中为胰岛生物标志物β细胞死亡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学习使用数字PCR技术检测人血清中差异甲基化前胰岛素DNA，作为β细胞死亡的生物标志物。该方法可在微量血清样本中实现高灵敏度定量分析，为1型糖尿病的早期诊断和及时干预提供新的研究工具。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目 UC4 DK104166（资助对象：RGM）支持。我们谨此致谢印第安纳糖尿病研究中心转化核心的协助，该中心由美国国立卫生研究院资助项目 P30 DK097512 支持。

伦理声明：研究方案经印第安纳大学机构审查委员会批准。受试者家长提供了书面知情同意，年龄超过7岁的儿童则提供了参与研究的同意书。
1. 血清处理
注意：所述检测方法已使用以下方式分离的人血清进行了严格测试。
<ol>
	<li>使用一支红色盖子的（无添加剂；未涂层）采血管采集血液。</li>
	<li>在室温下静置30分钟，使血液凝固形成凝块。</li>
	<li>在室温下以2,000 × g离心10分钟。将上清液（血清）转移至一个新的用于储存血清的试管中（聚丙烯螺口管，规格根据样本而定）。</li>
	<li>将样本储存于-80 ºC，直至进行DNA提取。</li>
</ol>
2. 血清DNA提取
注意：使用 DNA 提取试剂盒提取 DNA，建议采用 50 µl 血清，按照制造商提供的方案进行部分修改后操作。
<ol>
	<li>在微量离心管中为每个样品配制 200 µl 裂解缓冲液 + 1 µl 多聚腺苷酸（poly(A)）（5 µg）。涡旋振荡 15 秒。放置一旁，待步骤 2.3 使用。</li>
	<li>从 -80 ºC 冰箱中取出血清样品，在室温下解冻。使用磷酸盐缓冲液（PBS，含氯化钙和氯化镁）将血清样品体积补足至 200 µl。</li>
	<li>向样品中加入 20 µl 蛋白酶（1.4 Anson 单位/ml）以裂解样品，随后加入 200 µl 裂解缓冲液/多聚A混合液（来自步骤 2.2），涡旋振荡 8 秒。将样品在 56 °C 孵育 10 分钟，然后在微量离心机中以最高速度短暂离心 7 秒（&#62;10,000 x g）。</li>
	<li>向样品中加入 230 µl 100% 乙醇以沉淀 DNA，涡旋振荡 8 秒。在微量离心机中以最高速度短暂离心 7 秒（&#62;10,000 x g）。</li>
	<li>将 600 µl 样品混合物加入微型离心柱中，使 DNA 结合至柱上。在 6,000 x g 条件下离心 1 分钟。弃去穿流液，将离心柱放入新的干净离心管中。</li>
	<li>向柱中加入 500 µl 洗涤缓冲液 1，洗涤 DNA。在 6,000 x g 条件下离心 1 分钟。弃去穿流液，将柱放入新的干净离心管中。向柱中加入 500 µl 洗涤缓冲液 2，在最高速度（&#62;10,000 x g）下离心 3 分钟。将柱转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，再次以最高速度离心 1 分钟。</li>
	<li>将离心柱放入新的 1.5 ml 微量离心管中，直接在滤膜上加入 60 µl 洗脱缓冲液，以洗脱 DNA。为防止交叉污染，不同样品间必须更换吸头。室温孵育 5 分钟，然后在 6,000 x&#160;g 条件下离心 1 分钟。再加入 60 µl 洗脱缓冲液，在 6,000 x g 条件下离心 1 分钟。&#160;</li>
	<li>将 DNA 储存于 -20 ºC 以备后续使用，或立即进行亚硫酸氢盐转化。</li>
</ol>
3. 亚硫酸氢盐转化
注意：使用亚硫酸氢盐转化试剂盒进行亚硫酸氢盐转化，遵循生产商的方案并稍作修改。
<ol>
	<li>为将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，向一个PCR管（单个0.2 ml PCR管或8联排PCR管）中步骤2.7所得的20 µl DNA中加入130 µl亚硫酸氢盐转化试剂。将剩余的40 µl DNA保存以备后续使用，或用于重复反应。通过上下吹打20次混匀，并短暂离心以确保管壁或管盖上无液滴残留。将反应体系置于水浴或PCR仪中孵育，程序如下：98 °C孵育8分钟，54 °C孵育60分钟，4 °C孵育5分钟。
	<ol>
		<li>继续进行步骤3.2，或将样品在4 °C保存最多20小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向离心柱中加入600 µl结合缓冲液，并将该柱放入所提供的收集管中。将经亚硫酸氢盐处理的DNA样品加入柱中，通过上下吹打10次混匀。在最大转速（&#62;10,000 x g）下离心30秒，弃去穿流液。</li>
	<li>向柱中加入100 µl洗涤缓冲液以洗涤DNA，在最大转速（&#62;10,000 x g）下离心30秒。</li>
	<li>为完成未甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的最终转化，向柱中加入200 µl脱磺酸化缓冲液以去除磺酸基团。室温静置20分钟，然后在最大转速（&#62;10,000 x g）下离心30秒。</li>
	<li>向柱中加入200 µl洗涤缓冲液，全速离心30秒。弃去穿流液，并重复此洗涤步骤一次。</li>
	<li>将柱转移至一个1.5 ml微量离心管中。通过直接向柱膜加入10 µl洗脱缓冲液来洗脱DNA。孵育1分钟。在全速下离心30秒以洗脱DNA。使用分光光度法在A260处定量回收的DNA。 
	注意：分光光度法检测到的DNA主要为步骤2.3中添加的载体多聚A（polyA）DNA。通常，polyA的回收率≥输入量的85%（&#62;4.25 µg）。</li>
	<li>将DNA在-20 °C保存，直至准备进行数字PCR分析。</li>
</ol>
4. 多重数字PCR
<ol>
	<li>配制主混合液，确保每份样本和对照组均有足够的溶液。至少应包含一个加水的样本（阴性对照）、一个含有未甲基化INS质粒的样本（1 pg，阳性对照）、一个含有甲基化INS质粒的样本（1 pg，阳性对照），以及一个等量混合两种质粒的样本。
	<ol>
		<li>配制PCR主混合液时，每反应加入12.5 µl PCR缓冲液（例如，10个样本共需125 µl），每反应加入1.25 µl引物/探针混合液（例如，10个样本共需12.5 µl），每反应加入8.25 µl水（例如，10个样本共需82.5 µl），每反应加入0.5 µl EcoR1酶（例如，10个样本共需5 µl）。 
		注：此处使用的引物和探针序列如下：上游引物：5'-GGAAATTGTAGTTTTAGTTTTTAGTTATTTGT-3'；下游引物：5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'；FAM探针：FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB；VIC探针：VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在96孔板中设置多重PCR反应。向每个孔中加入19.5 µl主混合液，再向相应孔中加入2.5 µl亚硫酸氢盐转化后的DNA样本（剩余7.5 µl亚硫酸氢盐转化DNA可保存或用于重复反应）。通过反复吹打数次混匀。 
	注：每行的8个孔必须全部加入样本或缓冲液对照。</li>
	<li>使用封板机以铝箔密封，并在板式离心机中离心，直至孔壁无液体残留。</li>
	<li>在触摸屏上设置自动液滴生成仪。 
	注：芯片上的所有8个孔必须包含样本或缓冲液对照。
	<ol>
		<li>通过点击第4.2步中96孔板上已加载样本的行来设定所用行数，并将该行高亮为蓝色，表示为激活行。</li>
		<li>为避免污染，按从后到前的顺序装载耗材。首先将芯片装入仪器的后部行，再将吸头装入仪器的中间行。 
		注：芯片只能以正确方向插入支架中。</li>
		<li>将96孔板放入仪器中。从-20 °C冰箱中取出冷块，并将新的带裙边96孔板放入其中，然后将其放置在仪器内，紧邻已加载样本的96孔板。</li>
		<li>向仪器前端的分配器中加入油，并在触摸屏上选择油的类型。</li>
		<li>点击蓝色启动按钮开始运行。确认板设置后，点击“开始运行”按钮以启动程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行完成后，取出含有新生成液滴的96孔板，并使用封板机以铝箔密封。</li>
	<li>在热循环仪上进行PCR10扩增，程序如下：95 °C预变性10:00 min；40个循环：94 °C变性00:30 min，57.5 °C退火01:00 min；98 °C延伸10:00 min；12 °C保存10 min或最长24小时。</li>
	<li>将板放入液滴读取仪中，并设置读取参数。
	<ol>
		<li>点击“设置”选项卡。通过点击模板 &#62; 新建，创建一个新模板，并输入文件名。</li>
		<li>使用孔板编辑器为每个样本设置参数。为每个样本命名，实验类型设为稀有事件检测（R-RED），主混合液选择第4.1步中使用的混合液。</li>
		<li>为目标1命名（例如，未甲基化），并将目标1设为未知（U）；为目标2命名（例如，甲基化），并将目标2设为参考（R）。</li>
		<li>点击“运行”选项卡以开始运行。在运行选项窗口中，选择检测化学类型（FAM/VIC）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>在分析标签页中打开结果，并基于阳性对照使用二维图进行分析（见图1）。</li>
	<li>将液滴读取仪生成的CSV文件导出至电子表格程序以进行数据分析。</li>
	<li>为计算血清中每微升的拷贝数&#34;copies per µl&#34;，使用公式：(浓度 × 250) / (用于DNA提取的血清体积，单位为 µl)。6 
	注意：从人血清获得的数据通常转换为log10值，以确保数据呈正态分布。或者，数据也可在log10刻度上作图，并采用非参数统计方法进行分析。</li>
</ol>
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</style>

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<li>Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+methylation-specific+polymerase+chain+reaction+method+for+monitoring+beta+cell+death+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes.</a> PloS One. 7 (10), 47942(2012).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

DNA甲基转移酶介导的胞嘧啶甲基化可在多个基因中实现转录的表观遗传调控。人类INS基因几乎仅在胰岛β细胞中表达，且INS基因中胞嘧啶的甲基化频率与其转录沉默之间存在相关性11。因此，大多数细胞类型的INS基因在多个胞嘧啶位点的甲基化频率均显著高于β细胞11-13。已有研究提出，可通过检测血清中游离的未甲基化INS DNA水平来监测β细胞死亡的发生情况，因为这些未甲基化DNA主要来源于死亡β细胞所释放的DNA12。
亚硫酸氢盐反应将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变14。因此，对经亚硫酸氢盐转化的DNA进行测序或PCR分析，可确定原始胞嘧啶是否被甲基化。基于染料的甲基化特异性PCR技术利用引物与模板之间因3'端碱基错配导致的PCR扩增效率差异，从而在DNA经亚硫酸氢盐转化后区分未甲基化与甲基化的胞嘧啶15。因此，在早期针对1型糖尿病（T1D...

1型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，其特征是胰岛素生成性胰岛β细胞被自身反应性T细胞破坏1。T1D的诊断通常基于对体型偏瘦的年轻个体进行高血糖（血糖浓度&#62; 200 mg/dl）的检测，患者可能表现出酮症酸中毒，提示胰岛素缺乏。在T1D确诊时，已有证据表明β细胞功能和质量显著丧失（达50–90%）2。在临床研究中，多种在诊断时即开始使用的免疫调节药物可使β细胞功能（以及可能的质量）趋于稳定，但尚无任何药物可实现疾病的临床缓解。这一结果促使人们呼吁开发用于早期发现疾病以及纵向追踪联合治疗效果的生物标志物3,4。国际协作组织（如美国国立卫生研究院下属的人类胰岛研究网络联盟5）已强调，亟需开发聚焦于T1D中β细胞应激与死亡的生物标志物。
与这些努力一致，我们研究团队及其他团队近期开发了生物标志物检测方法，用于检测主要来源于死亡β细胞的循环中表观遗传修饰的DNA片段6-9。迄今为止已发表的所有检测方法均聚焦于定量编码前胰岛素原的人类基因（INS），该基因在编码区和启动子区域的CpG位点未甲基化程度高于其他细胞类型。未甲基化的INS DNA片段的释放被认为主要来源于死亡（坏死性或凋亡性）的β细胞。我们近期的研究表明，在青少年中，新发1型糖尿病（T1D）患者在转录起始位点上游-69 bp位置处的未甲基化和甲基化INS DNA水平均升高，二者联合可作为该人群特异性的生物标志物6。这些生物标志物检测方法包括：使用商用离心柱试剂盒从血清或血浆中分离游离DNA，随后对分离得到的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理（将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变）。
在本报告中，我们描述了血清样本采集、从血清中分离游离细胞DNA、亚硫酸氢盐转化以及针对差异甲基化的INS DNA进行微滴数字PCR（以下简称数字PCR）的技术细节。

<table><tbody><tr><td>红色头盖真空采血管&amp;nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>无添加剂，内壁未涂层，10 ml</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>聚丙烯材质，螺旋盖，任意规格</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>多聚腺苷酸 [Poly(A)]</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>溶于 TE 缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA）至 5 &amp;micro;g/&amp;micro;l&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无水乙醇（200 证明度）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>含 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的 DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 8联管</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8联管凸顶盖</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA 甲基化-快速试剂盒</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>探针用 ddPCR 超混合液（不含 dUTP）</td><td>Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>探针用缓冲对照</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>人非甲基化/甲基化引物/探针混合物</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>半裙边 96 孔 PCR 板，twin.tec 品牌</td><td>Eppendorf</td><td>951020346</td><td></td></tr><tr><td>可穿刺铝箔热封膜</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR 板封膜仪</td><td>Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG 微滴数字 PCR 系统</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>探针用自动微滴生成油</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>自动微滴生成仪用 DG32 芯片</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>自动微滴生成仪用移液器吸头</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>自动微滴生成仪用移液器吸头盒</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch 梯度 PCR 仪</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 微滴读取仪</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 微滴读取仪用油</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

人血清样本中差异甲基化ins dna 物种的检测作为胰岛β细胞死亡的生物标志物

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

胰岛β细胞的死亡被认为是几乎所有类型糖尿病发病机制的基础，并且发生在明显高血糖出现之前，尤其是在1型糖尿病中。开发敏感且可靠的β细胞死亡生物标志物，可能有助于早期进行治疗干预，以预防或延缓糖尿病的发生。最近，包括我们研究组在内的多个团队报道，循环中游离的、差异甲基化的编码前胰岛素原（INS）的DNA与1型糖尿病前期及新发1型糖尿病中的β细胞死亡相关。本文中，我们提供了一种使用数字PCR逐步检测游离INS DNA的实验方案，该DNA在转录起始位点上游-69 bp处的胞嘧啶具有差异甲基化状态。我们证明，该检测方法能够区分-69 bp位点处甲基化与非甲基化的胞嘧啶，具有多个数量级的线性范围，可对DNA拷贝数进行绝对定量，并可用于新发1型糖尿病患者和无疾病对照个体的人血清样本分析。此处描述的方案可适用于任何需要检测差异甲基化胞嘧啶的DNA分子，无论其来源于循环系统还是分离的细胞与组织，并可实现对DNA片段的绝对定量。

为了正确解读数据，我们在每次数字PCR实验中均使用质粒对照，分别对应未甲基化的和甲基化的靶标INS DNA。这些对照可确保甲基化和未甲基化DNA对应的信号能够被清晰区分。图1展示了含有经亚硫酸氢盐转化的未甲基化INS DNA质粒对照（图1A）、甲基化INS DNA质粒对照（图1B）以及两种质粒1:1混合物（图1C）的液滴二维散点图。含有未甲基化INS的质粒由对6-羧基荧光素（FAM）信号呈阳性的液滴指示，而含有甲基化INS的质粒则由对VIC信号呈阳性的液滴指示。在1:1质粒混合物中，可观察到一群双阳性液滴，对应于同时含有两种DNA分子的液滴。为了区分阳性液滴与阴性液滴，需利用这些二维图进行数据设门。请注意，在图1A中，FAM阳性液滴在VIC通道中出现轻微偏移，表明针对甲基化INS DNA的探针对未甲...

胰岛β细胞死亡发生在1型糖尿病发病之前，检测这一过程可能有助于早期进行治疗干预。本文详细描述了如何测定人血清中胰岛素基因（INS）不同甲基化DNA序列，作为β细胞死亡的生物标志物。

人血清样本中差异甲基化INS DNA 物种的检测作为胰岛β细胞死亡的生物标志物

胰岛β细胞的死亡被认为几乎存在于所有类型糖尿病发病机制的基础，并且先于明显糖尿病的发生……

本实验的总体目标是测量人血清中不同甲基化的前胰岛素原DNA种类，作为β细胞死亡的生物标志物。该方法有助于回答糖尿病领域的一些关键问题，例如，在1型糖尿病发展过程中的某一特定时间点是否发生了β细胞死亡？该技术的主要优势在于，通过使用数字PCR，我们能够在极少量血清样本中定量检测β细胞死亡的程度。根据文本方案从人血样本中收集血清后，在微量离心管中为每个样本配制 200 微升裂解缓冲液和 1 微升聚腺苷酸化酶（poly(A)）。涡旋振荡管子 15 秒。从 -80 摄氏度冰箱中取出血清样本，并在室温下解冻。然后，使用 PBS 将血清样本体积补至 200 µL。加入 20 µL 蛋白酶和 200 µL 裂解缓冲液 poly(A)mix 以裂解样本。涡旋振荡管子 8 秒，将样本在 56 °C 下孵育 10 分钟。然后，以最高速度离心试管7秒。通过向样品中加入230 µL 100%乙醇沉淀DNA，并涡旋振荡试管8秒。然后，再次以最高速度离心试管7秒。接下来，将600 µL样品混合物加入离心柱中，并在6000 ×g 条件下离心1分钟。弃去穿流液，将离心柱置于干净的收集管中。向离心柱中加入500 µL洗涤缓冲液一，在6000 ×g 条件下离心1分钟。然后，弃去流穿液，将柱子放入干净的离心管中。向柱子中加入 500 µL 洗涤缓冲液二，以最高速度离心 3 分钟。接着，将柱子转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，再次离心 1 分钟。为了洗脱DNA，将柱子放入新的1.5毫升微量离心管中，并直接向滤膜上加入60微升洗脱缓冲液。室温孵育5分钟后，以6000 × g离心1分钟。弃去柱子，保存样品直至进行亚硫酸氢盐转化。为了将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，向PCR管中的20微升DNA中加入130微升亚硫酸氢盐转化试剂。通过上下吹打20次混匀样品，并短暂离心以确保管壁和管盖上没有液滴残留。按照所示条件，将样品置于水浴锅或PCR仪中孵育。将离心柱放入提供的收集管中，并向离心柱中加入600 µL结合缓冲液。将经亚硫酸氢盐处理的DNA加入柱中，用移液器上下吹打10次以混匀。然后将样品以最高速度离心30秒，并弃去穿流液。接下来，向柱中加入 100 µL 洗涤缓冲液，离心 30 秒。然后，为去除亚硫酸盐基团，完成未甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的转化，向柱中加入 200 µL 脱磺酸化缓冲液。室温静置 20 分钟后，将柱离心 30 秒。向柱中加入200 µL洗涤缓冲液，以8,000 × g离心30秒，洗涤DNA。随后弃去流出液，并重复洗涤步骤一次。将柱放入1.5 mL微量离心管中，通过直接向柱膜加入10 µL洗脱缓冲液洗脱DNA。将样品孵育1分钟，然后离心30秒以洗脱DNA。弃去层析柱，保存样品。在260纳米波长下通过分光光度法测定回收DNA的浓度。配制主混合液，确保每份样品和对照组均有足够的溶液。主混合液需至少包含一个含有水的样品、一个含有未甲基化胰岛素的质粒样品，以及一个等量混合质粒的样品。在96孔板中建立多重PCR反应，首先向每个孔中加入19.5 µL主混合液。将2.5 µL的亚硫酸氢盐转化后的DNA样本加入相应的孔中。然后通过反复吹打数次使孔内液体充分混匀。使用铝箔和酶标板封板膜密封酶标板，并在板式离心机中离心，直至孔壁无液体残留。在触摸屏上设置自动液滴生成器时，通过点击样品所加载的孔板孔位来设定所使用的行数。为避免污染，请按照从后到前的顺序加载耗材，首先安装仪器后排行的试剂盒，然后将吸头装入中间行。接下来，将96孔板放入仪器中。然后，从-20摄氏度冰箱中取出一个冷冻块，将一个新的带裙边96孔板放入其中。将装有孔板的冷冻块放入仪器中，放置在样品孔板旁边。在仪器前方的加样器中加入油，并在触摸屏上选择油的类型。点击蓝色的“开始”按钮以启动运行。然后，确认板的设置，点击“开始运行”按钮以开始实验。运行结束后，取出含有新形成液滴的96孔板，并使用板封膜机用铝箔密封。现在，使用以下程序在热循环仪中进行PCR。将板放入液滴读取仪中，并通过点击“设置”选项卡来配置读取仪。然后，通过点击“模板新建”来创建一个新模板。使用孔板编辑器为每个样本设置参数，并为每个样本指定一个唯一的名称。将实验设置为稀有事件检测，并将主混合液设为用于制备反应的混合液。为靶标1命名，例如“未甲基化”，并将靶标1设为未知样本（U）。为靶标2命名，例如“甲基化”，并将靶标2设为参考样本（R）。点击“运行”选项卡以开始运行，并输入文件名。然后，在“运行选项”窗口中选择检测化学体系。为了分析数据，在“分析”选项卡中打开结果，并基于阳性对照使用二维图来分析数据。该图显示了对应于质粒对照液滴的二维散点图，其中包括经亚硫酸氢盐转化的未甲基化胰岛素DNA、甲基化胰岛素DNA，以及两种质粒等比例混合物。请注意，此图中FAM阳性液滴在VIC通道中出现轻微偏移，表明该信号来自甲基化胰岛素DNA的探针。类似地，VIC阳性液滴在FAM通道中出现轻微偏移，表明针对未甲基化DNA的探针与甲基化DNA之间存在交叉反应。为验证引物的线性关系，PCR反应中使用了两种质粒在多个数量级范围内的混合物。如图所示，在固定量的第二种质粒存在下，可对一种质粒的不同浓度实现线性检测。本图中分析了四位新发1型糖尿病患者和四位无1型糖尿病的对照个体的样本。数据显示，与对照组相比，1型糖尿病患者的未甲基化和甲基化胰岛素DNA水平均升高，这与先前研究结果一致。若操作熟练，该技术可在8小时内完成30个样本的检测。在进行该实验操作时，重要的是要牢记在所有步骤中避免污染。该技术建立后，为糖尿病领域的研究人员探索将其作为1型糖尿病发生标志物的应用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过检测人血清游离DNA中未甲基化和甲基化的前胰岛素原来确定β细胞死亡的程度。请注意，使用DNA提取缓冲液可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取预防措施，例如佩戴手套和实验服，并避免使用含漂白剂的消毒剂。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

差异甲基化的测量<em&gt; INS</em&gt; DNA种人血清中为胰岛生物标志物β细胞死亡

细胞介导的淋巴细胞毒性（CML）实验可用于检测自身反应性应答，并在体外研究细胞死亡机制。然而，结合活细胞共聚焦显微镜成像技术与荧光染料，可更详细地研究细胞死亡的类型、动力学特征以及所涉及的信号通路。...

评估细胞毒性T淋巴细胞介导的β细胞死亡的方法

本视频展示了人血清中胰岛自身抗体的电化学发光检测。血清中的抗体将钌标记的抗原与生物素化的捕获抗原连接，形成复合物，通过电化学发光测定进行检测。...

使用电化学发光法检测人胰岛自身抗体

激光显微切割技术能够从微量的实质组织中分离特定细胞。本文描述了一种从手术标本中获取人胰腺胰岛用于转录组学研究的实验方案。该方案可增强人β细胞固有的自发荧光，从而便于其收集。...

改进的人类胰岛手术标本激光显微切割操作方案

本文介绍了一种从2型糖尿病小鼠模型Leprdb中分离胰岛的实验方案，以及一种利用双光子显微镜检测完整胰岛活细胞胰岛素分泌的实时细胞检测方法的详细步骤。...

Leprdb 小鼠2型糖尿病模型：胰岛分离与完整胰岛的活细胞双光子成像

本文介绍了使用电化学发光（ECL）检测法检测人胰岛自身抗体的方法。该方案可用于预测1型糖尿病，也可拓展用于检测其他自身免疫性疾病的自身抗体。...

人胰岛自身抗体的电化学发光检测法

离体胰岛研究对糖尿病研究具有重要意义。目前用于研究在天然三维结构中培养的胰岛的技术耗时长、效率低，且很少被使用。本研究介绍了一种简单、高效的新方法，可用于制备高质量的全培养胰岛石蜡切片。...

胰岛组织石蜡切片包埋

本文介绍了一种利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，从分离的人胰岛中生成高质量、大规模单细胞转录组数据的实验方案。...

单细胞RNA测序及人胰岛分析

本研究利用基于多染色荧光的细胞死亡和凋亡标志物，结合共聚焦显微镜技术，评估细胞因子诱导的凋亡及胰岛β细胞特异性死亡，揭示细胞对外源性刺激所引发的细胞死亡与凋亡在空间和时间上的动态变化。...

分离胰岛的处理与凋亡检测

在此，我们描述了用于并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外...

平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

本文介绍一种相对快速且简便的方法，用于绘制哺乳动物全基因组复制时间图谱，涵盖从细胞分离到测序结果基础分析的全过程。按照本方案操作后，将获得一份代表性复制程序的基因组图谱。...

通过DNA含量测定进行哺乳动物全基因组复制时间的确定

学习使用数字PCR技术检测人血清中差异甲基化前胰岛素DNA，作为β细胞死亡的生物标志物。该方法可在微量血清样本中实现高灵敏度定量分析，为1型糖尿病的早期诊断和及时干预提供新的研究工具。

人血清样本中差异甲基化INS DNA 物种的检测作为胰岛β细胞死亡的生物标志物

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