Name: 高通量，实时，细胞内的抗菌活性的双读出测试和真核细胞的细胞毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习高通量实时双读出检测技术，用于筛选穿透真核细胞的抗菌化合物并同时评估细胞毒性。该方法可同时检测细菌生长与哺乳动物细胞毒性，助力细胞内病原体感染治疗研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本手稿中报道的研究由美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所资助，项目编号为R01AI099122，授予J.E.K.。本内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。我们谨向ICCB-Longwood筛选中心和/或新英格兰生物防御与新发传染病区域卓越中心国家筛选实验室（由U54AI057159资助）的Jennifer Smith、David Wrobel、Su Chiang、Doug Flood、Sean Johnston、Jennifer Nale、Stewart Rudnicki、Paul Yan、Richard Siu和Rachel Warden致以诚挚感谢，感谢他们在高通量筛选实验的开发与实施过程中提供的帮助。我们还要感谢Kenneth P. Smith对手稿提出的有益意见。

1. 实时细胞内生长及真核细胞毒性检测
<ol>
	<li>准备宿主细胞（J774A.1 细胞）
	<ol>
		<li>培养 J774A.1 Mus musculus 悬浮于含9%补铁小牛血清的RPMI 1640中的巨噬细胞样细胞。最初在组织培养瓶中传代。当细胞在75 cm²培养瓶中达到汇合后2 组织培养瓶中加入15 ml培养基，通过刮取并稀释至65 ml同种培养基进行传代，其中15 ml重新加入组织培养瓶，50 ml转移至250 ml细菌摇瓶。</li>
		<li>扩大培养时，将细胞悬浮培养于250 ml和/或1,000 ml的细菌培养瓶中，培养瓶中组织培养基的体积填充至其总容量的五分之一。通过将转速设定为约120转/分钟进行通气。为保证稳定的生长状态，于精确5% CO₂条件下培养2 和 37 °C.</li>
		<li>当细胞密度达到 2.5 x 10 的范围时收获细胞6 细胞/ml 至 5 × 106 细胞/ml。确保死细胞比例（最简便的方法是通过台盼蓝染色检测）不超过25%，因为死细胞会增加细胞毒性检测中的背景噪音。</li>
		<li>白色，组织培养处理的384孔微孔板，5 × 104 J774A.1 细胞在 30 µl 每孔加入组织培养基。将微孔板孵育过夜，使实验当天细胞融合度达到90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备发光或荧光标记物 Legionella pneumophila
	<ol>
		<li>通道 L. pneumophila (Lp02::flaA::lux8在适当的培养基上培养细菌， 即，缓冲活性炭酵母提取物（BCYE）培养基。若使用胸腺嘧啶营养缺陷型菌株，需在培养基中添加 100 µg/ml 胸苷。通过将菌体浓密涂布于新的BCYE平板上，培养一天（若来自前次传代的平板）或两至三天（若来自冻存菌种），以获得融合生长的菌斑，用于实验。
		<ol>
			<li>通过溶解 10 g 酵母提取物、10 g N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸，0.35 g K2HPO4，以及 1 g 单碱基钾 α-酮戊二酸盐溶于 950 ml 去离子水中。用氢氧化钾（≥2.5 ml 的 11.9 摩尔溶液）调节 pH 至 6.9。</li>
			<li>加入15 g琼脂和2 g活性炭，加水至终体积1 L。加入磁力搅拌子后高压灭菌。将培养基冷却至 55 °C 加入经滤膜除菌的溶液，其中含0.4 g L-半胱氨酸和0.42 g 柠檬酸铁铵，溶于去离子水中。倾注培养皿前使用磁力搅拌器充分混匀。</li>
			<li>用于检测 L. pneumophila 在无菌培养基中培养时，通过混合用于BCYE培养基的所有化学试剂（除活性炭和琼脂外）制备ACES-酵母提取物肉汤（AYE）。过滤除菌后立即使用，或冷冻保存以备后续实验。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用与J774A.1细胞相同的组织培养基重悬生物体 100 µg/ml 根据需要补充胸腺嘧啶核苷。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>巨噬细胞感染
	<ol>
		<li>加入目标测试化合物（筛选化合物，以及用于细菌生长抑制和真核细胞裂解的阳性和阴性对照）。建议将储备液以 DMSO（二甲基亚砜）或水溶液溶解至 ≥500 倍浓度，以便对溶剂进行充分稀释。
		<ol>
			<li>尽管储备液可冷冻保存，但应避免对不稳定的化合物和抗菌剂进行反复冻融。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将发光细菌稀释至目标浓度 2.5 x 106 CFU（菌落形成单位）/m 和荧光报告基因标记的细菌至 1.0 × 107 组织培养基中的菌落形成单位（CFU/ml），加入适量无毒、膜不渗透性、可结合核酸的染料，终浓度为检测浓度的2.5倍。</li>
		<li>添加 20 µl 向每孔 J774A.1 培养孔中加入混合液，终体积 50 µl，最终细菌浓度为 1 x 106 CFU/ml（lux操纵子报告系统）或4 × 10¹⁰6 CFU/ml（荧光蛋白报告基因）.</li>
		<li>孵育于 37 °C 在5% CO中培养1-3天2 在100%相对湿度条件下，以防止蒸发边缘效应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测读数
	<ol>
		<li>根据所使用的报告系统，选择合适的微孔板发光检测仪或荧光计检测细菌生长和真核细胞毒性。
		<ol>
			<li>为避免温度相关的边缘效应，在进行发光检测前，将微孔板单层放置于实验台面上并微开盖子，使其热平衡约20分钟（或置于生物安全柜中去盖平衡约10分钟）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>如果需要在后续时间点进行实时读数，请将微孔板放回培养箱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 数据分析
<ol>
	<li>将数据归一化至阳性和阴性对照，以计算细胞内细菌生长的抑制百分比或抑制倍数，以及真核细胞的细胞毒性百分比。</li>
	<li>为评估检测的稳健性，使用Z因子（Z'）分析法计算细菌生长抑制和细胞毒性实验中阳性和阴性对照之间的统计分离度，其中Z' = 1 - 3(σp + σn)/|µp + µn|。在该公式中，σp 和σn分别为阳性对照孔和阴性对照孔的标准差；µp和µn分别为阳性对照孔和阴性对照孔的平均值。
	<ol>
		<li>对于高通量筛选实验，可计算标准z分数（或其他替代的定量统计指标）以评估目标测试化合物的作用效果。或者，也可计算简单的减少倍数或对数减少倍数，作为对几何级数增殖细菌效应强度更具生理相关性的衡量指标。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单维与多维（即协同作用）剂量-反应测试与数据分析解读
<ol>
	<li>按照第1个方案部分所述，准备巨噬细胞和细菌。</li>
	<li>在感染或无菌孵育前，将实验所需的抗菌剂以连续倍比稀释系列加入，目标是在高浓度端覆盖能够完全抑制生长的浓度（即， 最低抑菌浓度（MIC）以及较低浓度下无明显活性的范围。</li>
	<li>使用自动化液体处理系统，根据制造商方案，通过直接、自动添加抗菌剂稀释液，辅助完成单药剂量反应及联合用药协同作用测试的建立。</li>
	<li>可考虑使用亚倍比稀释法，例如 <img alt="平方根符号数学方程图解，用于教学，公式可视化，科研分析" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1">-倍稀释系列及检测重复，以提高数据的准确性和可重复性。</li>
	<li>用于巨噬细胞感染时，将发光细菌稀释至目标浓度为 2.5 x 106 组织培养基中的菌落形成单位（CFU）/ml。添加 20 µl 向每孔 J774A.1 培养孔中加入混合液，终体积 50 µl，最终细菌浓度为 1 × 106 CFU/ml；并在 37 °C 在5% CO₂中2 在100%相对湿度下。
	<ol>
		<li>用于无菌生长测试时，将发光细菌稀释至终浓度为 1 x 106 在 AYE 培养基中，加入 CFU/ml 50 µl 向384孔板的每孔中加入，并在 37 °C 在5% CO₂中2 在100%相对湿度下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算抑制细菌生长的抗菌药物组合的分数抑制剂浓度指数。针对产生完全或部分抑制效果的组合中的每种药物（a, b, . . n），分别计算其分数抑制剂浓度 &gt;99% 细菌生长抑制率，计算各自的最低抑菌浓度分数（FIC）a, b, . . n.）如下：FICa = 化合物“a”的浓度除以“a”单独作用时的最小抑制浓度。. 使用相同的公式计算 FICb, 等等。 然后计算联合FIC指数或 <img alt="静态平衡，ΣFx=0 方程，用物理符号阐释平衡概念。" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"> FIC = FICa + FICb + . . .FICn 针对每种抑制性组合。
	<ol>
		<li>使用与1.0偏差最大的组合指数来评估协同作用。将≤0.5的阈值视为协同效应的保守判断标准，≥4则视为拮抗效应。12</li>
		<li>绘制等效图、等高线等效图和/或等值面等效图6 作为组合效应的替代性图示方法。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Garzoni, C., Kelley, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%3A+new+evidence+for+intracellular+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.</a> Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).</li>
<li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li>
<li>Blango, M. G., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+face+of+multiple+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+impermeant%2C+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).</li>
<li>Edelstein, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+chemotherapy+for+legionnaires%27+disease%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review.</a> Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Intracellular+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).</li>
<li>Pedro-Botet, L., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella%3A+macrolides+or+quinolones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Legionella: macrolides or quinolones?</a> Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).</li>
<li>Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+Legionella+pneumophila+growth+in+macrophages+requires+the+concerted+action+of+cytokine+and+Naip5%2FIpaf+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).</li>
<li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+intravital+imaging+of+cellular+differentiation+with+a+bright+red-excitable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein.</a> Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).</li>
<li>Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEliopoulos%2C+GM+%22Antimicrobial+combinations.+In%3A+Antibiotics+in+Laboratory+Medicin%22">Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin</a>. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).</li>
<li>Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+direct+compound+dispensing+method+using+the+HP+D300+digital+dispenser%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser.</a> J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+antagonism%2C+and+what+the+chequerboard+puts+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+intracellular+targeting+properties+associated+with+mutations+in+the+Legionella+pneumophila+dotA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene.</a> Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).</li>
<li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).</li>
<li>Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Legionella pneumophila.</a> Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).</li>
<li>Kirby, J. E., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+the+pore+macrophage+and+the+legion+of+terror+within%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within.</a> Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).</li>
<li>Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+pore-forming+ability+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279 (5352), 873-876 (1998).</li>
<li>Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Effects+of+Tetracycline+Analogues+%28Doxycycline%2C+Minocycline+and+COL-3%29+in+Acute+Myeloid+Leukemia+HL-60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells.</a> PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).</li>
<li>Isberg, R. R., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+genetic+locus+encoded+by+Yersinia+pseudotuberculosis+permits+invasion+of+cultured+animal+cells+by+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.</a> Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Chem+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
<li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+trends+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).</li>
<li>Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunlap%2C+P+%22Bioluminescence%3A+Fundamentals+and+Applications+in+Biotechnology+-+Volume+1%22">Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1</a>. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了用于同时检测细胞内细菌生长和宿主细胞毒性的实时检测方法。该实验方案包含若干关键步骤。首先，为了确保检测的稳健性，细菌信号与细胞毒性读数之间必须具有足够的光谱分离度。对于荧光素酶操纵子报告系统与荧光DNA结合染料的组合而言，这种分离度是其固有特性。然而，根据我们的经验（表1-3，图2），若采用双荧光读数方式，则需要荧光信号互不重叠（例如，使用远红光荧光蛋白报告系统与绿色核酸染料），才能获得稳健的基于溶液的检测数据。此外，基于以往经验，可能与检测仪器的光学配置或溶液中荧光特性有关，只有发射绿光或橙光的DNA染料才能提供可用的细胞毒性数据，即 Z'值大于&#62;0.5，该数值是检测性能良好的指标。4 因此，基于溶液的双读数检测方法在可用的报告系统选择上存在一定限制。
另一个关键步骤是感染细菌与巨噬细胞的比例。细菌感染会诱导宿主细胞死亡。因此，过高的接种量可能导致宿主细胞过早死亡、细菌复制水平相对较低，并可能掩盖所研究抗菌药物的直接细胞毒性效应。合适的感...

在细胞内区室中生长或暂时寄居的病原体难以通过治疗手段彻底清除。嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）、布鲁菌属（Brucella spp.）、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）以及分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）等专性或相对专性的胞内病原体，通常需要长期使用抗菌药物治疗，疗程可能从数月到数年不等。此外，某些胞外病原体也可能短暂占据细胞内生态位，借此逃逸常规抗菌治疗的清除作用，并在后期重新出现，引发新一轮的致病性感染。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus1）和尿路致病性肠杆菌科细菌（uropathogenic Enterobacteriaceae）2,3 感染便是近年来日益受到关注的两个实例。因此，药物研发的一个基本目标是发现能够穿透进入细胞内区室的新型抗菌药物。尤其理想的是，开发出能够快速彻底清除胞内病原体、并防止因亚抑制浓度抗菌药物暴露而导致耐药性产生的优化治疗方案。
为此，我们开发了一种高通量筛选技术，用于鉴定可穿透细胞并靶向模式病原体胞内生长的抗菌剂 嗜肺军团菌.4 既往临床观察表明，常规抗菌药物敏感性试验未能准确预测 体内 针对该生物体的治疗功效5 具体而言，这是因为β-内酰胺类和氨基糖苷类等主要类别的抗菌药物尽管对无菌培养条件下生长的微生物具有高度有效性 军团菌， 无法充分渗透到细胞内区室中 军团菌 位于。5,6 后续证据表明，技术上更为复杂的细胞内生长检测方法能够有效预测临床疗效。7 遗憾的是，这些检测方法极为耗时，属于终点检测，需要在不同时间点裂解经抗微生物药物处理的感染巨噬细胞，以进行菌落形成单位计数。这类检测难以大规模开展，不适用于高通量药物筛选。
因此，我们开发了用于实时测定细胞内细菌生长的技术6。该技术通过将细菌荧光素酶操纵子8（第一代检测方法，此前已有描述）4或荧光蛋白9报告系统（第二代正交检测方法，本文中描述）整合到细菌染色体中，从而实现。通过这种方法，发光或荧光信号可作为细菌数量的替代性实时读数。
然而，这些特性并未解决细胞内感染实验中的一个主要混杂因素，即对宿主细胞的脱靶效应。特别是，宿主细胞的死亡本身会限制病原体的细胞内增殖，从而导致抗菌效果的假阳性判断。由于筛选文库中的许多化合物对真核细胞具有毒性，这类假阳性结果将远远超过真实的抗菌活性，因而需要进行大量后续的终点细胞毒性实验以加以区分。
因此，能够同时评估真核细胞的存活率和细胞内生长情况具有重要意义。值得注意的是，非存活真核细胞的一个特征是细胞膜完整性的丧失。因此，可用于检测细胞膜通透性的探针可被用来评估细胞的存活状态。我们此前已表征了一系列假定不能穿透细胞膜的荧光DNA结合染料进入并染色死亡细胞核DNA的能力4。当这些染料与核DNA结合后，其量子荧光产率显著增加，从而产生远高于背景溶液荧光的信号。因此，这些染料可提供一种对真核细胞死亡进行定量检测的读数方法4。特别地，我们发现其中几种染料在与J774巨噬细胞长期共孵育过程中本身无毒性。当在初始感染阶段加入时，它们可实时提供真核细胞死亡的荧光信号，该信号可通过微孔板荧光仪进行测量，或通过显微镜观察。
因此，通过结合使用细菌报告系统以及无毒、不能穿透细胞膜的DNA结合染料，我们成功建立了一种简单、非破坏性且可实时同步检测细菌载量与真核细胞毒性的检测方法。该检测方法使我们能够在384孔板体系中对约10,000种已知生物活性化合物（包括约250种抗菌剂）进行筛选 &#62;240,000 种具有功能未表征活性的小分子，用于检测其抑制细胞内生长的能力 嗜肺军团菌同时为每种化合物生成真核细胞毒性数据。6 我们对已知抗菌药物抑制胞内生长的分析 军团菌 迄今为止对这类问题最全面的探索。6
基于我们检测方法的高效性，我们随后还探索了已知抗菌药物联用时可能产生的协同效应。一种最常见的协同作用检测方法是所谓的棋盘法检测，该方法通常通过评估两种或多种抗菌药物的连续两倍稀释组合效应来实施10。在这些检测中，当两种或多种抗菌药物联合使用的效果大于各自单独使用效果之和时，即被定义为协同作用。值得注意的是，由于传统终点检测工作量巨大，且需进行多种组合排列，因此迄今为止仅针对细胞内Legionella pneumophila开展过有限且选择性的协同作用检测。
为了促进协同作用测试，我们结合了实时细胞内生长/真核细胞毒性检测方法与自动数字化液体分配技术6。该自动化技术使我们能够在384孔板中单独或联合分配溶解于DMSO或水溶液中的化合物的系列稀释液11。此外，这种高精度的液体处理技术使我们能够轻松执行更高分辨率的稀释组合，即以二的平方根（而非标准的两倍稀释，分辨率较低）进行稀释，从而在二维棋盘式协同分析中实现更高的特异性。这种分辨率在解决协同作用研究领域中关于使用两倍稀释系列时重现性问题方面尤为重要12。最后，我们的检测具有定量性，因此能够测量抑制程度的渐变差异。因此，该检测可完整捕获所有抑制信息，并以等效抑制轮廓图（isocontour isobolograms）的形式表达，其中等效轮廓线连接具有相似生长抑制水平的组合浓度6。这种绘图策略可实现组合剂量-反应曲线的可视化。为说明我们的方法，我们描述了执行这些检测的实验方案，并展示了代表性结果。

<table><tbody><tr><td>J774A.1 细胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-67</td><td>宿主细胞</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&amp;nbsp;</td><td>用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基</td></tr><tr><td>超滤酵母提取物</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基；较低等级可能导致军团菌生长受抑和/或对生长抑制剂的敏感性改变</td></tr><tr><td>α-酮戊二酸单钾盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基</td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基；可使用焦磷酸铁替代，但称量更难准确</td></tr><tr><td>浓氢氧化钾溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于制备缓冲活性炭酵母提取物琼脂和缓冲酵母提取物培养基</td></tr><tr><td>胸苷（组织培养级）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>用于补充 RPMI 1640 培养基及缓冲酵母提取物琼脂/培养基 &amp;mdash; 后者可使用较低等级胸苷，但在 RPMI 1640 中可能导致细胞生长受抑和/或细胞死亡</td></tr><tr><td>RPMI 1640，标准配方</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>用于铺板前培养 J774A.1 细胞；含 2 mM L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>不含酚红的 RPMI 1640</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>用于在 384 孔板中铺种 J774A.1 细胞（不适用于铺板前的细胞生长）；也不含 L-谷氨酰胺 &amp;mdash; 使用前需补充至 2 mM</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，200 mM 溶于 0.85% NaCl（组织培养级）</td><td>HyClone via Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>用于将不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 补充至终浓度 2 mM</td></tr><tr><td>铁补充小牛血清</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>用于将 RPMI 1640 补充至终浓度 9.1%</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>用于在计数细胞密度时染色以确定 J774A.1 细胞死亡情况</td></tr><tr><td>SYTOX Green，5 mM DMSO 溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>用于通过荧光读数或落射荧光显微镜检测 J774A.1 细胞死亡（需与橙红色或远红荧光细菌联用）。终浓度使用 125 nM。</td></tr><tr><td>细胞培养孵箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>用于 J774A.1 细胞的孵育（感染前后均可）；也可用于细菌孵育，或改用普通大气孵箱</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养；可放入细胞培养孵箱内；包含摇床底座 7744-01000 和托盘 7740-01010（也可单独购买）</td></tr><tr><td>摇瓶（250 ml）</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养</td></tr><tr><td>摇瓶夹具（250 ml）</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养</td></tr><tr><td>摇瓶（1,000 ml）</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养</td></tr><tr><td>摇瓶夹具（1,000 ml）</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养</td></tr><tr><td>摇瓶海绵泡沫盖（250 ml–1,000 ml）</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>用于感染前 J774A.1 细胞的振荡培养；相比标准金属盖可降低污染风险</td></tr><tr><td>MultiDrop Combi 可编程多通道蠕动泵</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>用于向大量 384 孔板中分配 J774A.1 细胞、培养基及含荧光染料的细菌悬液</td></tr><tr><td>Combi 标准孔径分配头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>默认预分配体积 20 &amp;#956;l 不足以补偿液体沉降 &amp;mdash; 应增加至 80 &amp;#956;l</td></tr><tr><td>白色 384 孔组织培养处理板</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>用于检测发光和荧光；Greiner 目录号 #781080 也已验证可用</td></tr><tr><td>DMSO（组织培养级，密封安瓿装）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>用于溶解阳性对照和待测化合物</td></tr><tr><td>阿奇霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>抗生素阳性对照</td></tr><tr><td>皂苷（来自皂荚树皮）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>细胞毒性阳性对照</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipette</td><td>用于转移固定量的阳性对照化合物；移液器必须具备带定位档的数字分配功能，以实现重复固定体积分配</td></tr><tr><td>Epson 点转移机器人</td><td>Epson/ICCB-L</td><td>(定制设备)</td><td>用于从文库阵列中转移固定量的待测化合物</td></tr><tr><td>D300 数字分配系统</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>D300</td><td>用于转移可变量的待测化合物，范围从 11 皮升至 10 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>D300 数字分配系统的 T8+ 耗材</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>T8+</td><td>用于分配待测化合物</td></tr><tr><td>配备计算机连接数码相机的落射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td>用于活细胞成像；任何标准荧光显微镜均可替代，需具备相差或微分干涉（DIC）光学系统，能够检测绿色（荧光素）、橙红色至红色（Texas Red）以及远红（Cy5）荧光，并配备 100X 油镜以实现最高分辨率</td></tr><tr><td>玻璃底组织培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>用于活细胞成像。MatTek 等品牌的培养皿可通过倒置落射荧光或共聚焦显微镜实现 600X 或 1,000X 放大倍数下的显微观察。&amp;nbsp; 此类培养皿标称直径为 3.5 cm，内径 3.3 cm，底部嵌入直径 20 mm、厚度为 #1.5 的盖玻片。</td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>可使用 Adobe Photoshop 或类似软件对明场显微图像和荧光图像进行伪彩着色与合并。</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfram</td><td></td><td>用于生成二维等高线等效图和三维曲面等效图。</td></tr></tbody></table>

高通量、实时、双读数检测细胞内抗菌活性与真核细胞毒性

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

传统的细胞内抗菌活性和真核细胞毒性的检测方法依赖于终点检测。这类终点检测在读数前需要多个额外的实验步骤，例如细胞裂解、菌落形成单位测定或试剂添加。在进行数千次检测时（例如高通量筛选过程中），此类检测所需的后续工作量相当可观。因此，为了促进高通量抗菌药物的发现，我们开发了一种实时检测方法，可同时识别抑制细胞内细菌生长的化合物并评估真核细胞的细胞毒性。具体而言，通过使用携带细菌lux操纵子（1st 生成实验）或荧光蛋白报告基因（2nd 生成，正交检测）。在巨噬细胞初始感染期间，还加入了一种无毒且不能穿透细胞膜的核酸结合染料。该染料无法进入活细胞，但死亡宿主细胞因细胞膜完整性丧失，染料得以进入并荧光标记细胞核DNA（脱氧核糖核酸）。值得注意的是，该染料与DNA结合后荧光量子产率显著增强，从而提供一种基于溶液的宿主细胞死亡读出方法。我们已利用该联合检测方法在微孔板中进行高通量筛选，并通过显微镜评估胞内增殖和细胞毒性。值得注意的是，抗菌药物可能表现出协同作用，即两种或多种抗菌药物联合使用时的效果大于各自单独使用时的效果之和。联合用药检测 体外 针对细胞内病原体的协同作用研究通常是一项艰巨的任务，因为必须评估不同浓度抗生素组合的各种可能性。然而，我们发现，将实时检测方法与自动化数字分配技术相结合，可实现便捷的协同作用测试。利用这些方法，我们能够系统地研究大量抗菌药物单独使用及联合使用时对细胞内病原体的作用效果。 嗜肺军团菌

微孔板细胞内生长检测
图1 示意图显示了检测步骤。所示的自动化步骤也可手动完成，但使用液体处理系统可显著提高通量。
图2 显示使用384孔微孔板、双读数、实时检测细胞内生长及真核细胞毒性的代表性结果 军团菌 菌株（Lp02）标记有lux操纵子（图2A, 2B）或 mNeptune2 荧光蛋白（图 2C, 二维报告基因。通过使用针式转移机器人将阳性与阴性对照化合物（DMSO、抗生素、皂苷）加入孔板，以模拟在高通量筛选条件下的实验表现。显著 军团菌 生长（图2A, <...

开发了一种高通量、实时的检测方法，可同时实现：（1）筛选靶向胞内细菌病原体的真核细胞穿透性抗菌剂；（2）评估抗菌剂对真核细胞的细胞毒性。随后，该技术经过改进，并结合数字分配技术，从而能够便捷地开展高分辨率的剂量-反应以及二维和三维协同作用研究。

传统的细胞内抗菌活性和真核细胞毒性的检测方法依赖于终点法检测。这类终点法检测需要……

本方案的总体目标是利用一种单一的组合式实时检测方法，鉴定出能够特异性抑制胞内细菌生长且对宿主细胞无毒性的特定小分子抑制剂。该方法有助于解答抗菌药物发现领域中的关键问题，特别是：哪些类型的化合物能够进入细胞内区室并在不损伤宿主细胞的前提下杀灭病原体？该技术的主要优势在于可通过非破坏性、实时检测方法同时检测细菌生长和哺乳动物细胞毒性。通常，初次接触该方法的研究人员在应对该技术所提供的高通量检测能力方面会遇到困难。单次实验中检测超过一万个化合物时，需要一套全新的技术和设备。除了 Lucius 之外，参与展示学术性抗菌药物发现和转化诊断微生物学共同承诺的还有博士后研究员 KP Smith、Yoon-Suk Kang、Jennifer Tsang、Thea Brennan-Krohn，以及本科生 Kat Truelson。为准备宿主细胞，需将 J774A.1 巨噬细胞悬浮培养于含 9% 铁补充小牛血清的 RPMI 1640 培养基中。首先在组织培养瓶中传代细胞。当细胞在含有15毫升培养基的75平方厘米组织培养瓶中达到汇合状态时，用刮擦法将细胞收集，并用相同类型的培养基稀释至65毫升。取15毫升重新接种回组织培养瓶中，将剩余的50毫升转移至250毫升细菌摇瓶中。以约每分钟120转的转速进行通气。为确保生长一致性，在5%二氧化碳和37摄氏度条件下培养。当细胞密度达到每毫升250万个至500万个细胞时收获细胞。确保死细胞比例不超过25%，因为死细胞会增加细胞毒性检测中的背景噪声。使用液体处理设备分配大量巨噬细胞和细菌时，必须防止细胞在储液槽中沉降。在加样过程中，每隔几分钟轻轻摇动储液槽，以避免分布不均和检测板孔间的差异。将细胞以每孔30 µL培养基中接种50,000个细胞的密度，接种于经组织培养处理的白色384孔微孔板中。将微孔板孵育过夜，使实验当天细胞融合度达到90%。为准备实验用细菌菌膜，将菌种密集涂布于新的BCYE平板上，培养一天以获得完全融合的菌苔生长。用培养 J774A.1 细胞所用的相同组织培养基重悬生物体。为进行巨噬细胞感染，加入待测化合物，包括筛选化合物，以及用于真核细胞裂解中细菌生长抑制的阳性和阴性对照。储存液应以 DMSO 或水溶液溶解，浓度不低于 500 倍，以便对溶剂进行充分稀释。将发光细菌用组织培养基稀释至每毫升 2.5 × 10⁶ CFU 的目标浓度。然后，加入适量的无毒且不能透过膜的核酸染料，使其终浓度为检测浓度的 2.5 倍。向每个培养孔中加入 20 微升该混合液。最终检测体积为 50 微升，细菌终浓度应为每毫升 100 万 CFU（用于 lux epron 报告系统）或每毫升 400 万 CFU（用于荧光蛋白报告系统）。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳、100% 相对湿度条件下孵育 1 至 3 天，以防止蒸发边缘效应。为避免读取检测结果时因温度相关边缘效应产生干扰，应在单层放置微孔板于实验台面上，微孔板盖稍打开，静置约20分钟，使其达到热平衡后再进行化学发光读数。根据所使用的报告系统，选择适当的微孔板化学发光仪或荧光仪检测细菌生长和真核细胞毒性。若需在后续时间点进行实时读数，应将微孔板放回培养箱中继续培养。按照文本方案中所述分析数据。对于剂量反应和协同作用测试实验，按先前方法在细菌中培养巨噬细胞。在巨噬细胞感染或无菌孵育前，使用自动化液体处理系统，根据制造商方案通过自动添加抗菌剂稀释液，以促进组合协同作用测试中单剂量反应体系的建立。以系列倍比稀释的方式加入具有实验意义的抗菌剂。目标是在高浓度端涵盖能够完全抑制生长的浓度，而在低浓度端包含无明显活性的浓度。此处展示的是细菌生物发光及与细胞毒性相关的荧光随时间变化的代表性结果。注意抗菌治疗与真核细胞毒性去污剂的不同效应。在同一筛选孔中进行双重IC50和CC50剂量反应测定，以确定多西环素的抗菌选择性。中等浓度的抗生素可抑制细菌复制。然而，在高浓度下观察到细胞毒性，这与约100的选择性一致。采用相同的检测模式对米诺环素与阿奇霉素联用进行二维剂量反应测试。等效抑制曲线连接具有相同胞内生长抑制率的点。此处，凹形等高线表明这两种药物具有显著的协同作用。通过数字化分配机器人进行检测体系的设置、实时读出以及高通量格式，实现了三药联合协同效应的测试。在此，观察到明显凹陷的曲面，表明米诺环素、阿奇霉素和利福平三药联用对嗜肺军团菌胞内生长具有高度协同作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何在高通量检测体系中，将荧光或发光检测读数与实时细胞毒性检测相结合。在完成本实验流程后，还可进一步采用共聚焦显微镜等其他方法，研究全细胞水平的生物学事件，包括其抗菌活性或全细胞毒性的相关机制。尽管本研究聚焦于军团菌复制的影响，但相同的技术也可应用于其他胞内病原体，如布鲁氏菌（Brucella）和分枝杆菌（microbacteria）。在尝试设计一种足够简单且可靠的检测方法以用于高通量筛选时，我们首次提出了本方案。请勿忽视，操作细菌病原体、细胞系以及机器人设备时存在一定的固有风险，应采取适当的预防措施，例如在执行本操作时使用合适的一次性防护装备。

high-throughput-real-time-dual-readout-testing-intracellular

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

高通量，实时，细胞内的抗菌活性的双读出测试和真核细胞的细胞毒性

我们描述了一种高通量单细胞检测方法，用于测量T细胞与肿瘤靶细胞共孵育时的细胞毒性。该方法采用高密度的弹性体微孔阵列（每个阵列约10万个亚纳升级微孔），将T细胞与靶细胞以特定比例在空间上进行限定，并结合荧光显微镜技术，实时监测效应细胞与靶细胞的结合以及后续的细胞凋亡过程。...

T细胞的定量高通量单细胞细胞毒性检测方法

表达细菌生物发光基因盒（lux）的哺乳动物细胞能够自主发光。化学物质处理后所产生的生物发光动态变化已被证明可反映处理对细胞生长和代谢的影响，因此这类细胞可作为一种低成本、连续、实时的毒性筛选工具，并可轻松适用于高通量自动化检测。...

自主生物发光的哺乳动物细胞用于细胞毒性的连续与实时监测

本文介绍了细胞毒性及单周期感染性检测方法，可用于快速、准确地筛选化合物，以确定其对野生型和耐药型 HIV-1...

快速筛选HIV逆转录酶和整合酶抑制剂

基于实时阻抗的细胞分析仪作为研究神经毒性与神经保护分子通路的工具在神经细胞系中的应用

全血细胞毒性检测（WCA）是一种将高通量细胞定位技术与荧光显微镜和自动图像处理相结合而开发的细胞毒性检测方法。本文描述了如何在人全血中实时分析经抗CD20抗体处理的淋巴瘤细胞，以提供定量的细胞毒性分析结果。...

人全血中的实时细胞毒性检测

我们开发了一种模块化的高通量筛选系统，用于发现针对Mycobacterium...

靶向细胞内目标抑制剂的药效与细胞毒性筛选系统 结核分枝杆菌

开发能够改进下一代抗结核药物早期药物研发流程的新模型和新检测方法具有重要意义。本文介绍了一种快速、经济且符合生物安全二级（BSL-2）标准的检测方法，可用于评估药物对结核分枝杆菌（Mycobacterium...

一种适用于高通量筛选的药物疗效评估方法，用于检测药物对巨噬细胞传代后病原体的有效性 结核分枝杆菌

通常需要评估一组化合物对培养细胞的潜在细胞毒性。本文介绍了一种在96孔板体系中可靠筛选有毒化合物的策略。...

一种在中低通量条件下鉴定影响培养哺乳动物细胞生长与存活化合物的策略

本方案描述了一种快速、高通量、可靠、经济且无偏倚的检测方法，可高效测定细胞活力。当细胞线粒体受损而干扰其他检测方法时，该方法尤为适用。该检测利用两种细胞核染料——Hoechst 33342...

一种用于准确测定线粒体毒剂细胞毒性的自动化差异核染色检测法

本文介绍了一种制备双乳液滴的方法，该液滴包封单个T细胞和一个癌细胞靶标，用于在单细胞水平上研究细胞杀伤作用。该方法能够在大量T细胞中同时定量检测细胞毒性分子和靶细胞的凋亡情况。...

基于液滴的单细胞水平评估嵌合抗原受体T细胞毒性的检测方法

本文介绍了一种通过表型筛选鉴定潜在抗结核药物候选物的实验方案，包括4-氨基喹啉类化合物的化学合成、其对结核分枝杆菌最低抑菌浓度的测定，以及在哺乳动物细胞系中对其细胞毒性的评估。...

潜在抗结核候选物的鉴定：合成、最低抑菌浓度测定及哺乳动物细胞毒性评估的逐步指南

学习高通量实时双读出检测技术，用于筛选穿透真核细胞的抗菌化合物并同时评估细胞毒性。该方法可同时检测细菌生长与哺乳动物细胞毒性，助力细胞内病原体感染治疗研究。

高通量、实时、双读数检测细胞内抗菌活性与真核细胞毒性

探索更多视频