高通量，实时，细胞内的抗菌活性的双读出测试和真核细胞的细胞毒性

该方案的总体目标是使用单一组合实时测定来识别对宿主细胞无毒的细胞内细菌生长的特异性小分子抑制剂。这种方法可以帮助回答抗菌药物发现领域的关键问题。具体来说，哪些类型的化合物可以渗透到细胞内区室并杀死病原体而不伤害宿主细胞？

该技术的主要优点是使用无损实时检测同时检测细菌生长哺乳动物细胞的毒性。通常，刚接触这种方法的人会难以获得它提供的可扩展性。在一次会话中分析超过一万种化合物需要一套全新的技术和设备。

除了 Lucius 之外，博士后研究员 KP Smith、Yoon-Suk Kang、Jennifer Tsang、Thea Brennan-Krohn 和本科生 Kat Truelson 也表现出对学术抗菌药物发现和转化诊断微生物学的共同承诺。为了制备宿主细胞，请培养 J774A。1 个巨噬细胞悬浮在 RPMI 1640 中，添加了 9% 的铁小牛血清。

最初在组织培养瓶中传代细胞。细胞在 75 平方厘米的组织培养瓶中加入 15 mL 培养基汇合后，通过刮擦并用相同类型的培养基将其稀释至 65 mL，将细胞分开。将 15 mL 倒回组织培养瓶中，并将 50 mL 转移至 250 mL细菌摇瓶中。

通过将转速设置为每分钟约 120 转来充气。为了持续生长，请在 5% 的二氧化碳和 37 摄氏度的温度下孵育。当细胞密度达到每毫升 2 点 500 万个细胞到 500 万个细胞/毫升时，收获细胞。

确保死细胞百分比不超过 25%，因为死细胞会增加细胞毒性分析中的背景噪音。当您使用液体处理器分配大量巨噬细胞和细菌时，防止细胞沉淀在储液槽中至关重要。分液时每隔几分钟涡流储液槽，以避免不均匀性和分析板孔。

将细胞接种在经过处理的白色组织培养物中，384 孔微孔板，每孔 50， 000 个细胞，溶于 30 微升组织培养基中。孵育微孔板过夜，以在实验当天达到 90% 的汇合度。通过将生物体厚厚地铺在新的 BCYE 板上并孵育一天以获得汇合生长，准备用于实验的细菌斑块。

生物体重悬于用于 J774A. 1 细胞的相同组织培养基中。为了进行巨噬细胞感染，添加感兴趣的测试化合物，包括筛选化合物，以及真核细胞裂解中细菌生长抑制的阳性和阴性对照。

储备溶液应以大于或等于 500x 的浓度溶解在 DMSO 或水溶液中，以允许充分稀释载体。在组织培养基中将发光细菌稀释至每毫升 2 点 500 万 CFU 的目标。然后，添加适当的无毒膜不可渗透性核酸查找染料，浓度为 2 点 5 x 最终测定浓度。

向每个培养物孔中加入 20 微升这种混合物。最终检测体积为 50 μL，lux epron 报告基因的最终细菌浓度应为每毫升 100 万 CFU，或荧光蛋白报告基因为每毫升 400 万 CFU。在 37 摄氏度下，在 5% 的二氧化碳中以 100% 的相对湿度孵育 1 到 3 天，以防止蒸发边缘效应。

为避免在读取检测结果时出现与温度相关的边缘效应，在发光读数之前，将微孔板放在实验室工作台上，盖上盖子半开，放置单层，使其热平衡约 20 分钟。在微孔板发光仪和荧光计上读取细菌生长和真核细胞毒性，以适应所使用的报告基因。如果需要在以后的时间点实时读数，请将微孔板放回培养箱中。

按照文本协议中的说明分析数据。对于剂量反应和协同测试实验，像以前一样在细菌中准备巨噬细胞。在巨噬细胞感染或轴系孵育之前，使用自动液体处理系统，通过根据制造商方案直接自动添加抗菌稀释剂来促进组合协同测试中的单剂量反应。

在连续加倍稀释系列中加入实验感兴趣的抗菌剂。目标是在高端跨越完全消除生长的浓度，在低端跨越没有明显活动的浓度。此处显示的是细菌发光和细胞毒性相关荧光随时间变化的代表性结果。

注意抗菌处理和真核细胞细胞毒性洗涤剂的对比效果。在同一筛选孔中采用双重 IC50 和 CC50 剂量反应测定来确定抗生素多西环素的选择性。中等浓度的抗生素抑制了细菌复制。

然而，在高浓度下观察到细胞毒性，与大约 100 的选择性一致。使用相同的检测形式来测试米诺环素和阿奇霉素组合的二维剂量反应。等值线连接相等的细胞内生长抑制点。

在这里，凹等值线表明两种药物具有很强的协同作用。用于分析设置、实时读数和高通量格式的数字加样机器人支持组合三重协同测试。在这里，观察到明显的凹面表明，米诺环素、阿奇霉素和利福平的组合对嗜蝶军团菌的细胞内生长具有高度的协同作用。

观看本视频后，您应该对如何将荧光或发光检测读数与高通量检测形式的实时细胞毒性检测相结合。在此程序之后，可以应用共聚焦显微镜等其他方法来回答有关全细胞生物事件的问题，这些问题也与它们的抗菌活性或全细胞细胞毒性有关。尽管我们研究了对军团菌复制的影响，但相同的技术也可以应用于其他细胞内病原体，如布鲁氏菌和微生物。

我们首先想到这个方案是在试图找出一种足够简单可靠的检测方法以用于非常高通量的筛选形式时。不要忘记，使用细菌病原体、细胞系和机器人设备具有一些固有的风险，应采取适当的预防措施，例如在执行此程序时使用适当的个人防护设备。