观察和交配行为的量化在我国松材线虫，松材线虫

该程序的总体目标是观察松木线虫 Bursaphelenchus xylophilus 的交配行为。这种方法可以帮助推进线虫的心理学研究。它专门涉及对松木线虫交配行为的观察。

这种技术的主要优点是可以获得处女成虫，这使得观察成虫的交配行为变得更加容易。这项技术的意义纯粹延伸到对线虫的更广泛研究，因为它们具有相似的生命周期行为。因为这种方法的演示至关重要，因为获得原始成年线虫很困难，因为发育线虫的限制需要练习，并且在早期第一阶段的幼虫中不容易精确区分雄性和雌性。

要培养松木线虫，首先准备马铃薯葡萄糖琼脂板。要接种板，请从 betritus senaria 垫上冲出一块直径为 10 毫米的真菌垫，然后将其放在新的 PDA 板的中间。在 25 摄氏度的黑暗中将真菌垫培养 5 天。

五天后，将松木线虫加入准备好的培养皿中，并在 25 摄氏度的黑暗中培养三天。要从真菌中分离线虫，首先准备一个收集工具。将夹住的橡胶管放在漏斗下方，将准备好的漏斗放在架子上以组装 baermann 漏斗装置。

然后，在漏斗口放置两层滤纸而不是纱布。现在，将真菌培养物转移到漏斗设置中并加水，直到真菌垫浸入水中。两个小时后，线虫将从真菌培养物中出来，穿过滤纸，并在 baermann 漏斗的最低部分沉淀下来。

通过在漏斗下方放置一根 15 毫升的管子来收集线虫，然后慢慢松开夹子以收集几滴水，其中将包含线虫。在室温下以 3， 000 G 离心线虫收集物 2 分钟。然后把上层水倒掉，将蠕虫重新悬浮在一毫升水中。

将线虫的悬浮液转移到一个 6 厘米的玻璃皿中，加入 3 毫升水以帮助线虫自由游泳。现在，收集鸡蛋来制作处女股票。将培养皿转移到黑暗的培养箱中，让怀孕的雌性产卵 10 分钟。

由于它们的糖蛋白表面，鸡蛋会粘在玻璃杯上。接下来，小心地将水和蠕虫一起除去，以免打扰粘附在盘子上的鸡蛋。然后，迅速向盘中加入 3 毫升水，以防止鸡蛋变干。

重复这个清洁鸡蛋的过程至少三次，以去除所有幼虫和成虫并获得纯鸡蛋。在清洗后的纯鸡蛋收集中，加入 5 毫升水，然后在 25 摄氏度的黑暗中继续显影鸡蛋。开始卵培养后 24 小时，收集孵化的 J2 幼虫。

小心地将 J2 幼虫转移到 15 毫升的试管中。然后将收集的样品以 3， 000 G 离心 2 分钟。将上层水倒掉，然后加回 200 微升水。

然后，在用真菌垫制备的 PDA 板上培养 J2 幼虫。52 小时后，大多数 J2 幼虫将发育成早期 J4 幼虫。如前所述，组装一个 baermann 漏斗，并从真菌培养物中提取线虫两个小时。

等待时，准备一根针来挑虫。从酒精燃烧器上加热的玻璃毛细管中抽取尖端。尖端的直径需要约为 50 微米，大约是成年线虫的体宽。

两小时后，如前所述，将 J4 幼虫转移到干净的培养皿中。现在，在立体显微镜下对线虫进行性别鉴定。大约三分之二的幼虫通常是雌性的。

雌性的外阴显然与雄性的解剖结构不同，但由于蠕虫非常活跃，因此需要练习性别鉴定。该方案最关键的步骤是在早期第一阶段精确区分和区分雄性和雌性。否则，一旦他们长大成人，就会出现混合和糟糕的情况。

这使得很难观察交配。逐渐地，将蠕虫捡起并转移到公性或雌性载玻片上的一滴水中。为确保成功，两个不同的人应该仔细检查性别分配。

现在，将含有性蠕虫的水滴转移到适当的真菌培养板中。然后，在研究它们的交配行为之前，将处女再培养 24 小时。为了观察松木线虫的交配行为，首先通过向每个井中加入 200 微升水来准备几个凹形载玻片。

接下来，挑选一个准备好的处女成虫并将其转移到准备好的载玻片上。将处女成虫放在井内一个小时，让它们适应新的水环境。一小时后，使用移液管将一个异性的处女成年体加入孔中。

然后，在体视显微镜下观察交配行为，并拍摄行为以进行定量分析。整个交配过程通常在两个小时内结束。每 30 分钟加入 50 微升水以补偿蒸发。

为了研究交配选择和双性竞争，对两种不同组合的处女线虫进行分组和观察。处女成虫的交配成功率约为 87%，远高于随机选择的成虫。成对平均需要 83 分钟才能完成整个交配过程，其中包括四个不同的阶段。

寻找、联系、交配和逗留。在这些阶段中，可以观察到许多特定的行为模式。当一只雌性遇到几只雄性时，有一个明显的交配选择。

雌性通常用她的头部接触一只雄性，通常在头部、身体、尾巴和生殖器区域。然后，雌性与雄配，或者迅速离开他，游到另一只雄性身上。在第一次接触后测量不同线虫组合的交配成功率。

双性人竞争也发生了。当一只处女雌性与三只处女雄性混在一起时，雄性试图尽可能接近和接触雌性，以获得与她交配的机会。当外阴被占用时，其他雄性试图通过剧烈的身体摆动或拖动来干扰交配过程，以将它们分开。

女性双性人竞争被认为或多或少与男性双性人竞争相似。由于双性人竞争，不同组合的交配频率显著不同。该技术发展后，为探索线虫的行为生态学铺平了道路。

一旦掌握，如果执行得当，该程序可以在 12 天内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住将雄性与雌性、早期四个阶段的幼年精确区分开来，以获得处女成虫。