Name: 观察和交配行为的量化在我国松材线虫，松材线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 了解松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）交配行为的观察与量化方法。本方案通过获取处女成虫，帮助研究者精确记录线虫求偶、接触、交配等阶段的行为特征，为线虫行为生态学研究提供可靠基础。

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Najie Zhu 和 Liqun Bai 对本工作贡献相同。本工作受到公益性行业（林业）科研专项经费（201204501）和国家自然科学基金（31170604、31270688 和 31570638）的资助。感谢 Holighaus Gerrit 博士和 Danielle Hickford 博士在英文写作方面提供的有益建议。

1. 获取未交配的成年线虫
<ol>
	<li>松材线虫分离与培养条件 
	注意： B. xylophilus 分离 Nxy61 最初从病变组织中提取 马尾松 中国浙江省宁波市地区
	<ol>
		<li>制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，参见 材料表用于培养的平板 灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea） </li>
		<li>接种时，用直径为10 mm的打孔器从真菌菌膜上取一块菌片 灰葡萄孢菌（B. cinerea） 将 mat 放置在新的 PDA 平板中央进行培养 B. cinerea 在25 °C避光条件下培养5天。</li>
		<li>在已准备好的培养皿中培养松材线虫 灰葡萄孢菌（B. cinerea） 在25 °C避光条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取 B. xylophilus 卵
	<ol>
		<li>将夹住的橡胶管置于漏斗下方，并将准备好的漏斗固定在支架上，组装成贝尔曼漏斗装置。在漏斗口处放置两层滤纸以替代纱布。</li>
		<li>将真菌培养物转移至漏斗装置中，加水直至真菌菌膜完全浸没。静置2小时，线虫将从真菌培养物中逸出，穿过滤纸，最终沉降至贝尔曼漏斗的最底部。</li>
		<li>从管底收集最初几滴水至15&#160;mL 离心管中，并通过缓慢松开管夹收集线虫。</li>
		<li>将上述收集物在室温下以 3,000 x g 离心 2 分钟。</li>
		<li>用移液器去除上层水相，并用1 mL无菌双蒸水（dd）重新悬浮&#160;H2O.</li>
		<li>使用移液器将上述重悬液转移至新的玻璃培养皿（6&#160;厘米直径）。加入3 mL无菌dd H2加入适量的 O 型溶液至培养皿，以确保线虫能够自由游动。</li>
		<li>将线虫置于玻璃培养皿中，在25 °C避光条件下孵育10分钟。怀孕雌虫将产卵。由于卵具有糖蛋白表面，会黏附在玻璃培养皿底部。</li>
		<li>小心移除水和成虫，避免扰动虫卵。加入 3 mL 无菌 dd H₂O。2立即将 O 转移至玻璃培养皿中，以防止卵干燥。</li>
		<li>重复步骤 1.2.8 三次，以去除所有幼虫和成虫，获得纯化的卵。额外加入 2 mL（总共 5 mL）无菌 dd H2O 至培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第四阶段幼虫（J4期幼虫）的获取
	<ol>
		<li>将收集的卵在25 °C避光条件下孵化24小时，以获得J2幼虫。</li>
		<li>用移液器将J2幼虫转移至15&#160;毫升离心管，离心机&#160;在3,000 × g离心2分钟，去除上层水相。</li>
		<li>用 200 µL 无菌 dd H₂O 重悬 J2 期幼虫2O，然后将它们转移到含有PDA的培养皿中 灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）.</li>
		<li>在25 °C避光条件下培养J2幼虫52小时。此时，大多数J2幼虫将已发育至J4幼虫的早期阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取无交配成年线虫
	<ol>
		<li>使用酒精灯加热玻璃毛细管后拉制针尖，制备用于挑取线虫的毛细针。 
		注意：该毛细玻璃针的尖端直径通常需要为50 µm，约等于成年线虫的体宽，以便用作挑取单个线虫的工具。</li>
		<li>组装贝尔曼漏斗，按照步骤1.2.1–1.2.3所述，从真菌培养物中提取线虫2小时。</li>
		<li>将J4加水转移至干净的培养皿中。</li>
		<li>在体视显微镜下观察线虫，并根据Mamiya和Kiyohara所述的生殖器形态区分雄性和雌性8 (图1用制备好的毛细玻璃针挑取所需性别的线虫，转移至适用于雄性或雌性的真菌培养平板中。 
		注意：雌性数量多于雄性，雌性所占比例为60%–70%。雌性阴门与雄性交合刺在形态上明显不同。与成虫相比，早期J4阶段的交合刺或阴门较小，但仍可清晰观察并加以区分。线虫在水中始终处于运动状态，有时会增加雌雄鉴别的难度。</li>
		<li>将J4期幼虫在25 °C避光条件下继续培养24小时。 
		注意：所有线虫都应发育为成虫，但由于未交配，被视为处女成虫。</li>
		<li>组装两个贝尔曼漏斗，按照步骤1.2.1–1.2.3所述方法从真菌培养物中提取未交配成虫2小时，然后将未交配的成虫雄性和雌性分别转移至两个独立的洁净培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 交配行为的观察与视频记录
<ol>
	<li>准备多个凹面载玻片，并向每个凹面载玻片的孔中加入 200 µL 无菌 dd H2O。</li>
	<li>用毛细玻璃针挑取已准备好的未交配成年雄虫或雌虫，将仅一条线虫放入每个凹面载玻片的水中。</li>
	<li>将未交配成虫保留在孔内 1 小时，使其适应新的水生环境。</li>
	<li>使用移液器将其中一条虫从一个孔转移至另一孔，使一条未交配雄虫与一条未交配雌虫配对。</li>
	<li>在体视显微镜下观察凹面载玻片中 1♀ + 1♂ 组合的交配行为。</li>
	<li>为分析未交配成虫的交配效率，计算其交配成功率（R），并与随机选择的成虫配对的交配成功率进行比较。R 的计算方法为：观察到交配行为的重复实验次数占总研究重复实验次数的百分比。</li>
	<li>为研究交配选择与同性竞争，将未交配线虫分为两种不同组合进行分组观察：1♀ + 3♂ 和 3♀ + 1♂。</li>
	<li>为获取定性与定量分析数据，使用视频显微技术记录交配行为。通常情况下，整个交配过程从线虫被放入凹面载玻片孔中开始，至交配结束后离开为止，在 2 小时内完成。因此，每组至少连续记录 2 小时作为一个重复实验。每种组合总共至少完成 30 个重复实验。 
	注意：为补偿记录过程中水分蒸发，每隔 0.5 小时向孔中补充更多无菌 dd H2O（通常为 50 µL）。</li>
</ol>
3. 数据采集
<ol>
	<li>在电脑屏幕上仔细观看所有视频，并对子行为进行定性表征。</li>
	<li>使用录像机的逐帧功能测量交配持续时间。手动将结束时间减去起始时间。</li>
	<li>对于1♀ + 1♂组合，分析每段视频记录并测量以下事件的持续时间：
	<ol>
		<li>测量搜寻持续时间（即， 从将雌雄个体引入凹面载玻片的孔中到它们彼此相遇并接触的时间。</li>
		<li>测量接触持续时间（即从首次接触到雄性首次精确位于雌性阴门处准备交配的时间。</li>
		<li>测量交配持续时间（即，即雄性个体精确地位于雌性阴门处开始，至射精后从雌体滑下为止的时间）。注意：某些线虫在2小时内可交配多次。在此类情况下，交配持续时间应从第一次交配开始计算，直至最后一次交配结束，包括中间间隔时间。</li>
		<li>测量滞留持续时间（即交配后时期，即从交配结束到雄虫与雌虫游开并相隔距离超过线虫体长（通常为1毫米）的阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计每种不同组合在2小时内交配的频率、每次交配的持续时间以及所有交配的平均持续时间即， 1♀ + 1♂、3♀ + 1♂ 和 1♀ + 3♂</li>
	<li>计算不同组合在首次接触时的交配成功率（P），即在首次接触后立即且无间断进行交配的成功率。在接触阶段，实际交配前可能观察到多次接触。
	<ol>
		<li>当两个个体之间的距离超过其体长时，视为一次接触结束。对于一次重复实验，若在首次接触后立即观察到交配行为且中间无间断，则记录P为100%；若未观察到交配行为，或交配发生在两次及以上接触之后，则记录P为0.00%。 
		注意：此处所述的每种组合均有30个重复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
<li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen%27s+mausoleum+in+Nanjing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jiangsu+Fore.+Sci.+Tech.+%28in+Chinese%29%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).</li>
<li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li>
<li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+%26+Buhrer%2C+1934+%28Nickle%2C+1970%29+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li>
<li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pine+wilt+disease%3A+a+threat+to+European+forestry%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Plant+Path%22%5BJournal%5D)">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li>
<li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus%3A+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Path%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li>
<li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Nemat%22%5BJournal%5D)">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li>
<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
<li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li>
<li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li>
<li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mating+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community+Wormbook%22%5BJournal%5D)">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li>
<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

行为学实验是化学生态学、神经生物学、分子生物学和遗传学的基本组成部分。线虫，尤其是 秀丽隐杆线虫，广泛用于这些领域的研究。交配行为的 秀丽隐杆线虫 此前已对此进行过研究10-11。然而， B. xylophilus 为雌雄异体，不同于雌雄同体 秀丽隐杆线虫，其交配过程具有不同的行为特征9。最近，交配行为的研究 Bursaphelenchus okinawaensis，一种雌雄同体的姊妹物种 B. xylophilus, 被报道12尽管采用了不同的实验方法，这种雌雄同体物种对性别的吸引表现出相似性 B. xylophilus, 并观察到它们之间的种间相互吸引。这种雌雄同体的姊妹物种可作为研究其生物学特性的模型，用于进一步探索 松材线虫属
本方案提供了观察和研究松材线虫（B. xylophilus）交配过程中行为特征的指导。我们的研究结果表明，...

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus (Steiner 和 Buhrer) Nickle）是最具破坏性的入侵物种之一，可导致松树萎蔫并最终死亡。这种致病性线虫原产于美国，但已被传播至包括中国、日本、韩国和葡萄牙在内的多个国家。最近，在西班牙也发现了该线虫，已导致数百万棵松树死亡，造成巨大的经济损失，并威胁到森林生产和生态系统的稳定性1-5。
一旦松树寄主被松材线虫感染，其树干内会迅速繁殖出数以十亿计的子代。这会导致木质部功能障碍，进而引起寄主树木萎蔫，最终导致其死亡6。然而，目前尚无有效控制该病害的方法。交配行为可能在该线虫高繁殖力中起重要作用7。因此，我们在实验室中研究了B. xylophilus的交配行为，试图寻找干扰其交配并降低其繁殖力的有效方法。
本方案旨在介绍获取松材线虫（B. xylophilus）未交配成虫以及利用录像机和体视显微镜观察与分析其交配行为的详细方法。该方案也可作为其他线虫行为学研究的参考。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;B. xylophilus&lt;/em&gt; 分离株 &lt;em&gt;Nxy61&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>从中国宁波地区的&lt;em&gt;Pinus massoniana&lt;/em&gt;中提取</td></tr><tr><td>灰霉菌株</td><td></td><td></td><td>购自中国林业科学研究院</td></tr><tr><td>贝尔曼漏斗</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管（falcon tube）</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌 dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>经121 &amp;deg;C 高压蒸汽灭菌30分钟</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA培养基</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>倒置体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>凹面载玻片</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

松材线虫 bursaphelenchus xylophilus 交配行为的观察与量化

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

在体视显微镜下建立了一种观察和量化松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）交配行为的方法。为了提高B. xylophilus的交配效率并增加观察到交配行为的概率，实验中培养并使用了未交配的成虫。通过将线虫置于水中，让雌虫产卵10分钟，从而获得卵。将卵在25 °C黑暗条件下培养24小时，以获得同步化的二龄幼虫（J2）；再将J2与灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）共同培养52小时，获得早期四龄幼虫（J4）。在此阶段，大多数J4线虫可根据其生殖结构的形态清晰区分性别。将雄性和雌性J4分别收集，并在两个不同的培养皿中单独培养24小时，以获得未交配的成虫。将一只未交配雄虫与一只未交配雌虫配对置于凹玻片小室中的水滴内，在体视显微镜下用摄像机记录其交配行为。整个交配过程持续时间为82.8 ± 3.91分钟（均值±标准误），可分为四个不同阶段：寻找、接触、交配和逗留，各阶段平均持续时间分别为21.8 ± 2.0分钟、28.0 ± 1.9分钟、25.8 ± 0.7分钟和7.2 ± 0.5分钟。实验中描述了11种亚行为：巡航、接近、相遇、触碰、环抱、定位、附着、射精、分离、静止和游走。有趣的是，当一只雌虫与三只雄虫或一只雄虫与三只雌虫组合时，观察到了明显的同性竞争现象。该实验方案不仅对研究B. xylophilus的交配行为具有重要价值，也可为其他线虫的行为学研究提供参考。

未交配成虫的交配成功率（R）平均为86.67%，显著高于随机选取成虫的交配成功率（13.33 ± 4.65%）（F = 1301.71，df = 1，P = 0.0001）（图2）。该结果表明，使用未交配成虫比使用随机选取成虫更易于观察到松材线虫（B. xylophilus）的交配行为。
当一只雄性与一只雌性配对时，整个交配过程平均持续82.8分钟。该过程可分为四个不同阶段：寻找、接触、交配和停留，各阶段持续时间分别为21.8 ± 2.0分钟、28.0 ± 1.9分钟、25.8 ± 0.7分钟和7.2 ± 0.5分钟（图3）。在最近的一项研究中，我们描述了11种亚行为，分别为游动、接近、相遇、触碰、环抱、定位、附着、射精、分离、静息和漫游9。
<p class="jove_content" fo:kee...

本文介绍了一种研究松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）交配行为的实验方案。描述了B. xylophilus在交配过程中的行为特征。

松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 交配行为的观察与量化

在体视显微镜下建立了一种观察和量化松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）交配行为的方法。

本实验的总体目标是观察松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的交配行为。该方法有助于推进对线虫的心理学研究，尤其针对松材线虫的交配行为进行观察。该技术的主要优势在于能够获得未交配的成虫，从而更便于观察成虫的交配行为。该技术的应用意义主要延伸至线虫的广泛研究领域，因为各类线虫具有相似的生活周期和行为特征。本方法的演示至关重要，因为获取未交配的成虫较为困难，这需要对发育阶段的线虫进行精确操作和经验积累，且在早期一龄幼虫阶段很难准确区分雄性和雌性个体。为了培养松材线虫，首先准备马铃薯葡萄糖琼脂平板。接种时，从褐褶菌菌膜上切取直径为10毫米的菌块，置于新的PDA平板中央。将菌膜在25摄氏度避光条件下培养5天。五天后，将松材线虫加入已准备好的培养皿中，在黑暗条件下于25摄氏度培养三天。为从真菌中分离线虫，首先准备收集工具。在漏斗下方放置一段夹紧的橡胶管，并将准备好的漏斗固定在支架上，组装成贝尔曼漏斗装置。然后，在漏斗口放置两层滤纸代替纱布。将真菌培养物转移至该漏斗装置中，并加水直至真菌菌膜完全浸没。两小时后，线虫将从真菌培养物中逸出，穿过滤纸，最终沉降至贝尔曼漏斗的最底部。将15毫升离心管置于漏斗下方，缓慢松开夹子，收集数滴含有线虫的水样。在室温下以3,000 G离心力离心线虫样品2分钟。然后吸除上层水相，将线虫重新悬浮于1毫升水中。将线虫悬液转移至一个六厘米的玻璃培养皿中，并加入三毫升水，以帮助线虫自由游动。现在，收集卵以制备 virgin 群体。将培养皿置于暗培养箱中，让怀卵雌虫产卵10分钟。由于卵具有糖蛋白表面，它们会黏附在玻璃上。接下来，小心移除含有线虫的水，以避免扰动黏附在培养皿上的卵。然后，迅速向培养皿中重新加入3毫升水，以防止卵干燥。重复此卵清洁过程至少三次，以去除所有幼虫和成虫，获得纯净的卵。向洗涤后的纯净卵收集物中加入 5 毫升水，并在 25°C 黑暗条件下继续培养卵。卵培养开始 24 小时后，收集孵化出的 J2 幼虫。小心地将J2幼虫转移至一个15毫升离心管中。然后在3,000 G条件下离心收集物2分钟。吸除上层水相，并重新加入200微升水。然后，将 J2 幼虫接种于含有真菌菌丝垫的 PDA 平板上进行培养。培养 52 小时后，大多数 J2 幼虫将发育为早期 J4 幼虫阶段。组装贝尔曼漏斗装置，并按照前述方法从真菌培养物中提取线虫，持续两小时。等待期间，准备一根用于挑取线虫的针。将玻璃毛细管的尖端在酒精灯上加热，拉出一个尖头。该尖头直径需约为 50 微米，大致相当于一条成年线虫的体宽。两小时后，将 J4 期幼虫转移至洁净的培养皿中，操作方法如前所述。现在，在体视显微镜下对线虫进行性别鉴定。通常约有三分之二的幼虫为雌性。 雌性的阴门在解剖结构上明显不同于雄性，但由于线虫活动性很强，区分性别需要经过练习。本实验方案最关键的步骤是在第一阶段早期精确区分并分离雄性和雌性个体，否则一旦发育至成虫，将导致混合和不良结果。这使得观察交配行为变得困难。逐渐挑选并转移线虫至载玻片上的水滴中，分别用于雄性和雌性。为确保成功，应由两位不同人员重复检查性别分配。现在，将含有性分离线虫的水滴转移至合适的真菌培养皿中。随后，将处女虫再培养24小时，再观察其交配行为。为观察松材线虫的交配行为，首先准备多个凹面载玻片，向每个凹孔中加入200 µL的水。接下来，挑选一只已准备好的未交配成虫，将其转移至已准备好的载玻片上。将未交配成虫置于孔内约一小时，使其适应新的水性环境。一小时后，使用移液器向孔内加入一只相反性别的未交配成虫。然后，在体视显微镜下观察交配行为，并对行为进行录像，以便进行定量分析。整个交配过程通常在两小时内结束。每30分钟添加50 µL水，以补偿蒸发损失。为研究交配选择与两性间竞争，将两种不同组合的未交配线虫进行分组并观察。未交配成虫的交配成功率约为87%，远高于随机选取的成虫。每对线虫完成整个交配过程平均耗时83分钟，该过程包含四个不同阶段。寻找、接触、交配和逗留。在这些阶段中，可以观察到许多特定的行为模式。当一只雌性遇到多只雄性时，表现出明显的交配选择。雌性通常用头部接触一只雄性，接触部位通常为头部、身体、尾部和生殖区域。随后，雌性会与该雄性交配，或迅速离开并游向另一只雄性。不同线虫组合的交配成功率在首次接触后进行测定。也存在异性间的竞争行为。当一只未交配的雌性与三只未交配的雄性混合饲养时，雄性会尽可能地接近并接触该雌性，以争取与其交配的机会。当雌性的阴门被占据时，其他雄性会试图通过剧烈的身体摆动或拖拽的方式干扰交配过程，以期将正在交配的个体分开。雌性个体间的性间竞争被发现与雄性个体间的性间竞争大体相似。由于性间竞争的存在，不同组合之间的交配频率存在显著差异。该技术建立后，为探索线虫的行为生态学开辟了道路。一旦掌握，此操作若正确进行，可在12天内完成。在尝试此操作时，重要的是要准确地将雄性与雌性分开，并分离早期四龄幼虫以获得处女成虫。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

观察和交配行为的量化在我国松材线虫，松材线虫

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我们展示了一种用于分析影响果蝇Drosophila...

一种检测环境线索对交配行为影响的方法 黑腹果蝇

本文介绍了一种改良的"嗅觉芯片"，用于高效进行秀丽隐杆线虫（C.

使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 C. Elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

交配守护行为在潮间带桡足类Tigriopus属物种的繁殖过程中起着重要作用。然而，针对该行为的研究方法尚未得到充分描述。本文中，我们介绍了两种方法：1）Tigriopus...

Tigriopus 桡足类个体培养及其护配行为的定量分析

本方案描述了针对蚂蚁Vollenhovia...

使用蚂蚁Vollenhovia emeryi进行近交系杂交的诱导与评估

精子必须成功穿过输卵管才能使卵子受精。本文中，我们描述了一种用于检测秀丽隐杆线虫（C.

测量精子导向性与运动能力 秀丽隐杆线虫 雌雄同体生殖道

本文介绍了一种针对松材线虫（Bursaphelenchus...

RNA干扰技术在松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 中的应用

本方案建立了提取和量化秀丽隐杆线虫（C.

秀丽隐杆线虫中挥发性性信息素的提取与化学吸引测定

本方案描述了松材线虫对Pinus pinaster的活体（in vivo）和离体（in...

松树体内与体外感染松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 及诱导挥发物的分离

本方案描述了一种诱导三龄幼虫（预滞育幼虫，JⅢ的 松材线虫 通过氯化钾（KCl）离子的渗透调节进入隐生状态。该方法可为研究生物抗逆机制提供技术支持 B. xylophilus.

诱导第三阶段扩散性幼虫的进入 松材线虫 通过渗透调节进入隐生状态

了解松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）交配行为的观察与量化方法。本方案通过获取处女成虫，帮助研究者精确记录线虫求偶、接触、交配等阶段的行为特征，为线虫行为生态学研究提供可靠基础。

松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 交配行为的观察与量化

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