脑血管内皮细胞中生物能量功能的评估

本实验的总体目标是评估线粒体功能改变如何影响神经系统疾病的发生发展，并设计能够直接作用于血脑屏障开放的治疗策略。该方法有助于回答神经系统疾病领域的一些关键问题，例如，如何在中风后最大限度地减少神经元细胞死亡？该技术的主要优势在于能够对完整活细胞中的线粒体功能进行实时评估。

在T75 cm²培养瓶中，将脑血管内皮细胞于37°C、5%二氧化碳条件下，在完全培养基中培养至80%融合度后，弃去细胞培养基，用胰蛋白酶EDTA洗涤细胞。随后向培养瓶中加入1至2 mL新鲜胰蛋白酶EDTA，在37°C孵育3至5分钟以解离细胞。在倒置显微镜下确认细胞脱落后，轻柔加入10 mL新鲜完全培养基终止反应，并将细胞转移至15 mL锥形离心管中进行离心。

弃去上清液，并用10毫升新鲜的完全培养基重悬沉淀，再次进行离心。然后将沉淀重悬于完全培养基中，调整细胞浓度为每毫升2×10⁵个细胞，用于传代培养。经过适当次数的传代后，将每孔80微升完全培养基中接种1.6×10⁴个细胞，接种至96孔细胞外通量培养板中，并将培养板置于含5%二氧化碳的37°C培养箱中孵育。

待细胞贴壁后，向相应的孔中加入目标处理因素，并将细胞放回培养箱中。在线粒体功能评估实验前一天，用150微升细胞外通量校准液水化细胞外通量检测探针板，并将该板置于37摄氏度、无二氧化碳条件下过夜孵育。次日早晨，使用洗板机将细胞培养基更换为pH 7.0的细胞外通量检测培养基。

然后，将细胞在37摄氏度、无二氧化碳条件下孵育30至60分钟。当细胞达到平衡后，将水化后的芯片装入生物分析仪，并点击“开始”按钮以启动校准。校准结束后，点击“解锁芯片”提示，取下芯片底板并装载细胞板。

然后打开数据文件，从Bioanalyzer中获取速率值，并导出至电子表格文件。由于不同脑血管内皮细胞类型的反应动力学和相对强度存在差异，在这些实验中，使用了一系列浓度的bEnd.3细胞，以确定在代谢谱分析中测量耗氧速率水平的最佳细胞数量。

如所观察到的，基础呼吸、最大呼吸及备用呼吸能力均表现出与细胞密度成比例的变化。然而，当每孔使用最高浓度的细胞时，ATP 生成量下降，表明过度融合的细胞培养状态不适用于该实验。最佳细胞密度似乎出现在每孔细胞数量的中等范围内。

因此，在本项代表性实验中，采用中等细胞浓度评估了预期的耗氧率水平，结果表明非编码前体mRNA分子会降低脑血管内皮细胞的线粒体功能。这些实验还表明，在转染后24小时，这些分子的过表达显著降低了脑血管内皮细胞的最大呼吸速率和备用呼吸能力，尽管基础呼吸速率、ATP生成以及质子泄漏未表现出显著变化。一旦掌握该技术，可在两天内完成全部操作。

从细胞接种到检测线粒体功能，每一步都必须正确操作。在进行该实验流程时，务必牢记：在开展任何其他操作之前，确定最佳的细胞密度极为重要。完成该流程后，还可进一步开展其他方法，如细胞活力检测或糖酵解检测，以探究细胞活力降低或其他代谢通路改变所引起的线粒体功能变化的相关问题。

该技术问世后，为线粒体功能领域的研究人员提供了使用完整细胞而非分离线粒体来研究多种疾病（包括神经系统疾病、癌症或代谢性疾病）的新途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何评估脑血管内皮细胞中的线粒体功能。