在脑血管内皮细胞生物能量功能的评价
November 19th, 2016
内皮细胞线粒体是维持血脑屏障完整性的关键。我们引入一个协议来测量脑血管内皮细胞生物能量的功能。
该程序的总体目标是评估线粒体功能改变如何影响神经系统疾病的发展，并设计对血脑屏障开放有直接影响的治疗方法。这种方法可以帮助回答神经系统疾病领域的关键问题，例如如何最大限度地减少中风后神经元细胞死亡？该技术的主要优点是它可以实时评估整个完整细胞中的线粒体功能。
在完全培养基中培养脑血管内皮细胞后，在 T75 平方的组织培养瓶中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳至 80% 汇合处，弃去细胞培养基，并用胰蛋白酶 EDTA 冲洗细胞。然后向培养瓶中加入 1 至 2 毫升新鲜胰蛋白酶 EDTA，并在 37 摄氏度下分离细胞 3 至 5 分钟。在倒置显微镜下确认细胞已抬起后，轻轻加入 10 mL 新鲜全细胞培养基终止反应，并将细胞转移到 15 mL 锥形管中进行离心。
弃去上清液，在 10 毫升新鲜完全生长培养基中洗涤沉淀，进行另一次离心。然后以每毫升浓度的 2 倍 10 至 5 个细胞重新悬浮在完全生长培养基中进行传代培养。经过适当数量的传代培养后，将 1.6 乘以 10 至第四个细胞接种在每孔 80 微升完全培养基中，接种到 96 孔细胞外通量细胞培养板上，并将板置于 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的培养箱中。
当细胞附着到板上时，将感兴趣的处理添加到适当的孔中，然后将细胞放回培养箱中。在线粒体功能评估测定前一天，用 150 μL 细胞外通量校准液水合细胞外通量审查器盒，并在 37 摄氏度下孵育板过夜，无二氧化碳。第二天早上，使用洗板站将细胞培养基更换为 pH 7.0 细胞外通量测定培养基。
然后，将细胞在 37 摄氏度下孵育 30 至 60 分钟，不含二氧化碳。当细胞平衡后，将水合小柱加载到生物分析仪中，然后单击"开始"按钮开始校准。校准结束时，单击 Unlock Cartridge 提示以移除小柱底板并加载单元板。
然后打开数据文件，从生物分析仪获取速率值，以导出到电子表格文件中。鉴于反应的动力学和相对强度在不同脑血管内皮细胞类型之间是不同的，在这些实验中，一系列浓度的 bEnd .使用 3 个细胞来确定在代谢分析测定中测量耗氧率水平的最佳细胞数。
正如所观察到的，基础和最大呼吸以及备用呼吸能力表现出与细胞密度成比例的反应。然而，当使用每孔最高浓度的细胞时，ATP 的产生会减少，这表明过度融合的细胞培养物不适合实验。最佳细胞密度似乎出现在每孔细胞数的中等范围内。
因此，在这个代表性实验中使用中等范围细胞浓度评估了预期的耗氧率水平，证明非编码前体 mRNA 分子降低了脑血管内皮细胞的线粒体功能。这些实验还表明，转染后 24 小时，这些分子在脑血管内皮细胞中的过表达会显著降低最大呼吸和备用容量，即使基础呼吸、ATP 产生和质子泄漏没有表现出显着变化。一旦掌握，这项技术可以在两天内完成。
从接种细胞到访问线粒体功能，如果执行得当。在尝试此程序时，请务必记住，在开始任何其他程序之前确定最佳细胞密度非常重要。在此程序之后，可以执行其他方法，如细胞活力或糖酵解测定，以回答有关由于细胞活力降低或其他代谢途径的变化而导致的线粒体功能变化的其他问题。
开发后，这项技术为线粒体功能领域的研究人员铺平了道路，以使用分离线粒体内的完整细胞和各种疾病，包括神经系统疾病、癌症或代谢紊乱。看完这个视频，你应该对如何获得脑血管内皮细胞中的线粒体功能有了很好的了解。
概述
本文介绍了一种评估脑血管内皮细胞线粒体功能的协议，这对于维持血脑屏障的完整性至关重要。该方法旨在了解线粒体变化如何导致神经系统疾病。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物能量学
背景
- 线粒体功能对内皮细胞健康至关重要。
- 线粒体活动的改变可能导致神经系统疾病。
- 了解这些机制可以为治疗策略提供信息。
- 实时评估技术对于准确测量至关重要。
研究目的
- 评估线粒体功能如何影响血脑屏障的完整性。
- 开发针对线粒体功能的治疗方法。
- 尽量减少脑卒中等神经事件后的神经元细胞死亡。
使用的方法
- 在完全培养基中培养脑血管内皮细胞。
- 使用胰蛋白酶EDTA进行细胞分离和离心。
- 使用细胞外通量分析仪评估线粒体功能。
- 确定用于准确氧消耗率测量的最佳细胞密度。
主要结果
- 最佳细胞密度产生可靠的线粒体功能评估。
- 非编码前体mRNA分子对线粒体功能产生负面影响。
- 在某些分子过表达的情况下，最大呼吸和备用能力降低。
- 在特定条件下，基础呼吸和ATP生产保持稳定。
结论
- 该技术允许对完整细胞中的线粒体功能进行研究。
- 它可以应用于各种疾病，包括神经系统疾病。
- 未来的研究可以探索线粒体功能与细胞活力之间的关系。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial function in cerebral vascular endothelial cells enables early de-risking of blood-brain barrier (BBB) integrity mechanisms in neurological disease models. Real-time bioenergetic profiling supports predictive confidence in target validation and informs therapeutic strategies aimed at modulating BBB permeability. This capability is critical for portfolio decisions in neurovascular and CNS drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial contributions to BBB stability and neurological disease mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying ATP production, maximal respiration, and spare capacity in intact cells.
- Facilitates mechanistic de-risking of candidate targets affecting endothelial bioenergetics.
- Provides predictive confidence for advancing BBB-modulating therapeutics.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible mitochondrial stress assays for compound screening in CVE cells.
- Optimizes cell density and assay conditions to ensure quantitative, scalable outputs.
- Enables detection of direct mitochondrial effects from novel therapeutics or genetic perturbations.
- Prepares validated biological systems for downstream screening and lead identification workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mitochondrial function data with disease-relevant BBB models for translational continuity.
- Supports preclinical evaluation of BBB-targeted interventions by quantifying bioenergetic endpoints.
- Facilitates risk-adjusted advancement of candidates with demonstrated impact on endothelial metabolism.
- Enables mechanistic linkage between molecular perturbations and functional BBB outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This mitochondrial function assay positions within early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research for neurovascular programs.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial parameters to clarify BBB-related hypotheses and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound and genetic perturbation effects on CVE cell bioenergetics.
- Analytics: Outputs oxygen consumption rates and ATP production metrics for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro mitochondrial data to preclinical BBB integrity and disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating mitochondrial function across multiple neurovascular and metabolic disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in BBB-targeted discovery and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes mitochondrial assays for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by prioritizing validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurovascular therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, mitochondrial bioenergetics, and assay optimization.
- Needs access to extracellular flux analyzers and compatible analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell density and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to both immortalized and primary CVE cell models with protocol optimization.
- Assay sensitivity and cell viability must be validated for each new cell type or perturbation.
