Name: 在脑血管内皮细胞生物能量功能的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 学习评估脑血管内皮细胞线粒体功能的方法，用于研究血脑屏障完整性与神经疾病的关系。该技术可实时检测完整细胞中的生物能量变化，为开发靶向线粒体的治疗策略提供重要依据。

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本研究由以下基金资助：美国心脏协会（AHA）16SDG31170008（资助X.R.）以及美国国立卫生研究院（NIH）P20 GM109098、P01 AG027956和U54 GM104942（资助J.W.S.）。

注意：该实验方案的流程如图1所示，包括各操作步骤的时间线。
1. CVE 细胞的培养与传代
<ol>
	<li>在完全培养基（高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，DMEM）中培养 CVE 细胞（bEnd.3 细胞），培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素，置于 T75 cm2 组织培养瓶中。于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。</li>
	<li>移除并弃去细胞培养液。用 0.25% 胰蛋白酶-0.03% EDTA 溶液冲洗细胞层，然后向培养瓶中加入 1–2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，于 37 °C 孵育 3–5 分钟。在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞层脱落。加入 10 mL 完全培养基，轻轻吹打吸出细胞。</li>
	<li>将液体和细胞转移至 15 mL 离心管中，以 700 × g 离心 5 分钟，以去除细胞碎片。</li>
	<li>弃去离心管中的上清液。加入 10 mL 完全培养基重悬细胞沉淀，再以 700 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去离心管中的上清液。用完全培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至 2.0 × 105 个/mL（使用血细胞计数板计数；通过台盼蓝染色排除死细胞）。 
	注意：新鲜复苏的细胞需传代培养至少 3 代后用于实验。</li>
</ol>
2. 在细胞培养板上接种并处理细胞
<ol>
	<li>将细胞接种于96孔细胞外通量细胞培养板中：每孔80 µL。将细胞培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中。注意：每孔16 × 103个细胞在24小时内可达到60 - 80%的融合度。</li>
	<li>若需对细胞施加化学处理，在细胞贴壁后（接种后8 - 24小时）加入处理试剂。 
	注意：进行转染实验时，完全生长培养基中不得添加抗生素。</li>
</ol>
3. 使用Bioanalyzer评估线粒体功能
<ol>
	<li>在开始检测之前，向微孔板中加入 150 µL 细胞外通量校准液，将细胞外通量传感器微孔板在 37 °C 无 CO2 条件下孵育过夜，以完成水合。</li>
	<li>使用洗板机将细胞培养基更换为 pH 7.0 的细胞外通量检测培养基。将细胞在 37 °C 无 CO2 条件下孵育 30 - 60 分钟。</li>
	<li>在 DMEM 培养基中配制以下工作液：8 µM 寡霉素、4.5 µM FCCP、10 µM 鱼藤酮和 10 µM 抗霉素 A。将 25 µL 储备液分别加入传感器微孔板的加样孔中：A 孔加入寡霉素，B 孔加入 FCCP，C 孔加入鱼藤酮和抗霉素 A，并用细胞外通量检测培养基稀释。按照 表 1 中描述的方案执行检测程序。</li>
	<li>将已完成水合的传感器微孔板装入生物分析仪中，点击 &#34;开始&#34; 按钮进行校准。校准完成后，取下微孔板底板，点击 &#34;卸载微孔板&#34; 提示，装入细胞微孔板。继续运行检测，直至所有测量结束。</li>
	<li>打开数据文件，从生物分析仪中获取速率值，并将数据导出至电子表格文件。</li>
</ol>
4. 数据分析
注意：数据处理的计算方法在下文中列出。这些数值由生物分析仪仪器获得，即 图2 中所示的 OCR。
<ol>
	<li>计算基础呼吸时，用基础值（测量值3）减去非线粒体呼吸（测量值10 - 12）。 
	注：基础呼吸 = 基础值 - 非线粒体呼吸 = 速率③ - 速率⑩~⑫。</li>
	<li>计算ATP生成时，用基础值（测量值3）减去ATP偶联呼吸（测量值4 - 6）。 
	注：ATP生成 = 基础值 - ATP偶联呼吸 = 速率③ - 速率④~⑥。</li>
	<li>计算最大呼吸时，用最大呼吸值（测量值7 - 9）减去非线粒体呼吸（测量值10 - 12）。 
	注：最大呼吸 = 最大呼吸值 - 非线粒体呼吸 = 速率⑦~⑨ - 速率⑩~⑫。</li>
	<li>计算备用容量时，用最大呼吸值（测量值7 - 9）减去基础值（测量值3）。 
	注：备用容量 = 最大呼吸值 - 基础值 = 速率⑦~⑨ - 速率③。</li>
	<li>计算质子漏时，用ATP偶联呼吸（测量值4）减去非线粒体呼吸（测量值10 - 12）。 
	注：质子漏 = ATP偶联呼吸 - 非线粒体呼吸 = 速率④ - 速率⑩~⑫。</li>
</ol>

<ol><li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47(2012).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li>
<li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li>
<li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li>
<li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke%3A+Mitochondrial+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinfect+Dis%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002(2015).</li>
<li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li>
<li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li>
<li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li>
<li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li>
<li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier%3A+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li>
<li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells%3A+A+role+for+mitoBKCa+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350(2015).</li>
</ol>

作者声明，对于本文章的研究、撰写和/或发表不存在任何潜在的利益冲突。本文的开放获取费用由安捷伦科技公司提供。

本方案介绍了一种用于评估脑血管内皮细胞生物能量表型的方法。该方法可作为内皮细胞线粒体功能评价的基础实验，特别适用于旨在研究可能影响脑血管内皮细胞线粒体信号通路的刺激因素之作用机制的实验。同时，该方法也为与血脑屏障破坏相关疾病的潜在治疗手段提供了检测途径。
实验方案中的关键步骤
胞外通量生物分析仪能够实时测量耗氧率（OCR）。在本实验中，确定合适的细胞密度至关重要。若每孔细胞密度低于 8 × 103 个细胞，基础耗氧率过低，无法进行分析（图 2 和 图 3）；若每孔细胞密度高于 32 × 103 个细胞，细胞对寡霉素或FCCP处理无响应（图 2 和 图 3）。在本实验模型中，该细胞系的最佳细胞密度为每孔 16 × 103 个细胞，此条件下结果可重复，且对刺激7和处理10,14具有敏感性。若使用24孔生物分析仪，则需重新进行细胞密度的梯度优化。
已有文献记载，与其他内皮细胞或组织类型相比，脑血管内皮细胞（CVEs）含有大量的线粒体15,16，这表明其对能量生成的需求更高，因而可用于生物能量代谢检测的细胞数量更少。我们已测试了多种脑内皮细胞，包括原代和永生化的小鼠脑血管内皮细胞7，以及永生化的人脑血管内皮细胞（未发表数据）。在进行生物能量代谢检测时，这些细胞需要相似的细胞密度才能达到可接受的耗氧率（OCR）（96孔板的基底呼吸OCR为40–160 pmol/min，24孔板为50–400 pmol/min）。Kaczara 等报道了在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中检测生物能量代谢，其使用的细胞密度更高17。
本研究团队未评估来自其他组织或器官的血管细胞。理论上，该生物分析仪可能适用于任何细胞类型，但需要针对细胞密度、细胞培养基和培养条件优化实验方案（某些特定细胞可能需要包被培养板才能良好生长）。必须完成实验以确保氧消耗率（OCR）处于可接受范围内。如果来自其他器官的内皮细胞的OCR低于脑源性血管内皮细胞（CVEs），则提高细胞密度有助于使OCR达到可接受范围。此外，若细胞不以氧化磷酸化为主要能量来源，则该生物分析仪将不是最优的检测方法。
生物分析仪可根据试剂添加顺序，依次破坏电子传递链。首先加入寡霉素，抑制线粒体复合物V（ATP合酶）；其次加入电子解偶联剂FCCP，破坏质子梯度；最后加入鱼藤酮和抗霉素A，分别抑制线粒体复合物I和复合物III，从而完全阻断电子传递。药物暴露顺序至关重要，因为这些药物可特异性阻断电子传递链中的反应步骤，通过测量依次发生的变化，可反映线粒体功能。
修改与故障排除
为评估CVE细胞中线粒体对刺激的反应，建议在细胞贴壁于培养板底部后施加刺激（参见图1所示时间线；通常至少需要6小时）。为获得可重复的处理结果，保持细胞密度一致极为重要。若实验设计中包含接种前的预处理步骤，则应仔细测定每种预处理条件下的细胞密度，并在接种时排除死细胞。若实验涉及转染操作，请参照试剂生产商提供的转染方案。如图4所示数据中所展示，使用脂质体转染试剂盒将miR-34a转染至CVE细胞，该过程需使用不含抗生素的细胞培养基，并通过线粒体应激测试评估miR-34a过表达后代谢功能的变化。质粒用量也可根据既往文献进行优化13。此外，还可对本方案进行其他调整，例如改变试剂的浓度。可完成寡霉素、FCCP和/或鱼藤酮与抗霉素A的浓度梯度曲线实验。
此外，如果本实验用于多种药物的高通量分析，建议同时进行细胞活力和细胞增殖的平行实验，相关方法已在我们之前的出版物中描述7,13。OCR 值受细胞数量影响显著（图 2 和 图 3），而细胞增殖和活力实验有助于数据的标准化。然而，这些实验是否开展由各实验室自行决定。
该技术的局限性
该方案的主要局限性在于我们仅使用了一种 体外 研究中使用的细胞培养模型。目前尚无可用的 离体 可用于研究内皮细胞线粒体功能的模型或动物模型。预计将会开发出新的模型以评估生物能量功能 体内 和 离体 在今后的研究中
另一个局限性在于完成生物能量学检测后难以继续进行屏障功能评估。此类实验无法实施的原因有两点：首先，在完成生物能量学检测后，电子传递链被完全破坏，导致细胞活力显著下降；其次，检测生物能量学参数需要使用特定的细胞培养板和插件，而这些装置与用于屏障功能评估的插件不兼容。因此，在生物能量学检测之后可进行的功能性检测十分有限。然而，未来有望开发出特殊设备，以便在进行生物能量学检测之前完成功能性检测。
该技术相对于现有/替代方法的重要性
以往评估线粒体功能的技术需要将线粒体从细胞中分离出来18。这种利用生物分析仪的新技术能够在完整细胞中测量线粒体活性，相较于评估分离的线粒体，更能保持细胞原有的微环境。
掌握该技术后的未来应用或发展方向
本方案专为 bEnd.3 细胞系设计和开发，但也适用于原代脑血管内皮（pCVE）细胞7或其他内皮细胞，我们已在先前使用 pCVE 细胞的研究中证实了这一点7。当使用其他类型的内皮细胞时，可能需要对培养板进行包被并添加生长因子。然而，滴定实验同样推荐用于其他细胞类型。本方案提供了一种通用方法，可用于评估 CVE 细胞的生物能量学特性，并可进一步应用于相关机制研究或治疗反应的分析。

人们普遍认为，由脑血管内皮（CVE）细胞形成的血脑屏障（BBB）具有非常独特且重要的功能，对血管生物学至关重要。这些内皮细胞利用线粒体产生大部分三磷酸腺苷（ATP），作为细胞化学能的来源。除了为CVE细胞提供ATP外，线粒体还调控血管内皮细胞中的多种细胞过程，如细胞信号传导1-4、细胞凋亡5以及细胞周期和细胞生长的调控6。 CVE细胞中线粒体生物能量功能的失调可能影响线粒体生物合成，导致血管内皮功能受损，并加剧脑血管疾病和神经退行性疾病，例如，脑卒中7,8和阿尔茨海默病（AD）9。我们已证明，脂多糖（LPS）暴露后对CVE细胞的损伤会损害其线粒体功能，并加重脑卒中的预后7。叔丁基对苯二酚（tBHQ）通过干扰CVE细胞中的氧化磷酸化过程，增加脑卒中死亡率10。因此，CVE细胞生物能量功能的定量模型不仅为中枢神经系统（CNS）疾病的机制相关研究提供了先导平台，也为靶向血管生物学中线粒体功能的药物筛选带来了突破。
已分离的线粒体可用于测量生物能量功能。我们7及其他研究者11曾报道利用细胞外通量生物分析仪对完整的心血管内皮（CVE）细胞中的细胞生物能量学进行评估。该分析仪具有可评估内源性细胞生物能量状态的优势。这一灵敏且稳定的检测方法可测量CVE细胞的线粒体代谢，可用于评估刺激因素引起的生物能量损伤、研究线粒体信号通路的机制，以及筛选影响CVE细胞线粒体功能的药物或治疗方法。生物分析仪采用药理学分析方法，结合使用四种线粒体干扰剂——寡霉素（oligomycin）、羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）、鱼藤酮（rotenone）和抗霉素A（antimycin A），记录氧气消耗率（OCR）。在本实验方案中，我们详细描述了一种优化的方法，可在单次检测中实现对CVE细胞线粒体功能参数的测量与计算，包括基础线粒体呼吸、ATP生成、质子泄漏、最大呼吸和备用呼吸能力。

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 代</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>终浓度 10%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1&amp;times;100 储存液</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，0.03% EDTA 溶液</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>终浓度 1.0 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>CAS 50-99-7</td><td>终浓度 25 mM</td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>终浓度 1.0 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>羰基氰-4-三氟甲氧基苯腙（FCCP）</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>终浓度 0.5 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>终浓度 1.0 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>终浓度 1.0 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>板洗站</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞外通量分析仪&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>细胞外通量细胞培养板</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>细胞外通量传感器微孔板</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>细胞外通量校准液</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>细胞外通量检测培养基</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>检测前调节 pH</td></tr></tbody></table>

脑血管内皮细胞中生物能量功能的评估

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

血脑屏障（BBB）的完整性对于防止脑损伤至关重要。脑血管内皮（CVE）细胞是构成血脑屏障的细胞类型之一；这些细胞具有极高的能量需求，需要线粒体功能处于最佳状态。在疾病或损伤情况下，这些细胞的线粒体功能可能发生变化，从而导致疾病或损伤的发生。&#160;血脑屏障的开放。在本文中，我们介绍了一种利用完整活细胞和生物分析仪检测脑血管内皮（CVE）细胞线粒体功能的方法。通过线粒体应激测试，可对经物理或化学方式扰动的细胞进行功能挑战，并评估其生物能量学功能。此外，该方法还可用于筛选对线粒体功能具有直接作用的新型治疗药物。我们已优化了细胞密度，以获得可用于计算多种线粒体参数的氧气消耗率，包括ATP生成、最大呼吸速率和备用呼吸能力。我们还通过实验证明，引入特定干预后该检测方法具有良好的敏感性&#160;microRNA miR-34a 可导致线粒体活性显著且可检测的下降。本文所示数据虽针对 bEnd.3 细胞系进行了优化，但我们也对原代 CVE 细胞的实验方案进行了优化，进一步提示其在临床前及临床模型中的应用价值。

为了评估氧化应激条件下脑血管内皮（CVE）细胞的生物能量功能，我们选择了具有与原代脑微血管内皮细胞相似屏障特性的鼠脑微血管内皮细胞系 bEnd.312。鉴于不同细胞类型在反应动力学和相对强度上存在差异，我们首先设计了一系列实验，以确定用于代谢谱分析实验中最适宜的 bEnd.3 细胞数量，从而获得可测量的耗氧率（OCR）水平，结果如图2所示。评估后，数据被量化并展示于图3中。基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力均随细胞密度呈比例性变化。然而，当每孔接种细胞数达到 64 × 103 时，ATP 生成量下降，提示过度融合的细胞培养状态不适用于本实验。根据对线粒体干扰剂的反应，最适细胞密度范围为每孔 8 - 32 × 103 个细胞。
在后续实验中，采用每孔16 × 103个细胞的接种密度，以实现对OCR变化的最佳检测。使用每孔16 × 103个细胞的条件，我们观察到了OCR的预期反应，并证明了microRNA miR-34a可降低CVE细胞的线粒体功能（图4）。我们此前已报道，miR-34a在这些细胞中可降低氧化磷酸化水平13。重复实验还显示，在转染后24小时，miR-34a的过表达显著降低了CVE细胞的最大呼吸速率和备用呼吸能力，尽管基础呼吸、ATP生成和质子泄漏未发生显著变化（图4）。这些数据表明，该生物分析仪能够灵敏地检测CVE细胞中线粒体功能的变化。
<img alt="细胞培养工作流程图：细胞传代、处理、通量分析、数据分析步骤。" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 实验的策略规划。 图中显示了细胞、培养板和试剂盒准备的时间安排。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞代谢；图表；随时间变化的耗氧率（OCR）；多种处理条件的分析。" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 不同细胞密度下 CVE 细胞生物能量功能的代表性原始数据。 在不同细胞密度的 CVE 细胞中测定了耗氧率。数据表示为均值 ± 标准差（n = 5）；OCR：耗氧率；FCCP：羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙；Rot/Anti-A：鱼藤酮和抗霉素 A。①、② 和 ③ 表示基础呼吸；④、⑤ 和 ⑥ 表示与 ATP 合成相关的呼吸；⑦、⑧ 和 ⑨ 表示最大呼吸；⑩、⑪ 和 ⑫ 表示非线粒体呼吸。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞呼吸分析；OCR与细胞数量的柱状图；基础呼吸、ATP、最大呼吸、备用呼吸、质子漏。" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 不同细胞密度下CVE细胞生物能量功能的代表性结果。 基础呼吸、ATP生成、最大呼吸和备用能力是根据图2中生物能量功能实验产生的原始数据，利用第4节中所示公式计算得出。数据表示为均值±标准差（n = 5）；OCR：氧气消耗速率。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="线粒体呼吸分析图，柱状图；OCR 随时间变化、ATP 生成、最大呼吸。" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：miR-34a 导致生物能量功能下降的代表性结果。（A）转染后 24 小时过表达 miR-34a 后线粒体功能的原始数据。（B）基础呼吸、ATP 生成、最大呼吸和备用能力由 图 4A 中生物能量功能实验产生的原始数据计算得出；各参数按第 4 节中所示公式进行计算。miR-34a 的过表达在转染后 24 小时显著降低 CVE 细胞中的线粒体功能。数据表示为均值 ± 标准差（n = 5）；OCR：氧消耗率。****，P &lt; 0.0001。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于分析的时间循环中带有校准和注射步骤的细胞代谢过程图。" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Table 1"> 
表1. 仪器运行程序。

内皮细胞的线粒体对于维持血脑屏障的完整性至关重要。我们介绍了一种用于测量脑血管内皮细胞生物能量功能的实验方案。

血脑屏障（BBB）的完整性对于防止脑损伤至关重要。脑血管内皮（CVE）细胞是构成该屏障的主要细胞类型之一……

本实验的总体目标是评估线粒体功能改变如何影响神经系统疾病的发生发展，并设计能够直接作用于血脑屏障开放的治疗方法。该方法有助于回答神经系统疾病领域的一些关键问题，例如，如何在中风后最大限度地减少神经元细胞死亡？该技术的主要优势在于，它能够对完整活细胞中的线粒体功能进行实时评估。在T75 cm²培养瓶中，将脑血管内皮细胞于37°C、5% CO₂条件下，在完全培养基中培养至80%融合度后，弃去细胞培养基，用胰蛋白酶EDTA洗涤细胞。随后向培养瓶中加入1至2 mL新鲜胰蛋白酶EDTA，在37°C孵育3至5分钟以解离细胞。在倒置显微镜下确认细胞脱落后，轻柔加入10 mL新鲜完全培养基终止反应，并将细胞转移至15 mL锥形离心管中进行离心。弃去上清液，并用10毫升新鲜的完全培养基重悬沉淀，进行再次离心。然后将沉淀重悬于完全培养基中，调整浓度为每毫升2×10⁵个细胞，用于传代培养。经过适当次数的传代后，将每孔80微升完全培养基中接种1.6×10⁴个细胞，接种至96孔细胞外通量细胞培养板中，并将培养板置于含5%二氧化碳的37°C培养箱中孵育。待细胞贴壁后，向相应孔中加入目标处理因素，并将细胞放回培养箱中继续孵育。在线粒体功能评估实验前一天，用150微升细胞外通量校准液润湿细胞外通量检测探针板，并将该板置于37摄氏度、无二氧化碳条件下过夜孵育。次日早晨，使用洗板机将细胞培养基更换为pH 7.0的细胞外通量检测培养基。然后，将细胞在37摄氏度、无二氧化碳条件下孵育30至60分钟。当细胞达到平衡后，将水化后的芯片装入Bioanalyzer，并点击“开始”按钮以启动校准。校准结束后，点击“解锁芯片”提示，取下芯片底板并装载细胞板。然后打开数据文件，从Bioanalyzer中获取速率值，并导出至电子表格文件。由于不同脑血管内皮细胞类型的反应动力学和相对强度存在差异，在本实验中，采用一系列浓度的bEnd.3细胞，以确定在代谢谱分析中用于测定氧消耗率水平的最佳细胞数量。如所观察到的，基础呼吸、最大呼吸及备用呼吸能力均表现出与细胞密度成比例的变化趋势。然而，当每孔细胞浓度达到最高时，ATP 生成量下降，表明过度融合的细胞培养状态不适用于本实验。最佳细胞密度似乎出现在每孔细胞数量的中等范围内。因此，在本项代表性实验中，采用中等浓度的细胞评估了预期的氧消耗率水平，结果表明非编码前体mRNA分子会降低脑血管内皮细胞的线粒体功能。这些实验还表明，在转染后24小时，这些分子的过表达显著降低了脑血管内皮细胞的最大呼吸速率和备用呼吸能力，尽管基础呼吸、ATP生成和质子泄漏未表现出显著变化。该技术一旦掌握，可在两天内完成。从细胞接种到检测线粒体功能，每一步都必须正确操作。在进行该实验流程时，需牢记在开展其他任何操作前，确定最佳的细胞密度极为重要。完成该流程后，还可进行其他检测方法，如细胞活力检测或糖酵解分析，以进一步探究因细胞活力下降或其他代谢通路改变所引起的线粒体功能变化。该技术问世后，为线粒体功能领域的研究人员提供了使用完整细胞而非分离线粒体来研究多种疾病（包括神经系统疾病、癌症或代谢性疾病）的新途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何评估脑血管内皮细胞中的线粒体功能。

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在脑血管内皮细胞生物能量功能的评价

本方法描述了如何从小鼠脑组织中分离并永生化微血管内皮细胞。我们介绍了一套从脑组织匀浆、消化处理、细胞接种到细胞永生化的逐步实验方案。通常需要约五周时间获得均一的、可永生化的微血管内皮细胞系。...

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

本视频演示了使用细胞外通量分析法评估脑血管内皮（CVE）细胞的线粒体功能。将CVE细胞接种于细胞外通量细胞培养板中。在将细胞外通量传感器装入生物分析仪前，需对其进行水合、加载及校准。随后将含有细胞的培养板装入仪器进行分析。...

评估脑血管内皮细胞中的线粒体功能

内皮功能障碍与多种疾病状态相关，并可预测人类不良心血管事件。血流介导的血管舒张（FMD）是一种评估内皮功能的无创超声方法。方法学选择和操作者经验可能影响结果。本文讨论了在人类研究中系统化实施FMD的方案。...

临床研究中肱动脉内皮依赖性血流介导血管舒张功能的超声评估

脑微血管内皮细胞（BMEC）通过特定的连接蛋白相互连接，形成高度调控的屏障，将血液与中枢神经系统（CNS）分隔开来，即所谓的血脑屏障（BBB）。本方案所述的原代小鼠脑微血管内皮细胞的分离，可实现对BBB进行深入的体外研究。...

分离原代小鼠脑微血管内皮细胞

本文介绍了在医学研究中常用于评估动脉粥样硬化不同阶段的多种血管功能和形态无创检测方法的方法学考量。...

一种无创评估血管功能与形态的方法学途径

我们描述了一种简单的基于细胞的生物测定法，用于检测、定量和监测血管内皮生长因子配体家族成员的活性。该检测方法利用在因子依赖性细胞系中表达的嵌合受体，对配体介导的受体结合与交联提供半定量或定量评估。...

一种用于评估血管内皮生长因子的简易生物测定法

本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。...

同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

我们介绍了三种简单的体外实验方法——长距离迁移实验、共培养迁移实验和化学趋化实验，这些实验共同评估了人干细胞来源的室管膜周围内皮细胞的功能及其与GABA能中间神经元的相互作用。...

人干细胞来源的内皮细胞与GABA能神经元的迁移、趋化吸引及共培养实验

本文展示了从小鼠脑实质小动脉中大量制备完整脑微血管内皮"管状结构"的方法，用于研究脑血流调节机制。此外，我们还阐述了该内皮细胞研究模型在荧光成像和电生理学检测中的实验优势，可应用于关键细胞信号通路的分析，包括细胞内[Ca2+]浓度变化和膜电位变化。...

小鼠脑实质微动脉内皮细胞的分离与功能分析

本方案描述了一种可靠且高效的 体外...

bEnd.3 血管内皮细胞屏障功能完整性记录 通过 跨内皮电阻力检测

在此，我们演示了使用基于阻抗的生物传感器（ECIS 和 cellZscope）测量脑血管内皮屏障强度的技术。我们详细介绍了制备过程以及向系统中添加各种刺激物的方法和技术。 体外...

利用两种基于阻抗的生物传感器测量癌细胞和细胞因子刺激下脑血管内皮屏障完整性的变化

学习评估脑血管内皮细胞线粒体功能的方法，用于研究血脑屏障完整性与神经疾病的关系。该技术可实时检测完整细胞中的生物能量变化，为开发靶向线粒体的治疗策略提供重要依据。

脑血管内皮细胞中生物能量功能的评估

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