Name: 头孢哌酮治疗小鼠模型的临床相关的艰难梭菌应变R20291 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 了解头孢哌酮小鼠模型用于艰难梭菌感染研究的方法。该方案涵盖临床监测、细菌计数、毒素活性检测及组织病理学分析，为研究R20291菌株致病机制和开发新疗法提供可靠平台。

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作者谨此感谢威康信托桑格研究所的 Trevor Lawley 提供本论文中使用的 C. difficile R20291 孢子，以及北卡罗来纳州立大学兽医学院的 James S. Guy 提供的 Vero 细胞。动物组织病理学分析在北卡罗来纳大学教堂山分校的 LCCC 动物组织病理学核心设施完成，Traci Raley 和 Amanda Brown 提供了特别协助。LCCC 动物组织病理学核心设施的部分支持来自美国国家癌症研究所中心核心支持拨款（2P30CA016086-40），该拨款授予北卡罗来纳大学 Lineberger 综合癌症中心。我们还要感谢 Vincent Young、Anna Seekatz、Jhansi Leslie 和 Cassie Schumacher 就 Vero 细胞细胞毒性检测方案提供的有益讨论。JAW 由美国国立卫生研究院（NIH）资助的露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖研究培训拨款 T32OD011130 支持。CMT 由美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所（NIGMS）的代谢组学职业发展奖拨款 K01GM109236 资助。

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</ol>

作者们目前无任何披露事项。

本方案描述了经抗生素处理后接种 C. difficile R20291 芽孢的小鼠在感染过程中的临床病程，包括体重减轻、细菌定植、毒素细胞毒性以及胃肠道组织病理学变化。在该方案中，有多个关键步骤需要特别注意细节。准确计算 C. difficile 芽孢接种量至关重要，该计算基于原始 C. difficile 芽孢储备液的计数结果，且在启动本方案前应确保多次芽孢计数结果具有一致性。若接种量计算错误，将导致小鼠接种剂量不准确。同样，依据该计算结果进行的 C. difficile 芽孢制备与稀释操作也必须谨慎执行，任何稀释误差均会导致起始芽孢接种量不准确。最后，应采取预防措施避免抗生素处理的对照组小鼠（未接种 C. difficile 芽孢）受到污染。经头孢哌酮处理的小鼠极易被 C. difficile 定植，因此不得与 C. difficile 感染小鼠直接接触28-30。若能充分注意上述关键步骤，则可预期成功建立艰难梭菌感染（CDI）小鼠模型。
<p class='jove_conte...

Clostridium difficile 是一种厌氧、革兰氏阳性、可形成芽孢的杆菌，可引起危及生命的腹泻1。C. difficile 感染（CDI）与人类发病率和死亡率升高相关，每年导致超过 48 亿美元的医疗支出1-4。2013 年，美国疾病控制与预防中心（CDC）将 C. difficile 列为紧急抗生素耐药威胁，表明其对公共健康构成紧急威胁1。目前，使用万古霉素和甲硝唑进行抗生素治疗被视为 CDI 的标准治疗方案5。然而，抗生素治疗成功后 CDI 的复发率较高，约 20–30% 的患者会出现复发2,5-7。因此，迫切需要发现针对该肠道病原体的新型治疗方法。为了评估针对 C. difficile 的治疗手段，需要建立一种能够模拟临床相关菌株所致人类疾病的动物模型。
最初，1977年利用克林霉素处理的叙利亚仓鼠模型建立了针对C. difficile的科赫法则8。该模型至今仍被用于研究C. difficile毒素在致病过程中的作用9,10。然而，仓鼠模型中的艰难梭菌感染（CDI）会导致极高的死亡率，且无法模拟人类CDI中可能出现的慢性隐匿性病变表现10,11。鉴于小鼠模型在研究中具有良好的可及性和丰富的试剂资源，建立小鼠CDI模型具有重要意义。
2008年，通过在饮水中给予小鼠抗生素混合物（卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素、甲硝唑和万古霉素）处理3天，随后腹腔注射克林霉素12，建立了一种稳定的艰难梭菌感染（CDI）小鼠模型。该方法使小鼠对CDI和严重结肠炎易感。根据接种菌量的不同，利用该模型可观察到一系列临床症状及死亡率。自此以来，已有多种抗生素处理方案被研究，这些方案可改变小鼠肠道微生物群，降低定植抗性，从而使C. difficile得以在胃肠道内定植（详见Best et al. 和 Lawley &amp;#38; Young的综述）13,14。
最近，通过饮水给予小鼠广谱头孢菌素头孢哌酮，连续5天或10天，可稳定地使小鼠对艰难梭菌感染（CDI）易感。15由于三代头孢菌素的使用与人类艰难梭菌感染（CDI）风险增加相关，因此采用头孢哌酮模型能更准确地反映自然发生的疾病情况16. 头孢哌酮处理后对小鼠易感的 C. difficile 已同时接受两种挑战 C. difficile 各种具有不同临床相关性和毒力的菌株的孢子和营养细胞17尽管一些原始研究采用了 C. difficile 以营养细胞作为感染形式， C. difficile 孢子被认为是主要的传播方式18.
近十年来，C. difficile R20291（一种NAP1/BI/027型菌株）出现，并引发了艰难梭菌感染（CDI）的流行19,20。本研究旨在明确当经头孢哌酮处理的小鼠感染临床上相关且遗传操作便利的 C. difficile 菌株R20291时，疾病的临床进程。本方案详细描述了感染 C. difficile R20291 芽孢后小鼠的临床病程，包括体重减轻、细菌定植、毒素细胞毒性以及胃肠道组织的组织病理学变化。总体而言，该小鼠模型是一种可模拟人类疾病的有价值的实验平台。因此，这一已明确特征的小鼠模型可用于评估新型治疗手段在缓解临床症状以及恢复对 C. difficile 的定植抗性方面的作用。

<table><tbody><tr><td>#62 Perisept 杀孢子消毒清洁剂&amp;nbsp;</td><td>SSS Navigator</td><td>48027</td><td>该产品需按照制造商推荐进行稀释</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-3</td><td>可用于 Vero 细胞检测中单个样品的滤板替代方案</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>使用前需在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1% 青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>10% 热灭活胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td>使用前需在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>1 ml 塑料注射器&amp;nbsp;</td><td>BD Medical Supplies</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 微量离心管带螺帽</td><td>Corning</td><td>430917</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底细胞培养板</td><td>Costar Corning</td><td>CL3595</td><td></td></tr><tr><td>96 孔滤膜板</td><td>Millipore</td><td>MSGVS2210</td><td></td></tr><tr><td>粘性封口膜</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>Bacto 蛋白胨</td><td>Becton Dickinson</td><td>211684</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>头孢哌酮</td><td>MP Bioworks</td><td>199695</td><td></td></tr><tr><td>头孢西丁</td><td>Sigma</td><td>C47856</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>艰难梭菌抗毒素试剂盒</td><td>Tech Labs</td><td>T5000</td><td>用作 Vero 细胞检测的对照</td></tr><tr><td>艰难梭菌毒素 A</td><td>List Biological Labs</td><td>152C</td><td>Vero 细胞检测的阳性对照</td></tr><tr><td>D-环丝氨酸</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Gibco</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x 培养基</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>使用前需在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>果糖</td><td>Fisher</td><td>L95500</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Bright-Line, Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（无水）</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 &amp;mu;m 滤器</td><td>Millex-GS</td><td>SLGS033SS</td><td>TCCFA 平板用滤器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>10 号一次性手术刀片</td><td>Miltex, Inc</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>PCR 板</td><td>Fisherbrand</td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>Kord-Valmark Brand</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>无菌塑料 L 形涂布棒</td><td>Fisherbrand</td><td>14-665-230</td><td></td></tr><tr><td>注射器推进器</td><td>Dymax Corporation</td><td>T15469</td><td></td></tr><tr><td>牛磺胆酸盐</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td>TCCFA 平板的组分之一（见下文）</td></tr><tr><td>超纯蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>小鼠年龄应为 5–8 周</td></tr><tr><td>Olympus BX43F 光学显微镜</td><td>Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DP27 相机</td><td>Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens Dimension 软件&amp;nbsp;</td><td>Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

经头孢哌酮处理的临床相关小鼠模型 艰难梭菌 菌株 r20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile 是一种厌氧、革兰氏阳性、可形成芽孢的肠道病原体，与日益增加的发病率和死亡率相关，因而对公共卫生构成紧迫威胁。在使用抗生素成功治疗后，C. difficile 感染（CDI）的复发率很高，约20–30%的患者会出现复发，因此迫切需要发现针对该病原体的新型治疗方法。目前的CDI动物模型往往导致高死亡率，因而无法模拟人类CDI中常见的慢性、隐匿性疾病的临床表现。为了评估针对 C. difficile 的治疗手段，亟需一种采用临床相关菌株、能够模拟人类疾病特征的小鼠模型。本实验方案详细描述了使用一种具有临床相关性且遗传背景清晰的菌株R20291建立的头孢哌酮诱导的小鼠CDI模型，以及在该模型中进行临床疾病监测、C. difficile 细菌计数、毒素细胞毒性检测和组织病理学变化分析的技术方法。与其他CDI小鼠模型相比，该模型在所用剂量下不会导致全部动物死亡，因而能够观察到与人类疾病进程一致的较长临床病程。因此，这种头孢哌酮诱导的CDI小鼠模型为评估新型治疗手段在缓解临床症状以及恢复对 C. difficile 定植抗性方面的效果提供了一个有价值的实验平台。

在一项代表性研究中，5周龄的C57BL/6野生型小鼠通过饮水给予头孢哌酮（0.5 mg/ml）预处理5天，随后给予普通饮水清洗2天。在第0天，通过口服灌胃给予小鼠105个C. difficile R20291孢子进行攻毒（图1A）。随后对小鼠进行为期14天的体重变化及艰难梭菌感染（CDI）临床症状（如嗜睡、食欲减退、腹泻和弓背姿势）的监测。C57BL/6野生型小鼠经C. difficile R20291孢子攻毒后，通常在24小时内出现腹泻，并在攻毒后48小时内出现显著的体重下降（图1B）。尽管本实验中未观察到此类情况，但若使用更高剂量的C. difficile R20291进行攻毒，小鼠可能在攻毒后48至72小时内病情严重或体重下降超过20%，此时需实施人道安乐死。因此，小鼠在接种C. difficile孢子后至少需每日观察两次。
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本方案概述了使用临床相关且遗传上易于操作的菌株 R20291 建立头孢哌酮诱导的小鼠Clostridium difficile感染（CDI）模型的方法。该方案详细描述了在小鼠模型中对临床疾病监测、C. difficile细菌计数、毒素细胞毒性以及CDI过程中组织病理学变化的评估。

经头孢哌酮处理的临床相关小鼠模型 艰难梭菌 菌株 R20291

艰难梭菌是一种厌氧、革兰氏阳性、可形成芽孢的肠道病原体，与日益增加的发病率和死亡率相关……

本实验方案的总体目标是提供一种分步实施头孢哌酮小鼠艰难梭菌感染模型的详细指南，重点强调临床疾病监测、细菌计数、毒素细胞毒性以及攻毒后的组织病理学变化。该详细方案将帮助研究人员准确建立艰难梭菌感染的小鼠模型，这对于研究该细菌的致病机制以及评估新型治疗方法至关重要。使用该小鼠模型的主要优势在于，仅需让小鼠暴露于一种抗生素五天，即可使其易于被艰难梭菌定植，并产生与人类疾病相似的持续性临床感染过程。首先，取所需的目标 C. difficile 菌株并涡旋混匀。在超净工作台内，将菌株用无菌水在带螺帽的离心管中稀释，使浓度达到每 25 µL 含 10⁵ 个芽孢。将该混合液标记为芽孢接种物，并将离心管置于 65 °C 水浴中 20 分钟。接下来，在超净工作台中，用移液器吸取50 µL加热后的孢子接种物，转移至无菌微量离心管中，并将其放入厌氧室中暂存备用。将剩余的孢子接种物装入连接无菌球状头胃灌注针头的一毫升注射器中。在超净工作台内，取一只实验小鼠，通过轻柔地抓住其颈部和背部的松弛皮肤来固定头部。用食指固定小鼠头部，确保动物不发出声音或表现出痛苦迹象，进一步固定头部并拉长食道。保持小鼠直立、垂直的姿势，将灌胃针轻轻从口腔侧边插入。将灌胃针沿口腔顶部引导，并缓慢推进食道。当针头插入食道约一半深度时，注入 25 微升孢子接种物，然后轻柔地拔出针头。将动物放回笼中，观察其是否有咳嗽或呼吸困难等迹象，这些可能提示意外将接种物注入气管。接下来，取之前在厌氧舱中保存的孢子接种物分装样品以及剩余的灌胃用孢子接种物，用 180 微升 1× PBS 进行 10 倍系列稀释。 进行四到五次此类稀释。采用无菌技术，将每种连续稀释液各100微升分别转移至各自的TCCFA平板。每次使用新的无菌L形涂布棒，将稀释的接种物均匀涂布于各平板表面。将平板置于37摄氏度的厌氧条件下孵育24小时。最后，计数每个稀释平板上的艰难梭菌菌落，并计算菌落形成单位，以确定给予小鼠的感染剂量。为评估目的采集小鼠粪便样本时，首先用手指轻轻但牢固地捏住小鼠颈部和背部的松弛皮肤以固定动物，确保小鼠未受到痛苦。用小指轻轻抬起动物的尾巴，暴露肛门。将一支已知重量的无菌微量离心管直接置于动物肛门下方，确保管子不直接接触小鼠。当动物排便时，将粪便颗粒收集到管中。将试管在室温下保存，直至收集完所有必要的样品。使用分析天平称量含有粪便的试管，并记录质量至小数点后四位。通过减去试管的重量，计算粪便颗粒的重量。接下来，将内容物进行1到10倍稀释，并重悬于1×PBS中。用移液器枪头轻轻将粪便物质分散至溶液中。将样品在室温下孵育30分钟，使内容物沉淀。在厌氧条件下保存溶液，用1x PBS对每个样品进行连续稀释。将每种连续稀释液各100 µL转移至TCCFA平板。使用无菌的L形涂布棒将样品均匀涂布于平板表面。将平板置于37摄氏度的厌氧条件下孵育24小

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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经头孢哌酮处理的临床相关小鼠模型艰难梭菌菌株 R20291

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