头孢哌酮治疗小鼠模型的临床相关的艰难梭菌应变R20291
2016年12月10日
该协议概述了使用临床相关和转听话应变，R20291 艰难梭菌感染（CDI）的头孢哌酮小鼠模型。临床疾病的监测， 艰难梭菌细菌枚举，毒素的细胞毒作用，并在小鼠模型中在整个CDI病理学改变强调在协议中详述。
该方案的总体目标是为实施艰难梭菌感染的头孢哌酮小鼠模型提供分步指南，特别强调临床疾病监测、细菌计数、毒素细胞毒性和挑战后的组织病理学变化。该详细的方案将帮助研究人员准确执行艰难梭菌感染的小鼠模型，这对于研究该细菌的发病机制和获得新的治疗方法至关重要。使用这种小鼠模型的主要优点是，暴露于一种抗生素 5 天使小鼠易受艰难梭菌定植的影响，并且并发于人类疾病的感染临床病程延长。
首先，取感兴趣的艰难梭菌原种菌株并涡旋。在层流罩中，将原液在螺旋盖管中的无菌水中稀释至每 25 微升 10 至 5 个孢子的浓度。将混合物标记为孢子接种物，并将试管放入 65 摄氏度的水浴中 20 分钟。
接下来，在层流罩中，将 50 微升加热的孢子接种物移液到无菌微量离心管中，并将其送入厌氧室直至进一步使用。将剩余的孢子接种物装入连接到无菌球头胃管饲针的 1 毫升注射器中。在层流罩中，取一只主题小鼠，并通过轻轻地用颈部和背部松弛的皮肤束缚动物来固定头部。
使用食指，并确保动物不发声或表现出痛苦的迹象，进一步固定动物的头部并拉长食道。将鼠标保持在直立、垂直的位置，然后轻轻地将管饲针插入口腔侧面。将管饲针沿口腔顶部引导，然后慢慢将其推进到食道中。
一旦针头大约进入食道的一半，注射 25 微升孢子接种物，然后轻轻抽出针头。将动物放回笼子里，观察它是否有任何可能表明无意中气管给药的咳嗽或呼吸窘迫迹象。接下来，取先前储存在厌氧室中的孢子接种物等分试样和任何剩余的管饲孢子接种物，并在 180 微升 1x PBS 中连续稀释 1 至 10 次。
进行 4 到 5 次稀释。使用无菌技术，将 100 μL 的每种连续稀释液转移到单独的 TCCFA 板中。每次取一个新的无菌 L 形铺展器，将稀释接种物均匀分布在每个板上。
将板在 37 摄氏度的厌氧条件下孵育 24 小时。最后，计数每个稀释板上的艰难梭菌菌落并计算菌落形成单位以获得给予小鼠的感染剂量。为了从小鼠身上收集粪便样本进行评估，首先通过颈部和背部松弛的皮肤轻轻但坚定地束缚受试者小鼠，确保动物不会感到痛苦。
用小指轻轻抬起动物的尾巴，露出肛门。将已知重量的无菌微量离心管直接放在动物肛门下方，确保管子不会直接接触小鼠。当动物排便时，将粪便颗粒收集在试管中。
将试管储存在室温下，直到收集到所有必要的样品。在分析秤上称量含有粪便的试管，并将质量记录到小数点后四位。通过减去管子的重量来计算粪便颗粒的重量。
接下来，计算内容物的 1 到 10 稀释度并重悬到 1x PBS 中。使用移液器的尖端轻轻地将粪便破坏成溶液。将样品在室温下孵育 30 分钟，让内容物沉淀。
在厌氧模式下保持溶液，在 1x PBS 中对每个样品进行连续稀释。将 100 μL 的每种连续稀释液转移到 TCCFA 板上。使用无菌 L 形撒布器，将培养基均匀地涂抹在板上。
将板在 37 摄氏度的厌氧条件下孵育 24 小时。最后，列举艰难梭菌菌落并计算每克粪便内容物的菌落形成单位。该图显示了艰难梭菌 R20291 攻击后几天的小鼠体重。
在第 0 天，基准权重设置为 100。之后每天测量小鼠平均体重，持续 14 天。在攻击后第 2 至 7 天观察到攻击小鼠的体重显着下降。
在此之后，小鼠似乎恢复并恢复了体重。在这里，显示了攻击后几天粪便中的艰难梭菌负荷。在攻击后 24 小时，所有小鼠以每克粪便 10 至第 7 个 CFU 定植。
从第 7 天开始，该负荷有所减少，但艰难梭菌仍然存在。在感染期间对小鼠的组织病理学检查显示盲肠最显着的病理变化。盲肠总组织学评分在攻击后第 0 天与第 2 天和第 4 天之间差异显著。
通常，该小鼠模型的新个体可能难以计算和制备用于攻击小鼠的孢子接种物以及粪便艰难梭菌载量的计算。在尝试此方案时，重要的是要记住，对小鼠施用艰难梭菌孢子的剂量或菌株的修改可能会改变该模型的结果。
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概述
该协议概述了使用临床相关菌株R20291的头孢哌酮小鼠难辨梭菌感染（CDI）模型。它强调了CDI全过程的临床疾病监测、细菌计数、毒素细胞毒性和组织病理学变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 传染病学
- 动物模型
背景
- 难辨梭菌是抗生素相关腹泻的重要原因。
- 头孢哌酮小鼠模型模拟人类CDI。
- 理解CDI的发病机制对开发新的治疗方法至关重要。
- 该模型允许进行类似于人类病例的长期临床观察。
研究目的
- 提供实施头孢哌酮小鼠模型的详细协议。
- 促进与CDI相关实验的准确执行。
- 增强对CDI发病机制和治疗方法的理解。
使用的方法
- 制备难辨梭菌孢子接种物。
- 给予头孢哌酮以诱导易感性。
- 监测小鼠临床疾病进展。
- 评估细菌负荷和毒素活性。
主要结果
- 在抗生素治疗后成功地使小鼠定植难辨梭菌。
- 详细观察临床症状和疾病进展。
- 细菌计数和毒素效应的定量分析。
- 观察到与CDI一致的组织病理学变化。
结论
- 头孢哌酮小鼠模型对研究CDI有效。
- 该模型提供了对难辨梭菌发病机制的洞察。
- 它作为测试新型治疗策略的平台。
常见问题
Executive Industry Relevance
The cefoperazone-treated mouse model using C. difficile strain R20291 enables translationally relevant evaluation of novel therapeutics targeting chronic and recurrent Clostridium difficile infection. By recapitulating the prolonged clinical course and non-uniform lethality observed in human CDI, this model supports predictive confidence in preclinical efficacy and mechanistic de-risking for anti-infective portfolios. Its quantitative outputs and disease-relevant endpoints position it as a critical inflection point for therapeutic candidate triage and advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a clinically relevant infection model.
- Supports biological de-risking by modeling chronic CDI progression and host-pathogen interactions.
- Facilitates functional target validation through quantitative bacterial load and toxin activity measurements.
- Provides mechanistic insight into colonization resistance and disease amelioration.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized protocols for bacterial enumeration and toxin cytotoxicity assays.
- Ensures reproducibility of infection severity and clinical monitoring across cohorts.
- Generates quantitative outputs for comparative evaluation of therapeutic candidates.
- Prepares validated animal systems for downstream efficacy and biomarker studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with human disease features, supporting translational biomarker development.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-CDI agents.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on clinically relevant endpoints.
- Provides histopathological and clinical data for mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery and preclinical validation by providing a robust platform for hypothesis testing, efficacy screening, and translational assessment of anti-C. difficile interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of colonization, toxin production, and host response.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of bacterial load and clinical disease metrics.
- Analytics: Provides colony-forming unit enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological scoring for comparative analysis.
- Translational Research: Models chronic infection and recovery, aligning with human CDI for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, genetically tractable platform adaptable to diverse therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective development.
- Operational Value: Standardizes infection protocols and quantitative outputs for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by modeling clinically relevant disease courses.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates targeting CDI.
Implementation Considerations
- Requires expertise in anaerobic microbiology and animal handling.
- Demands access to specialized instrumentation for bacterial enumeration and histopathology.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of dosing and clinical monitoring protocols.
- Adaptable to different C. difficile strains and dosing regimens with outcome-dependent considerations.
- Model outcomes are sensitive to inoculum preparation and strain selection, impacting reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Inoculation of Mice with Clostridium difficile
3:22
Enumeration of C. difficile from Mouse Fecal Content
5:03
Results: The Murine Model of C. difficile Infection Demonstrates Significant Weight Loss, Bacterial Colonization and Histopathological Changes in Infected Mice
6:10
Conclusion
