在线体积排阻和离子交换色谱法SAXS光束线

在小角 X 射线散射光束线上实施在线尺寸排阻和离子交换色谱的总体目标是通过确保样品制备和数据采集之间的延迟最小，获得更高质量的低分辨率模型数据。这些方法可以帮助回答结构生物学领域的关键问题。与半径作一样，最大特定距离、粒子形状、折叠变性或无序程度。

SAXS 需要摩尔分散样品。该技术的主要优点是纯化和测量之间的时间短，有助于避免样品变性或定性。在进入光束线设施之前，使用先前发表的方法制备浓缩样品并进行 SEC 测试运行。

在光束线设施中，将 1 毫升凝胶过滤缓冲液放入 1.5 毫升反应管中。然后，根据 SAXS 设置的流通毛细管，将凝胶过滤缓冲液瓶连接到 HPLC 系统。设置流速、最大柱压和采集时间。

注意没有色谱柱的背压。清除管路，然后连接并平衡尺寸排阻色谱柱。将 1 mL 缓冲液样品装入进样器中。

退出并固定或锁定实验箱，然后在样品进样器模式下登录光束线控制软件。将样品进样器中的缓冲样品直接送入 SAXS 流通毛细管。执行简短的 SAXS 测试运行，并检查声音 X 射线散射强度是否没有显示出辐射损伤的迹象。

将光束线控制系统切换到 HPLC 模式，并通过完整的 HPLC SAXS 系统对缓冲液进行 SAXS 测试运行。如果数据与第一次测量不匹配，请重新平衡并执行另一次测试运行。接下来，在实验室中，将蛋白质样品以 13， 000 倍 G 离心 10 分钟以去除聚集体。

将上清液转移至兼容 HPLC 的玻璃样品瓶中。将样品瓶装入自动进样器，注意样品位置。联锁小屋并为光束线控制系统中的实验数据创建一个文件夹。

然后，在 HPLC 软件中，单击 Quick Batch。设置文件路径并激活 UV Vis 数据的自动 ASCII 转换。在自动进样器中输入进样体积和样品位置。

单击 start' 将运行添加到队列中。输入文件名，但不要单击 save's。在光束线控制软件中，设置数据帧的数量，使 SAXS 数据收集时间略长于 HPLC 采集时间。

打开光束线快门，然后启动 SAXS 数据收集。切换到 HPLC 软件，然后单击保存以注入样品。记下紫外可见分光光度计数据采集开始时的帧号，并监测随时间变化的强度总和。

在样品制备过程中，使用从 25 毫摩尔到 1 摩尔的线性氯化钠梯度进行 IEC 测试运行。对于每个目标峰，确定流动相中高盐缓冲液 B 的相应量。要开始 IEC SAXS 实验，请留出 1 毫升缓冲液 A 和 B 样品，然后将缓冲液连接到 HPLC 系统。

设置 HPLC 参数，然后吹扫系统并用低盐缓冲液冲洗管路 A.用缓冲液连接并平衡离子交换柱 A.将 1 mL 缓冲液 A 和 B 样品加载到自动进样器中。联锁外壳，并在样品自动进样器模式下对每个缓冲液样品进行短暂的 SAXS 测试运行，以检查缓冲液对辐射损伤的敏感性。然后，切换到 HPLC 模式并对缓冲液 A 进行另一次 SAXS 测试运行。将散射模式与从自动进样器测试运行中获得的散射模式进行比较。

接下来，为 Experiment 数据创建一个文件夹。然后，设计逐步 HPLC 梯度，从 0% 高盐缓冲液 B 开始，以两个柱体积为间隔增加 5% 以达到 100% 缓冲液 B。打开光束线快门，启动 SAXS 数据收集，然后开始 HPLC 运行。

请注意 UV Vis 数据收集开始时经过的帧数。数据收集后，检查总强度是否保持恒定至少 100 帧，并与从缓冲液 A 和 B 样品中获得的值匹配，然后，进行另一种逐步梯度 HPLC 方法，从零百分比缓冲液 B 开始，为离线 IEC 梯度测试运行中确定的每个百分比 B 值创建一个步骤。添加比这些值低 1 个百分点的渐变步长，以及每个值高 1.5 个百分点的渐变步长。

将每个步骤间隔设置为 2.5 个柱体积，将梯度的最后一步设置为 100% B.根据需要稀释上清液以获得缓冲液的组成 A.停止 HPLC 泵，断开色谱柱管路与检测器的连接，并将管路的末端放入容器中以收集色谱柱流。然后，将缓冲液 A 线转移到稀释的样品中，确保试管中没有气泡。启动泵，将样品吸入色谱柱中。

样品容器几乎用完后，停止泵并将缓冲液 A 瓶放回生产线上。启动泵，将缓冲液 A 穿过色谱柱运行两个柱体积，然后停止泵并将色谱柱重新连接到检测器。使用新的分步方法，设置一次 HPLC 运行，无需自动进样。

打开光束线光阑并获取 SAXS 和 UV Vis 数据。监视一段时间内的总强度。然后，使用后处理软件将 HPLC 数据转换为 ASCII 格式。

使用在线数据管理器，确定与样品洗脱峰对应的 SAXS 帧。验证 giyration 半径在整个峰中是否稳定。将峰帧导入 SAXS 数据处理程序，并创建平均未校正的散射曲线。

对于 SCC SAXS，请确认平均缓冲区的高 Q 区域，而不仅仅是未校正的散射曲线。加载并缩放从峰值中自动减去的帧，并检查是否存在系统性差异。平均所有曲线以获得最终的 SAXS 曲线。

对于 IEC SAXS，每个渐变步骤平均 50 帧。将这些平均值与未校正的曲线进行比较，然后选择具有最佳高 Q 匹配的梯度步骤。从未校正的曲线中减去选定的平均值以创建最终的 SAXS 曲线。

最后，确定对距离分布并执行 ab initio 建模以确定最具代表性的蛋白质模型。从 SEC 和 IEC SAXS 获得的 D5 蛋白的结构数据参数非常相似。分子量估计值均与预测质量一致。

执行 Ab 头建模时，没有强加对称性，并且具有 C6 对称性。两种模型都与实验数据兼容，表明蛋白质结构具有 C6 对称性。分子建模产生一个六边形金字塔状结构，中央通道部分阻塞。

平均的 SEC 和 IEC 模型非常相似。在检查各个模型时，发现通道阻塞可能是平均过程的伪影。SAXS 正变得越来越合理，越来越标准，但对于许多纯化和其他离子交换色谱步骤来说，需要去除聚集体或污染物。

在该协议中，我们介绍了两种技术，在线尺寸排阻色谱法和 bio SAXS 光束线上的在线离子交换色谱法。这两种技术都需要注意的是，精确的蛋白质浓度是未知的，因此我们无法确定分子量散射。然而，对于球状蛋白质，我们仍然可以估计质量体积。

可以采用线性梯度来代替我们在离子交换色谱中使用的逐步梯度，尽管这需要优化缓冲条件以实现峰的最佳分离。这些技术使我们能够收集高质量的 SAXS 数据，即使在复杂的系统上也是如此。