Name: 人体软组织的生物力学特性采用压痕和拉伸试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学习压痕和拉伸试验技术，用于表征人体软组织的弹性与粘弹性特性。该方法可测定皮肤和软骨的杨氏模量及应力松弛率，为组织工程植入物设计提供关键力学数据。

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我们感谢医学研究理事会和行动医学研究会的资助，该资助为MG提供了临床研究员职位（GN 2339），以开展本项工作。

本方案遵循本机构人体研究伦理委员会关于人体组织使用、储存和处置的伦理指南。人体组织样本可取自已签署同意书用于研究目的并获得相关伦理批准的遗体。样本也可来自已签署同意书并获得相关伦理批准的接受外科手术患者的废弃组织。
1. 皮肤的制备
<ol>
	<li>使用手术刀片和镊子手动剥离脂肪组织和深层真皮的薄层，以制备样本。此步骤对于确保样本间的一致性至关重要14。</li>
	<li>将所得的断层皮片切割成标准化的样本尺寸（例如，1 cm × 5 cm 的样本）。根据测试仪器的尺寸确定样本大小。如果同时测试组织工程构建物，则样本尺寸应适合所研究的材料14。将使用过的手术刀片丢弃至专用的锐器盒中。</li>
	<li>为完成力学计算，在力学测试前后使用电子卡尺测量待测皮肤的厚度。</li>
</ol>
2. 拉伸测试
注意：所有材料试验机在测试前应根据制造商的指南进行校准。
<ol>
	<li>在室温（22 °C）下，使用材料试验机对皮肤样本进行单轴拉伸测试（图2A）14。</li>
	<li>所有皮肤样本应保持相同的方向进行取向（例如，垂直或平行于朗格线（绘制在人体图上的拓扑线，表示真皮中胶原纤维的自然取向））14。</li>
	<li>将样本固定在两个夹具之间（商用夹具），其中一个夹具连接至98.07 N的载荷传感器，另一个固定在不可移动的底板上14。夹具间用于单轴拉伸测试的有效区域应为1 cm × 4 cm（图2）。 
	注：使用商用夹具可避免夹持不均及测试前样本受损。样本应固定至&#34;手指拧紧&#34;的紧度。</li>
	<li>将样本装入装置后，用凡士林覆盖其两侧表面，以防止样本脱水。</li>
	<li>在软件中将拉伸加载和应力松弛测试程序设置为一系列操作步骤，如下所示：零载荷 | 零位移 | 接触检测（拉伸加载）| 等待（松弛）。</li>
	<li>启动软件程序开始测试。以1 mm/s的速度对样本施加29.42 N的拉伸载荷。应采用不会导致皮肤破裂的加载速率和载荷（例如，1 mm/s下29.42 N）。</li>
	<li>达到29.42 N载荷后，让组织松弛1.5小时，此时松弛行为的变化已趋于稳定，由计算机软件控制14。 
	注：在松弛阶段保持位移恒定，而非载荷恒定。</li>
	<li>根据分析部分的指导原则计算弹性与黏弹性参数。所测得的力学性能将代表薄层皮肤组分（表皮和真皮）的平均特性14。 
	注：未设定去皮载荷，因为从原始数据中可明确判断变形发生的起始点，因此仅包含这些数据点。</li>
</ol>
3. 软骨的制备
<ol>
	<li>使用手术刀片和镊子去除软骨标本上的皮肤和筋膜15,16。</li>
	<li>使用手术刀片和镊子将软骨标本切成标准化的样本尺寸（例如，1.5 cm 的方块）。对所有样本，使用半圆形压头（图 2B），其直径和厚度至少为软骨样本尺寸的 8 倍。该比例可确保压头不受标本制备过程中边缘效应的影响15。将使用过的手术刀片丢弃至专用锐器盒中。</li>
	<li>为完成力学计算，在力学测试前后使用电子卡尺测量待加载软骨的厚度15,16。</li>
</ol>
4. 压缩压痕测试
<ol>
	<li>在室温下，使用材料试验机对软骨样本进行压缩，测试环境需保持湿润。在压缩测试前及测试过程中，用磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖软骨样本，以确保样本处于水合状态。 
	注意：PBS 并不完全等同于生理环境，但它可使材料与组织在相同条件下进行公平比较15,16。</li>
	<li>将软骨样本调整至其表面与压头垂直。这可确保压缩为单轴方向，并限制任何剪切载荷15。</li>
	<li>在软件中将压缩加载和应力松弛测试程序设置为一系列操作步骤，如下所示：零载荷 | 零位置 | 接触检测（压缩加载）| 等待（松弛）。</li>
	<li>通过软件程序启动测试，以 1 mm/s 的速度对样本施加压缩载荷至 2.94 N15,16。 
	注意：该载荷已被确定为非破坏性载荷，足以灵敏地识别软骨的弹性与黏弹性特性15。</li>
	<li>当达到 2.94 N 的载荷上限后，利用计算机软件使软骨松弛 15 分钟，该时间点的松弛行为变化已趋于最小15,16。 
	注意：图 2C-D 展示了人体组织样本进行压缩与拉伸测试的典型装置。相同的测试方案可应用于合成生物材料，以使其生物力学特性与待分析的天然组织相匹配。例如，图 2E-F 展示了人体组织的压缩与拉伸测试结果与合成材料的生物力学特性高度一致。</li>
</ol>
5. 压痕与拉伸测试中杨氏弹性模量的计算
<ol>
	<li>从材料测试设备中收集原始数据，包括时间（s）、位移（mm）和载荷（N）14-16。</li>
	<li>使用图3所示公式计算应力（MPa）和应变（%）。 
	注意：如果在压缩测试中使用了半球形压头，则将力除以横截面积可得到名义（平均）应力，而非峰值应力。</li>
	<li>使用线性散点图将应力（MPa，y轴）对 应变（%，x轴）作图，并确定线性拟合曲线。线性拟合曲线形式为 y = mx + b，并具有相应的 R 值。 
	注意：需包含所有数据点，以确保最小 R 值 &#62;0.98。其中 m 为斜率，代表应力与应变之比，反映材料的抗压或抗拉能力（MPa），即杨氏模量（i.e., Young's Modulus）。若 R 值未达到 &#62;0.98，则表征线性粘弹性行为的假设不成立。</li>
	<li>为识别在变形作用下流体流动已达到平衡状态的粘弹性特性，需计算力学测试最后 200 秒内应力随时间的变化率以及实验结束时的最终应力水平。 
	注意：随着时间延长，当流体流动趋于平衡时，应力水平将逐渐降低（松弛）17,18。快速的应力松弛响应表明样品内部难以维持高应力状态17,18。</li>
</ol>
6. 弛豫特性
<ol>
	<li>在线性散点图中，以时间（秒，x轴）为横坐标，绘制应力（兆帕，y轴）的变化曲线。</li>
	<li>通过线性拟合计算应力松弛速率。线性拟合曲线方程为 y = mx + b，取最后200秒的数据进行计算，其中 m 值即为应力松弛速率。</li>
	<li>应包含所有数据点，使拟合的最小决定系数 R 值 &#62;0.98。皮肤在1.5小时、软骨在15分钟时的最终应力（MPa）即为最终的绝对松弛值。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

已有多种拉伸和压痕实验方案被发表，用于表征人体软组织。我们提供了一种新的方法，旨在更具诊断性且对组织无损伤。本方案中进行力学测试的样本受载荷限制而非位移限制，因为传感器对载荷的敏感性高于对位移的敏感性。因此，该实验在不同组织和合成材料之间的重复性更高。利用该技术，我们展示了用于评估皮肤组织的拉伸实验方案以及用于分析软骨组织的压痕实验方案。这两种方案均易于实施，可用于人体软组织及组织工程构建物的表征。
获得适合分析的应力-松弛曲线的方法学中，一个关键步骤是确保样品在测试过程中不发生滑动。需要进行充分的固定，但同时必须避免对样品造成额外应力，并确保压头与表面垂直，以防止产生剪切载荷。样品之间组织的组成、大小和形状必须尽可能相似。对于软骨样品，必须采用可重复的解剖方案和统一的样品尺寸。对于皮肤样品，必须彻底去除所有皮下组织，以获得可重复的样品。此外，必须确保所有样品的实验条件完全一致，包括水合状态、室温以及（如适用）解冻过程。
所介绍的方案存在一些局限性。研究表明，皮肤和软骨的变形特性依赖于样本的取向13皮肤早在19世纪就被认识到具有各向异性th 19世纪，Langer 于1861年证明皮肤存在天然的张力线，即所谓的 Langer 线4因此，在表征皮肤样本时，将所有样本沿朗格线平行或垂直方向进行取向至关重要，以避免引入方法学偏差4软骨还表现出各向异性特性，并含有赫尔特克兰茨线（Hultkrantz lines），这些线相当于朗格线（Langer lines），因此软骨在不同加载方向下的变形方式也不同12,19因此，增加样本量以允许对软骨在不同方向上的力学性能进行测试显得尤为重要。由于组织的生物力学特性还随年龄和性别而变化，研究应采用具有代表性的患者队列，以确保结果在临床环境中的有效性。此外，某些力学测试方案建议进行预加载处理，即对组织施加循环载荷，以确保其在后续力学测试中达到稳定状态。20然而，预处理的确切机制尚不明确，且在不同研究中，产生一致且可重复反应所需的循环次数也各不相同20研究人员应在评估进行特定生物力学测试的原因后，考虑是否包含预处理步骤。20.
皮肤是一种复杂的多层结构，可分为三层主要结构：表皮、真皮和皮下组织4. 皮肤组织的力学性能最近已通过以下方法进行评估 体内 评估4. 然而，拉伸试验方案可用于理解离体皮肤的皮肤生物力学特性4此类测试可为建立应力-应变关系模型提供信息，因为可以明确定义边界条件。4通常情况下， 体外 测试方案采用高应变来表征材料直至失效的性能，而 体内 系统使用低应变范围4在比较离体皮肤在张力下的生物力学数值时，不同研究之间的差异很大，范围从2.9-150 MPa4由于自然的生物变异，受试者之间存在较大差异是预期之中的，但不同实验方案的设计差异也可能加剧这些天然的生物学差异。例如，不同方案中的加载速率差异会引起结果变化，因为较高的加载速率会减少液体流出的时间，从而导致测得的刚度更高。此外，皮肤组织的制备、切除和操作流程也会对力学性能产生影响。4本方案针对皮肤测试提供了一种可供研究人员表征皮肤组织的替代方法。该方法具有若干优势，包括可在一次力学测试中识别皮肤组织的弹性与黏弹性特性，从而在较短时间内更全面地理解皮肤的力学行为。此外，相同的测试方法也可应用于组织工程化皮肤替代物，以制造出具有与天然皮肤相似生物力学特性的结构。
与受限压缩测试相比，压痕测试为理解软骨的生物力学提供了一种更具吸引力的选择21。压痕测试能够保持软骨的生理结构，因此所得数值可模拟临床环境中的实际情况。利用压痕法，还可以在软骨仍附着于下方骨组织时对其进行测试。压痕法还允许对软骨进行类似体内（in vivo）的生理状态测试。当两个软骨表面相互接近时，由于压缩变形发生后接触区域下方的水被侧向挤出，接触区周围的边缘会出现&#34;隆起&#34;现象17,21。为实现类似的隆起效应，必须使用半径小于软骨样品的压头进行软骨压痕测试。同时，压头尺寸应至少为样品尺寸的8倍，以确保软骨的反应如同其属于无限大样品的情况22。使用远小于样品直径半径的压头，可消除样品制备过程中可能产生的边缘效应。此外，压痕法避免了因取样导致软骨缺陷而引起的潜在实验误差。与受限压缩测试不同，压痕法无需复杂的深层样品制备，因此可对小而薄的软骨片段进行测试17,21。更重要的是，在完成验证和确认研究后，这种非破坏性压痕方法有望在临床环境中作为诊断工具加以应用。
在进行压痕实验时，用户必须确保满足一些关键假设，以获得准确的结果。其中一项关键的边界条件是在压痕加载过程中，压头与软骨表面之间必须保持持续接触。即， 表面不会在压头作用下发生变形23,24压痕加载还包含一个假设的边界条件，即软骨表面与压头之间的接触是非破坏性的（即， 压头与表面接触但不穿透表面；软骨表面在压头作用下不应发生破坏25-26研究表明，该边界条件可通过使用印度墨水进行验证，当将其涂抹于软骨表面时，印度墨水会染色受损区域。25,26另一个边界条件假设压头垂直于样品表面压缩软骨。压缩方向的垂直性是一个重要的边界条件，因为如果以一定角度进行压缩，尤其是在使用循环加载时，可能会导致滑移，从而引入剪切分量并改变力学载荷。该条件可通过仔细设置测试设备来确保。
在针对目标软组织优化总结的实验方案后，研究人员可进一步开展对该组织的动态测试。对试样施加适当的周期性载荷应能模拟正常的生理限度和行为，例如模拟行走或其他重复性运动27。总之，本报告展示了用于评估人体组织的简单力学测试方案。实施这些方案将提供有关组织生物力学特性的关键信息，从而使得组织工程构建物能够更好地模拟天然组织。

越来越多的患者正在等待各种器官移植，以治疗功能衰竭或受损的器官。然而，由于适合的供体器官短缺，再生医学正致力于为终末期器官衰竭患者提供替代性解决方案。再生医学旨在通过设计能够作为组织替代物的材料来满足这一临床需求，包括软组织，如软骨和皮肤。为了成功开发出可修复受损组织的材料，该替代材料应模拟其拟替代的天然组织的特性1-2。一旦通过外科手术植入，该材料需要为组织缺损提供解剖形态，因此材料的力学性能至关重要1。例如，用于替代耳廓软骨的材料应具备适当的力学性能，以防止被覆盖的皮肤压迫2。同样，用于替代鼻部软骨的材料必须具备足够的力学性能，以防止在呼吸过程中发生塌陷3。然而，尽管在制造用于植入的材料时力学性能极为重要，目前仍缺乏针对不同人体组织力学性能表征的系统研究证据。
机械测试方法可用于测定组织的压缩、拉伸、弯曲或剪切性能。皮肤是一种高度各向异性、黏弹性且几乎不可压缩的材料4-9。通常采用单轴拉伸法测试常被切除的皮肤，即将适当形状的皮肤条两端夹紧并拉伸，同时记录载荷与伸长量4-9。
由于所有软组织的主要成分都是间质水，软骨的力学响应与流体在组织内的流动密切相关10-11。传统上，软骨等软组织通过压缩试验进行测试。压缩测试的方法多种多样，其中以受限压缩、非受限压缩和压痕法最为常见（图1）。在受限压缩中，将软骨样本置于一个不透水且充满液体的腔室内，并通过多孔板施加载荷。由于腔室本身不透液，流体在软骨内的流动方向为垂直方向12-13。在非受限压缩中，软骨样本被置于一个不透水的腔室上，并使用不透水的压头加载，迫使流体主要沿径向流动12-13。压痕法是评估软骨生物力学性能最常用的方法12-13。该方法使用一个比被测样本表面更小的压头，将其压入样本表面。与其他压缩测试方法相比，压痕法具有多种优势，包括可在原位（in situ）进行测试，从而使实验条件更接近生理状态（图1）12-13。
为了理解组织的压缩和拉伸性能，通常通过分析应力-应变曲线的线性部分来计算杨氏弹性模量，该参数表示组织对压缩或拉伸的弹性抗性，且不受试样尺寸的影响12。拉伸和压缩测试方法均可根据施加的载荷或形变量及其变化速率的不同而有所差异。目前，存在多种不同的测试方案用于评估组织力学性能，这使得不同研究之间的结果难以解释或比较6-13。此外，当前许多力学测试方法主要集中在通过将试样破坏至失效来表征组织的力学特性 。本研究旨在展示一种压痕与拉伸测试方案，可实现对人体软组织及组织工程构建物进行直接、非破坏性的比较分析。
我们展示了一种将力学测试限定在施加应力范围内，但仍能获得压缩和拉伸条件下杨氏弹性模量的方法。样品在拉伸或压缩条件下被施加至某一特定应力值，一旦达到预设的应力值，即允许样品松弛，同时记录全部数据。该方法可在同一次测试中获取组织的黏弹性与应力松弛特性，并可直接应用于合成材料。我们已采用压痕测试方案 评估人类软组织，包括皮肤和软骨14-16。其中，软骨通过压痕测试进行评估，皮肤则通过拉伸测试进行评价14-16。致力于开发具有类似人体软组织特性的材料的研究人员，可考虑采用这些测试方案。

<table><tbody><tr><td>数字游标卡尺</td><td>Machine Mart</td><td>40218046</td><td>数字游标卡尺用于测量样品厚度。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>UY-12504-94</td><td>StableTemp 数字水浴瓶架，用于解冻冷冻的组织样本。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mach-1 材料试验机</td><td>Biomomentum&amp;nbsp;</td><td>V500c</td><td>力学测试机用于测试组织的力学性能。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手术刀片&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>233-5335</td><td>手术刀片用于切割和解剖组织。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>470007-554</td><td>镊子用于解剖组织。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>20012019</td><td>PBS 用于水合组织样本&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

利用压痕与拉伸试验对人体软组织进行生物力学表征

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

再生医学旨在设计材料以替代或修复受损或病变的器官。这些材料的力学性能应模拟其所要替代的人体组织；为了提供所需的解剖形态，材料必须能够承受植入缺损部位后所面临的机械力。尽管组织工程支架的力学性能极为重要，但许多通过工程材料进行修复的人体组织尚未得到充分的生物力学表征。已有多种压缩和拉伸测试方法被用于评估材料性能，但由于实验方法差异较大，不同研究之间的结果难以比较。此外，机械测试通常具有破坏性，这也增加了研究的复杂性。虽然理解组织失效机制非常重要，但在更接近生理状态的载荷条件下，了解材料的弹性与黏弹性特性同样至关重要。
本报告旨在提供一种微损伤性的方法，用于评估人体软组织的压缩和拉伸性能。作为该技术的应用示例，文中描述了皮肤的拉伸测试和软骨的压缩测试。这些方案也可直接应用于合成材料，以确保其力学性能与天然组织相似。用于评估人体天然组织力学性能的方案将为开发合适的组织工程替代物提供一个基准。

图 4 和 5 展示了通过压痕测试和拉伸测试获得数据的示例。图 4 展示了人软骨压痕测试后获得的典型数值。图 4A 是压痕测试后获得的典型应变-应力曲线图示例。为获得杨氏模量，需包含所有数值，直至曲线拟合的 R 值最小达到 0.98（图 4B）。斜率 m 值即为以 MPa 表示的杨氏模量指标；例如，在本组数据中，软骨的模量为 1.76 MPa。图 4C 展示了用于评估软骨松弛特性的典型应力-时间曲线图。松弛速率通过最后 200 秒的数据计算得出。同样地，松弛速率采用以 MPa 为单位的直线拟合斜率 m 值表示。例如，在本组数据中，软骨的松弛速率为 8.78 × 10-6 MPa/s（图 4D）。松弛的绝对最终水平为以 MPa 表示的应力最终值。例如，在本组数据中，松弛的绝对最终水平为 0.028 MPa（图 4D）。
图5展示了如何在拉伸测试后评估皮肤组织的黏弹性。该分析方法与压缩测试相同。图5A展示了一个典型的拉伸测试协议获得的应变-应力曲线图。为获得拉伸状态下的杨氏模量，需包含所有数据点，直至线性拟合曲线的R值最小达到0.98（图5B）。其中，斜率m值即表示以MPa为单位的杨氏模量；例如，在本组数据中，皮肤的模量为0.62 MPa。图5C展示了一个典型的应力随时间变化的曲线图，用于评估皮肤的应力松弛特性。松弛速率通过最后200秒的数据计算得出。同样地，松弛速率由线性拟合曲线的m值（单位为MPa）确定。例如，在本组数据中，皮肤的松弛速率为3.1 × 10-5 MPa/s（图5D）。应力松弛的最终绝对水平即为应力曲线终点的MPa值。例如，在本组数据中，该值为0.64 MPa（图5D）。上述分析方法也可用于分析生物材料在压缩和拉伸测试中的力学行为，以将其生物力学性能与天然组织相匹配。
<img alt="压痕与压缩方法示意图；用于材料研究的压痕、受限压缩和非受限压缩。" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1： 不同压缩方法的示意图。 A. 压痕测试。使用无孔压头对软骨的小面积区域施加载荷。 B. 受限压缩。将软骨样本置于一个不透水的、充满液体的腔室中，然后通过多孔板对软骨施加载荷。由于腔室不透水，软骨内的流体流动仅限于垂直方向。 C. 非受限压缩。使用无孔板将载荷施加到置于无孔腔室上的软骨，迫使流体流动主要呈径向分布。
<img alt="对组织样本进行压缩测试的生物力学测试装置，显示加载单元和夹具。" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 机械测试装置的设置。A. 测试装置示意图。B. 用于压缩测试分析的压头示意图。C. 采用压缩压痕测试分析软骨组织。D. 皮肤组织在拉伸测试下的分析。E. 合成生物材料的拉伸测试。F. 合成生物材料的压缩测试。
<img alt="力、应力、应变公式；机械测试分析方程；压缩、拉伸方法。" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3： 用于计算组织或组织工程构建物的压缩和拉伸力学性能的公式。 用于计算力（N）、应力（MPa）和应变（%）的公式。
<img alt="应力-应变和应力-时间曲线图，显示线性拟合方程及相关系数（R=0.98）" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：人软骨压缩分析示例。A. 应力-应变分析。B. 直线拟合方程中的斜率 m 值表示以 MPa 为单位的杨氏弹性模量。C. 应力-时间分析，用于展示应力松弛特性。D. 直线拟合方程中的斜率 m 值表示应力松弛速率。最终的绝对速率是曲线上最后一个数据点。
<img alt="应力-应变和应力-时间曲线，机械测试结果，包含线性拟合方程。" src="/files/ftp_upload/54872/54872fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5: 人体皮肤拉伸分析示例。A. 应力-应变分析。B. 直线拟合方程中的斜率 m 值表示杨氏弹性模量（单位为 MPa）。C. 应力-时间分析，用于展示材料的应力松弛特性。D. 直线拟合方程中的斜率 m 值对应于应力松弛速率。最终的绝对速率是曲线上最后一个数据点。

组织生物力学对于维持细胞形态和功能以及决定表型具有重要意义。本报告展示了用于表征人体软组织弹性与黏弹性特性的非破坏性力学检测方法，这些方法可直接应用于组织工程基质，以实现工程化材料与天然组织特性的高度匹配。

再生医学旨在设计材料以替代或修复受损或病变的器官。这些材料的力学性能应……

该技术的总体目标是利用压痕和拉伸测试来表征人体软组织的力学性能。该方法有助于回答组织工程领域中的关键问题，例如，为替代功能衰退或受损的人体器官，我所设计的植入物应具备多大的刚度。这些技术的主要优势在于其具有非破坏性，且易于实施。我们在设计合成耳部和鼻部植入物时首次提出了该方法的构想，并思考材料应具备多大的刚度。通常，初次使用该方法的研究人员会因样品制备不当以及测试设置困难而遇到挑战。首先，从接受外科手术并签署知情同意书的患者，或为科研目的已签署同意书的遗体上获取皮肤样本或其他组织样本。将皮肤样本放入培养皿中，并用 PBS 覆盖以保持组织湿润。使用手术刀片和镊子手动剥离样本中的脂肪组织及深层真皮的薄层。将所得的中厚皮片切成 1 厘米 × 5 厘米的条状。然后，将使用过的手术刀片丢弃至锐器盒中。最后，使用卡尺测量皮肤的厚度。机械测试后还需再次测量皮肤厚度。在室温下使用校准的材料试验机对皮肤样本进行单轴拉伸测试。首先，根据朗格线（Langer lines）的方向对皮肤样本进行定位，使胶原纤维的自然取向均保持一致。接着，将样本装入夹具中，使施加的力的方向与朗格线平行或垂直。用手指拧紧夹具以固定样品，使样品约0.5厘米的部分插入每个夹具中。确保试验机的一个夹具连接到合适的负荷传感器，另一个连接到固定的底板上。固定后，在样品两侧覆盖凡士林，以防止试样干燥。现在，将拉伸加载和应力松弛测试程序输入软件，使样品以每秒1毫米的速度加载，直至达到29.42牛顿的张力。当组织达到29.42牛顿的张力后，设置程序保持位移恒定1.5小时，以使组织发生应力松弛，同时持续监测张力的变化。测试结束后，再次使用游标卡尺测量样品的厚度。从知情同意的个体获取软骨样本后，将其放入培养皿中，并用 PBS 覆盖。使用手术刀片和镊子去除样本上的皮肤和筋膜。然后将软骨样本切成 1.5 厘米见方的小块。切割后，使用卡尺测量待加载软骨的厚度。最终样品尺寸应至少为压头直径的八倍。将软骨样品置于大型不透水基座上，并使其位于压头正下方中心位置，调整方向以确保表面与压头垂直。这可以实现单轴压缩，并限制任何剪切。然后，用磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖软骨，并在整个测试过程中保持样品湿润。将压缩加载和应力松弛测试程序输入软件，使样品以每秒一毫米的速度加载，直至达到2.94牛顿的压缩力。当达到2.94牛顿的载荷后，保持压头位置不变，使软骨松弛15分钟。完成后卸载样品，并再次测量样品的厚度。为评估皮肤组织在拉伸测试后的黏弹性，应力-应变曲线中的所有数值均用于杨氏模量的计算，直至线性拟合的R值最小达到0.98。应力随时间变化的曲线用于评估皮肤的应力松弛特性。松弛速率由采集数据的最后200秒计算得出，本样品的松弛速率为3.1 × 10⁵ 兆帕每秒。此处所示的图表为应力-应变数据示例，展示了对人体软骨进行压痕测试的结果。与皮肤样本的杨氏模量计算类似，只要曲线末端的数据满足最小R值为0.98的条件，即可用于软骨的计算。软骨的应力松弛速率为8.78×10⁻⁶兆帕/秒，最终绝对松弛水平为0.028兆帕。一旦掌握该技术，若操作得当，可在7小时内完成。 在进行该操作时，重要的是要确保解剖方案和样本尺寸具有可重复性。在完成本操作后，还可进一步采用其他方法（如循环加载），以回答更多问题，例如组织在生理性的动态载荷下的力学行为如何。该技术为生物力学领域的研究人员探索利用这种非破坏性技术进行体内无创力学测试奠定了基础。请务必注意，处理人体组织可能具有极高的危险性，因此在进行此操作时，应始终采取防护措施，例如佩戴手套。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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