冷冻蚀刻：用于透射电子显微镜下悬浮细胞超微结构与免疫定位研究的工具

以下实验的目的是提出一种用于悬浮细胞超微结构和免疫定位研究的工具，以实现透射电子显微镜下的可视化观察。该技术操作简便、成本低廉，且能极好地保存细胞结构。这是一份悬浮细胞培养物。

首先，通过不同步骤的离心将细胞收集到微量离心管中，形成细胞沉淀。第二步，采用浸入式快速冷冻法对样品进行迅速冷冻，以固定细胞并限制冰晶的形成。接下来，进行冷冻置换，用含有四氧化锇作为固定剂的溶剂替代细胞中的水分，从而稳定细胞结构。

结果表明，浸入式冷冻和冷冻置换能完美保存细胞的超微结构。化学固定曾是透射电子显微镜中用于固定组织或细胞的主要方法，但该方法通常会导致产生人工假象并引起细胞内容物的抽提。化学固定的一种替代方法是低温固定（cryofixation）。

该方法是获得高质量形态学薄树脂切片的最佳选择。浸入式冷冻是一种冷冻固定技术，可瞬间固定细胞内的分子，从而避免常规化学固定所造成的损伤。在进行浸入式冷冻前，必须预先准备好带有聚乙烯醇薄膜的载网，用于冷冻样品的支撑。

使用无绒布将玻璃载玻片擦拭至光亮并清洁干净。将玻璃载玻片浸入含0.3%福尔马林的氯仿溶液中数秒，随后将其直立放置于烧杯中自然晾干。由于氯仿的存在，操作必须在通风橱内进行，并佩戴个人防护装备。

将蒸馏水注入结晶皿后，用玻璃棒在水面上方轻轻掠过，以去除灰尘。待薄膜干燥后，用锋利的剃刀刀片在边缘划痕，以便使薄膜脱离。通过向载玻片表面用力呼气，使水蒸气凝结在薄膜上，从而对载玻片进行冰冻处理。

将载玻片底部以约30度角接触水面，立即将薄膜漂浮于水面上。缓慢将载玻片放入水浴中，必要时轻轻分离薄膜。Formvar薄膜会缓慢沉降并铺展在水面上。

使用镊子将薄膜固定在结晶皿边缘。将400目铜网轻轻正面朝下放置在薄膜上厚度合适且无皱褶的区域。当薄膜连同铜网漂浮在水面上时，用约瑟夫纸覆盖并将其整体捞起。

拿起Joseph纸的边缘，载网的薄膜应随之被提起。切勿让手指接触水面，否则可能导致薄膜留在水中。载网使用前需干燥数小时。

进行超微结构研究时，将四氧化锇安瓿放入玻璃烧瓶中。充分振荡烧瓶以震碎安瓿。加入适量100%丙酮，使终浓度为4%。搅拌含有冷冻置换介质的烧瓶，并用塑料移液管将1.5毫升等分试样分装至冻存管中。

使用前将所有瓶盖拧紧，并于零下84度冰箱中保存。进行蛋白质免疫标记研究时，配制0.1%的醋酸铀于丙酮中。待溶液变澄清后，用0.2微米滤器过滤，并将1.5毫升分装至冻存管中。

使用前请在零下84摄氏度的冰箱中保存。为确保不同细胞类型的细胞沉淀具有一致的适当性状，需在最少体积的完全液体培养基中培养原始酵母细胞，以获得1×10⁹个细胞；在DTY培养基中培养大肠杆菌（Escherichia coli），以获得5×10¹⁰个细菌细胞。

在AM培养基中培养利什曼原虫鞭毛体，在SDM79培养基中培养布氏锥虫，以获得5 × 10⁸个寄生虫细胞。将含有悬浮细胞的培养液转移至50毫升聚丙烯管中，在1,500 ×g条件下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升相应的细胞培养基中。

在微量离心管中以3,900 ×g离心一分钟。完全去除上清液。对于冷冻固定方法，必须使用带有连接至丙烷气瓶的管路的丙烷瓶。

丙烷具有潜在爆炸性，因此必须在通风良好的房间或通风橱中进行液化操作，严禁明火。使用液氮时，必须始终佩戴包括低温手套在内的个人防护装备。

在聚苯乙烯托盘中加入少量液氮。将黄铜杯放入液氮中。可见气泡产生。

等待气泡消退。然后将黄铜杯冷冻。将连接至丙烷气瓶的管子与黄铜杯壁接触。

缓慢打开丙烷气瓶阀门。由于丙烷尚未开始液化，会形成大量烟雾。当丙烷开始液化时，烟雾随之消失。

通过关闭丙烷气瓶阀门并迅速移除与丙烷气瓶相连的管路，停止液化过程。将液氮注入聚苯乙烯托盘中，直至液面距离黄铜杯顶部约五毫米。将用于冷冻后替换样品的小黄铜杯放入液氮中进行冷冻。

每个样品使用一个杯子，注意不要混样。为获得适当的沉淀物稠度，只需严格遵守之前所述的培养条件和离心参数即可。

使用镊子前先将其冷冻。取一个用Formvar切割的400目铜质显微镜载网。将双刃解剖针插入样品沉淀中。

使用工具将一滴沉淀物置于载网上。迅速将载网浸入液态丙烷中，并搅拌数秒。立即将冷冻的载网转移至小黄铜杯中。

每个样品至少制备三张载网。取载网前切记先将镊子预冷。使用镊子前应先将其冷冻。

迅速取下杯子，用镊子将冷冻载网转移至冷冻管中。盖紧冷冻管盖。对每个样品的每张载网重复上述操作。

盖紧管盖，轻轻搅拌冻存管，确保样品完全浸入冷冻置换介质中。将冻存管置于-84 °C冰箱中静置三天。转移冻存管时，使用聚苯乙烯托盘，避免温度突然升高，然后将其放入-30 °C冰箱中。

在零下30摄氏度下静置一小时。将冻存管在零下15摄氏度下放置两小时，然后将样品置于4摄氏度下两小时，再于室温下放置30分钟。使用塑料移液管移除冷冻置换介质，并将其放入已明确标识的适当废液瓶中。

加入约 500 微升 100% 丙酮。打开玻璃小瓶，搅拌冷冻管，并迅速将冷冻置换介质放入玻璃小瓶中。用 100% 丙酮冲洗一个冷冻管。

用100%丙酮冲洗三次，每次10分钟。将冻存管置于聚苯乙烯托盘中，以避免温度骤升，然后放入-30°C冰箱。在-30°C下静置2小时。

将样品放入聚丙烯小瓶后，用新鲜的冷冻置换介质替换原有的冷冻置换介质，并在零下30摄氏度下放置两小时。用100%丙酮冲洗一小时，再用100%乙醇冲洗三次，每次一小时。浸入冷冻/冷冻置换法对悬浮细胞的细胞内结构实现了极好的保存。

在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，细胞结构未出现皱缩，细胞质呈现致密状态。此外，膜结构光滑，表明样品保存良好。所有细胞器，如细胞核、线粒体和液泡，均可被清晰识别。

在利什曼原虫鞭毛、布氏锥虫和大肠杆菌中也观察到极好的保存状态。在细胞核中，构成核膜的双层膜、核孔、纺锤极体以及附着在核膜外层的核糖体均清晰可见。在线粒体中，内膜向内凹陷形成的嵴结构清晰可辨。

关键的细胞器是液泡，因为容易形成大的冰晶。在图像中，液泡完好无损，没有冰晶损伤。浸入式冷冻/冷冻置换法也可用于蛋白质的免疫定位。

该方法能完美保持蛋白质抗原性，且如前所述，细胞器可被清晰识别。已有多种抗体用于酵母中不同蛋白质的检测，例如抗ATP合成酶抗体和抗孔蛋白抗体。该实验方法也可应用于其他实验体系，如在利什曼原虫中对flabarin蛋白进行定位。

观看本视频后，您应能充分掌握如何采用浸入式冷冻/冷冻置换法制备样品，以便在透射电子显微镜下进行观察。该技术操作快速、简便易行、成本低廉，且能极好地保存细胞超微结构。操作时需小心液氮，尤其要注意四氧化锇和醋酸铀酰的使用安全。

应佩戴适当的个人防护装备（包括实验服和手套）在通风橱中操作。