Name: 暴跌冻结:在透射电子显微镜的超微结构和免疫组化研究工具悬架细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 了解用于透射电子显微镜观察悬浮细胞的低温冷冻固定技术。该方法通过快速投入冷冻和冷冻替代技术，有效保存细胞超微结构，适用于超微结构和免疫定位研究。

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我们感谢 M. Bouchecareilh、E. Tétaud、S. Duvezin-Caubet 和 A. Devin 对本文手稿提供的帮助和意见。我们感谢波尔多影像中心电子成像平台提供了图像拍摄支持。本研究工作得到了法国国家科学研究中心的资助。

1. 甲酸盐网格膜的制备
注意：操作氯仿时须在通风橱内进行，并使用个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。使用400目电子显微镜铜网。若使用其他类型的网格（不同网目大小、金网或镍网），冷冻效果会较差。
<ol>
	<li>配制100 mL浓度为0.3%的甲酸膜氯仿溶液。在不搅拌的条件下静置过夜，使其充分溶解。</li>
	<li>将400目（每平方英寸孔数）的透射电镜铜网（直径3.05 mm）放入盛有丙酮的玻璃小瓶（高3 cm，直径2 cm）中。用手做圆周运动轻轻摇动玻璃瓶。用塑料移液管吸除丙酮，静置让溶剂挥发5分钟。将铜网倾倒至滤纸上，使其干燥5分钟。</li>
	<li>用无绒布擦拭一块76 × 26 mm2的载玻片，直至表面光亮顺滑，完成抛光。</li>
	<li>取一个结晶皿（直径15 cm，高7 cm，容量1200 mL），加满蒸馏水。用玻璃棒在水面上来回移动两次，以清除水面灰尘，清洁水面。</li>
	<li>用手指夹住载玻片，将其浸入甲酸膜溶液中数秒钟。取出后垂直放置，在倒扣的烧杯下干燥5分钟。</li>
	<li>待薄膜干燥后，用锋利的剃须刀片在载玻片边缘划痕，以界定需从玻片上剥离的薄膜区域。</li>
	<li>深吸一口气，用力向载玻片呼气，使薄膜表面和下方形成一层水蒸气，令薄膜略显不透明，从而增强其可见性。
	<ol>
		<li>立即将载玻片以约30°角接触结晶皿中的水面，使薄膜漂浮于水面。让薄膜从载玻片上自然释放并漂浮至水面，必要时可用镊子轻轻将其剥离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将铜网正面朝下，轻柔地放置在水面上漂浮的薄膜区域，选择厚度适宜（约10 nm）且无皱褶的区域。</li>
	<li>当铜网漂浮在结晶皿水面上时，用Joseph纸覆盖其上，将薄膜捞起。
	<ol>
		<li>用一只手握住Joseph纸，将其一端接触薄膜的一端。等待Joseph纸完全润湿后，连同附着其上的铜网一起取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将铜网置于加盖的培养皿中，在室温下存放24小时，完成最终干燥并储存备用。</li>
</ol>
2. 冷冻置换介质的制备
注意：四氧化锇（OsO4）和醋酸铀酰为危险化学品。操作时须在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服和手套。请遵守四氧化锇（OsO4）和醋酸铀酰的安全操作警示。使用O形圈冷冻管以防止四氧化锇（OsO4）泄漏。
<ol>
	<li>超微结构研究
	<ol>
		<li>将玻璃安瓿装的四氧化锇（OsO4）放入玻璃烧瓶中。</li>
		<li>通过摇动烧瓶将安瓿打破。</li>
		<li>加入适量100%丙酮，使终浓度为4%。</li>
		<li>搅拌后，将溶液分装至1.8 mL冻存管中，每管1.5 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质免疫标记
	<ol>
		<li>将0.05 g醋酸铀置于玻璃烧瓶中。</li>
		<li>加入50 mL 100%丙酮。</li>
		<li>使用磁力搅拌器搅拌溶液；待溶液变澄清后，用0.2 µm滤膜过滤。</li>
		<li>分装至1.8 mL冻存管中，每管1.5 mL。 
		注意：在进行 plunge freezing（骤冷）前，应预先准备好含有冷冻置换介质的冻存管，并存放于-84 °C冰箱中。将玻璃烧瓶倒置，将使用过的OsO4安瓿丢弃至有害废物容器中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞的制备
注意：此步骤对方法的成功至关重要。对于所有细胞类型，培养细胞以获得指定数量的细胞。在指定的离心管中，以规定的时间和速度进行离心。
<ol>
	<li>为获得不同细胞类型的合适沉淀一致性，按如下方法培养细胞：
	<ol>
		<li>对于 Saccharomyces cerevisiae 和 Schizosaccharomyces pombe，将酵母接种于 5 mL 最小或完全液体培养基中。在 28 °C 下振荡（180 rpm）过夜培养。测定过夜培养物在 600 nm 处的光密度（OD600）。将酵母细胞用 50 mL 新鲜选择性培养基稀释至 OD600 为 0.2。继续在 28 °C 下振荡培养，以获得 1 × 109 个酵母细胞7。</li>
		<li>对于 Leishmania flagellum，将寄生虫接种于含 7.5% FCS（胎牛血清）的 5 mL AM 培养基中。在 24 °C 下振荡（180 rpm）过夜培养。测定过夜培养物的 OD600。将寄生虫细胞用 50 mL 新鲜选择性培养基稀释至 OD600 为 0.2。继续在 24 °C 下振荡培养，以获得 5 × 108 个寄生虫细胞12。</li>
		<li>对于 Trypanosoma brucei，将寄生虫接种于含 10% FCS 和 30 µg/mL 潮霉素的 5 mL SDM-79 培养基中。在 27 °C 下振荡（180 rpm）过夜培养。测定过夜培养物的 OD600。将寄生虫细胞用 50 mL 新鲜选择性培养基稀释至 OD600 为 0.2。继续在 27 °C 下振荡培养，以获得 5 × 108 个寄生虫细胞13。</li>
		<li>对于 Escherichia coli，将细菌接种于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 5 mL DYT 培养基中。在 37 °C 下振荡（180 rpm）过夜培养。测定过夜培养物的 OD600。将细菌细胞用 50 mL 新鲜选择性培养基稀释至 OD600 为 0.2。继续在 37 °C 下振荡培养，以获得 5 × 1010 个细菌细胞14。 
		注意：过夜培养后，培养物中的细胞可能处于对数生长期或稳定期。生长极为缓慢的细胞株可能需要超过一晚的培养时间，或接种更多数量的细胞，具体应通过实验确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于所有细胞类型，将含有细胞的培养液转移至 50 mL 聚丙烯管中，在 1,500 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将所有细胞类型的沉淀重悬于 1 mL 相应的细胞培养基中。</li>
	<li>将所有细胞类型在微量离心管中以 3,900 × g 离心 1 分钟，彻底弃去上清液。</li>
	<li>将细胞置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 丙烷的液化
注意：操作液氮时需谨慎。使用个人防护装备，包括防冻手套和护目镜。丙烷具有潜在爆炸性，因此应在通风良好的房间或通风橱内进行液化操作。严禁明火。
<ol>
	<li>在聚苯乙烯托盘中倒入约 150 mL 液氮。将一个黄铜杯（高 3.6 cm，直径 2 cm，壁厚 1.5 mm）放入液氮中冷冻。注意不要让液氮进入黄铜杯内部。</li>
	<li>等待气泡基本消失，以确保黄铜杯已充分冷冻。</li>
	<li>将连接至丙烷气瓶的软管接触黄铜杯的外壁。</li>
	<li>缓慢打开丙烷气瓶阀门。 
	注意：在此步骤中，丙烷会在黄铜杯内液化。</li>
	<li>关闭丙烷气瓶阀门，并迅速移除气体软管，以停止液化过程。</li>
	<li>向聚苯乙烯托盘中加入液氮，使液面升至距离黄铜杯顶部约 5 mm 处。注意不要让液氮进入黄铜杯内部。</li>
</ol>
5. 样品的 plunge 冷冻
<ol>
	<li>在聚苯乙烯托盘中加入约 200 mL 液氮。将小黄铜杯（高 1.5 cm，直径 2.5 cm，厚 1 mm）放入液氮中冷冻。每个悬浮细胞样品使用一个杯子。注意避免样品混淆，为此，将样品 1 放入杯 1，样品 2 放入杯 2，依此类推。</li>
	<li>将镊子尖端浸入液氮中，使其冷冻。</li>
	<li>将双刃解剖针浸入步骤 3.5 中获得的沉淀物中。</li>
	<li>用镊子夹取一个 400 目铜质显微镜载网，该载网已在第 1 节中用火棉胶（formvar）处理过。</li>
	<li>使用解剖针，将步骤 3.5 中获得的沉淀物液滴加至载网上。尝试不同体积的液滴（例如 2、5 和 10 µL）。</li>
	<li>迅速将由镊子夹持的载网浸入第 4 节中制备的液态丙烷中，并以环形运动搅拌数秒钟。</li>
	<li>迅速用镊子将冷冻的载网转移至第 5.1 节中预冷的小黄铜杯中。 
	注意：每个样品至少制备 3 个载网。每次取铜网前，务必先将镊子冷冻。</li>
</ol>
6. 冷冻置换
注意：四氧化锇可能具有挥发性，因此请使用带有蒸气滤芯的空气净化呼吸器。在浸入冷冻前，将固定剂在液氮中冷冻也是一种解决方案。
<ol>
	<li>进行超微结构研究时，打开装有第2.1节制备的冷冻置换介质的1.8 mL冻存管；进行免疫定位研究时，打开装有第2.2节制备的冷冻置换介质的1.8 mL冻存管。将管盖放置在冻存管上。</li>
	<li>将镊子尖端浸入液氮中，使其冷冻。</li>
	<li>迅速取下管盖，用镊子将冷冻的载网转移至冻存管中。</li>
	<li>重新盖上冻存管的管盖。</li>
	<li>对每个样品的所有载网重复上述操作。</li>
	<li>拧紧所有管盖，并用手做圆周运动轻轻摇动冻存管，确保样品完全浸入冷冻置换介质中。</li>
	<li>将冻存管放入密封盒中，在-84 °C冰箱中放置3天，以完成冷冻置换过程。</li>
</ol>
7. 样品复温
<ol>
	<li>超微结构研究
	<ol>
		<li>将冻存管置于聚苯乙烯托盘中（以避免温度突然升高），转移至 -30 °C 冰箱，于 -30 °C 冰箱中放置 1 小时。</li>
		<li>将冻存管转移至 -15 °C 冰箱中放置 2 小时，随后将样品置于 4 °C 环境中 2 小时，再于室温下放置 30 分钟。</li>
		<li>使用塑料移液管移除冷冻置换介质，加入约 500 µL 的 100% 丙酮。</li>
		<li>用手做圆周运动搅动 1.8 ml 冻存管，迅速将含有载网的丙酮（1.5 mL）倒入玻璃管（高 3 cm，直径 2 cm）中。</li>
		<li>用 1 mL 的 100% 丙酮冲洗同一冻存管，确保所有载网均已转移；用手做圆周运动搅动冻存管，然后将内容物倒入玻璃管中。</li>
		<li>用 3 mL 的 100% 丙酮对每个玻璃管分别冲洗 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>按照参考文献15中所述进行包埋和包埋处理：使用丙酮中浓度递增的环氧树脂（25%、50% 和 75%）对样品进行浸透，并用 100% 环氧树脂在明胶胶囊中包埋样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫标记研究
	<ol>
		<li>将 1.8 mL 冻存管置于聚苯乙烯托盘中（以避免温度突然升高），转移至 -30 °C 冰箱。</li>
		<li>将冻存管在 -30 °C 冰箱中放置 2 小时。</li>
		<li>在 -30 °C 冰箱中，用手做圆周运动搅动冻存管，迅速将冷冻置换介质倒入聚丙烯管（高 5 cm，直径 1.5 cm）中。</li>
		<li>用 2 mL 新鲜的冷冻置换介质替换原有介质。</li>
		<li>将聚丙烯管置于 -30 °C 冰箱中 2 小时。</li>
		<li>用 2 mL 的 100% 丙酮冲洗聚丙烯管 1 小时，再用 2 mL 的 100% 乙醇冲洗 3 次，每次 1 小时。</li>
		<li>按照参考文献15中所述进行包埋和包埋处理：使用丙酮中浓度递增的丙烯酸树脂（25%、50% 和 75%）对样品进行浸透，并用 100% 丙烯酸树脂在明胶胶囊中包埋样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 样品的可视化
<ol>
	<li>包埋后，使用超薄切片机将样品切成80 nm的超薄切片。在室温下用2%柠檬酸铅染色1分钟15。</li>
	<li>使用80 kV或120 kV的透射电子显微镜观察切片15。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

透射电子显微镜（TEM）是一种用于细胞器、细胞和组织超微结构观察的强大方法。冷冻固定/冷冻置换是目前保存超微结构和蛋白质抗原性的最佳方法。化学固定剂渗透并作用缓慢，因此在超微结构完全稳定之前可能发生结构重排2。相反，冷冻固定/冷冻置换可瞬间稳定细胞结构4。然而，冷冻固定/冷冻置换技术存在诸多限制和困难，从而限制了其应用范围，包括样品类型、冷冻假象、技术操作难度、成本和设备要求。高压冷冻/冷冻置换技术已实现对细胞细节的高度保存6,7。相比之下，冷冻蚀刻（PF）已用于观察悬浮在非晶态冰薄膜上的微小物体9。本文所述的冷冻蚀刻/冷冻置换方法用于超微结构和免疫标记研究，可提供与高压冷冻图像质量相当的酵母、寄生虫和细菌超微结构的高质量图像。
固定质量取决于冷却速率18。在高冷却速率下，水处...

样品制备对于任何电子显微镜研究的成功都至关重要。传统的电子显微镜固定方法是用于透射电子显微镜（TEM）组织或细胞固定的首要方法1。首先，在室温下使用醛类和四氧化锇对样品进行化学固定。随后，样品经有机溶剂脱水、渗透并包埋于环氧树脂中。该方法依赖于固定剂向细胞内的渗透速率。因此，通常会观察到细胞内容物的人为假象及提取现象2。
冷冻固定显然是保存细胞结构的更优方法3，可使其保持完整。通过冷冻固定/冷冻置换方法，可在薄树脂切片中获得最高质量的透射电镜（TEM）图像4。该技术的目标是获得无冰晶形成、或所含冰晶足够小而不损伤细胞超微结构的玻璃化生物样品。高压冷冻（HPF）和超快速冷冻固定（也称为浸入式冷冻，PF）是两种冷冻固定的常用方法。HPF 可瞬间固定细胞内的分子，避免传统电镜固定所造成的损伤。目前已开发出多种类型的冷冻设备及自动置换装置5。尽管冷冻设备及相关耗材（液氮、样品载具等）价格昂贵，但其能够生成高质量的电子显微图像6,7。浸入式冷冻（PF）是一种20世纪50年代初期即已使用的技术，文献中描述其操作简单且成本低廉8。在 PF 操作过程中，将制备好的样品以极快速度冷冻，以获得小于3至5 nm的冰晶。为此，需将样品浸入液态冷冻剂（如乙烷、丙烷或乙烷-丙烷混合物）中。自20世纪50年代以来，PF 技术不断改进，使其可被更多用户所采用。目前，高压冷冻是唯一可行的方法，可用于冷冻厚度超过50 µm的多种样品（对于盘状样品，厚度可达200 µm）5，而 PF 则广泛用于观察小尺寸物体（&lt;100 nm），例如悬浮于非晶态冰薄层中的大分子复合物9。较大的样品（如真核细胞）也可通过 PF 进行冷冻固定，但需使用毛细铜管或夹心系统等特殊样品载具8,10,11。
本文介绍了一种适用于多种悬浮细胞培养物的快速、易用且低成本的浸入式冷冻/冷冻置换技术。

<table><tbody><tr><td>载网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇缩甲醛（Formvar）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>丙烷 N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双刃解剖针</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>8.5 mL 玻璃小瓶</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR international</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸树脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂 M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂 M 固化剂</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>邻苯二甲酸二丁酯&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂 M 促进剂</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>结晶皿</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>约瑟夫纸（Joseph paper）</td><td>VWR international</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>黄铜杯</td><td></td><td></td><td>可自行制作或在手工店制作</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Saccharomyces cerevisiae&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shizosaccharomyces pombe&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trypanosoma brucei&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Leishmania amazonensis&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>密封箱</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>空气净化式呼吸器</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>呼吸器滤毒盒</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>颗粒物过滤器</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

冷冻蚀刻：用于透射电子显微镜下悬浮细胞超微结构与免疫定位研究的工具

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

透射电子显微镜（TEM）是一种用于研究细胞超微结构的卓越工具，可实现蛋白质定位和大分子复合物的高分辨率可视化。然而，为了尽可能接近细胞的天然状态，必须实现完美的样品保存。例如，传统的电子显微镜（EM）使用醛类固定剂，无法提供良好的超微结构保存效果。固定剂渗透缓慢会导致细胞发生重组并丢失多种细胞组分。因此，传统的EM固定方法无法实现结构和抗原性的瞬时稳定与保存。观察细胞内事件的最佳选择是采用冷冻固定，随后进行冷冻置换固定法，以保持细胞的天然状态。高压冷冻/冷冻置换技术能够保持细胞超微结构的完整性，是目前最常用的方法，但需要昂贵的设备。本文介绍一种适用于悬浮细胞培养物的、简便且低成本的冷冻固定方法，随后进行冷冻置换处理。

本文介绍了一种用于超微结构（图1 和 图2）和免疫标记（图3）研究的简便且低成本的浸入式冷冻方法。我们证明，冷冻置换过程无需使用专用设备，且复温过程耗时不到6小时，而使用专用系统则需24小时。
PF/冷冻置换法可改善细胞内结构的保存效果 酿酒酵母 (图1A 和 1D-H), 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） (图1B 和 C), 利什曼原虫鞭毛 (<strong class=...

本文描述了一种简便且低成本的冷冻固定方法，用于通过透射电子显微镜观察悬浮细胞。

透射电子显微镜（TEM）是一种用于研究细胞超微结构的卓越工具，可用于蛋白质定位以及可视化……

以下实验的目的是提出一种用于悬浮细胞超微结构和免疫定位研究的工具，以实现透射电子显微镜下的可视化观察。该技术操作简便、成本低廉，且能极好地保存细胞结构。这是一份悬浮细胞培养物。首先，通过不同步骤的离心将细胞收集到微量离心管中，形成细胞沉淀。第二步，采用浸入式快速冷冻法对样品进行迅速冷冻，以固定细胞并限制冰晶的形成。接下来，进行冷冻置换，用含有四氧化锇作为固定剂的溶剂替代细胞中的水分，从而稳定细胞结构。结果表明，浸入式冷冻和冷冻置换能完美保存细胞的超微结构。化学固定曾是透射电子显微镜中用于固定组织或细胞的主要方法，但该方法通常会导致产生人工假象并引起细胞内容物的抽提。化学固定的一种替代方法是低温固定（cryofixation）。该方法是获得高质量形态学薄树脂切片的最佳选择。浸入式冷冻是一种冷冻固定技术，可瞬间固定细胞内的分子，从而避免常规化学固定所造成的损伤。在进行浸入式冷冻前，必须预先准备好带有聚乙烯醇薄膜的载网，用于冷冻样品的支撑。使用无绒布将玻璃载玻片擦拭至光亮并清洁干净。将玻璃载玻片浸入含0.3%福尔马林的氯仿溶液中数秒，随后将其直立放置于烧杯中自然晾干。由于氯仿的存在，操作必须在通风橱内进行，并佩戴个人防护装备。将蒸馏水注入结晶皿后，用玻璃棒在水面上方轻轻掠过，以去除灰尘。待薄膜干燥后，用锋利的剃刀刀片在边缘划痕，以便使薄膜脱离。通过向载玻片表面用力呼气，使水蒸气凝结在薄膜上，从而对载玻片进行冰冻处理。将载玻片底部以约30度角接触水面，立即将薄膜漂浮于水面上。缓慢将载玻片放入水浴中，必要时轻轻分离薄膜。Formvar薄膜会缓慢沉降并铺展在水面上。使用镊子将薄膜固定在结晶皿边缘。将400目铜网轻轻正面朝下放置在薄膜上厚度合适且无皱褶的区域。当薄膜连同铜网漂浮在水面上时，用约瑟夫纸覆盖并将其整体捞起。拿起Joseph纸的边缘，载网的薄膜应随之被提起。切勿让手指接触水面，否则可能导致薄膜留在水中。载网使用前需干燥数小时。进行超微结构研究时，将四氧化锇安瓿放入玻璃烧瓶中。充分振荡烧瓶以震碎安瓿。加入适量100%丙酮，使终浓度为4%。搅拌含有冷冻置换介质的烧瓶，并用塑料移液管将1.5毫升等分试样分装至冻存管中。使用前将所有瓶盖拧紧，并于零下84度冰箱中保存。进行蛋白质免疫标记研究时，配制0.1%的醋酸铀于丙酮中。待溶液变澄清后，用0.2微米滤器过滤，并将1.5毫升分装至冻存管中。使用前请在零下84摄氏度的冰箱中保存。为确保不同细胞类型的细胞沉淀具有一致的适当性状，需在最少体积的完全液体培养基中培养原始酵母细胞，以获得1×10⁹个细胞；在DTY培养基中培养大肠杆菌（Escherichia coli），以获得5×10¹⁰个细菌细胞。在AM培养基中培养利什曼原虫鞭毛体，在SDM79培养基中培养布氏锥虫，以获得5 × 10⁸个寄生虫细胞。将含有悬浮细胞的培养液转移至50毫升聚丙烯管中，在1,500 ×g条件下离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升相应的细胞培养基中。在微量离心管中以3,900 ×g离心一分钟。完全去除上清液。对于冷冻固定方法，必须使用带有连接至丙烷气瓶的管路的丙烷瓶。丙烷具有潜在爆炸性，因此必须在通风良好的房间或通风橱中进行液化操作，严禁明火。使用液氮时，必须始终佩戴包括低温手套在内的个人防护装备。在聚苯乙烯托盘中加入少量液氮。将黄铜杯放入液氮中。可见气泡产生。等待气泡消退。然后将黄铜杯冷冻。将连接至丙烷气瓶的管子与黄铜杯壁接触。缓慢打开丙烷气瓶阀门。由于丙烷尚未开始液化，会形成大量烟雾。当丙烷开始液化时，烟雾随之消失。通过关闭丙烷气瓶阀门并迅速移除与丙烷气瓶相连的管路，停止液化过程。将液氮注入聚苯乙烯托盘中，直至液面距离黄铜杯顶部约五毫米。将用于冷冻后替换样品的小黄铜杯放入液氮中进行冷冻。每个样品使用一个杯子，注意不要混样。为获得适当的沉淀物稠度，只需严格遵守之前所述的培养条件和离心参数即可。使用镊子前先将其冷冻。取一个用Formvar切割的400目铜质显微镜载网。将双刃解剖针插入样品沉淀中。使用工具将一滴沉淀物置于载网上。迅速将载网浸入液态丙烷中，并搅拌数秒。立即将冷冻的载网转移至小黄铜杯中。每个样品至少制备三张载网。取载网前切记先将镊子预冷。使用镊子前应先将其冷冻。迅速取下杯子，用镊子将冷冻载网转移至冷冻管中。盖紧冷冻管盖。对每个样品的每张载网重复上述操作。盖紧管盖，轻轻搅拌冻存管，确保样品完全浸入冷冻置换介质中。将冻存管置于-84 °C冰箱中静置三天。转移冻存管时，使用聚苯乙烯托盘，避免温度突然升高，然后将其放入-30 °C冰箱中。在零下30摄氏度下静置一小时。将冻存管在零下15摄氏度下放置两小时，然后将样品置于4摄氏度下两小时，再于室温下放置30分钟。使用塑料移液管移除冷冻置换介质，并将其放入已明确标识的适当废液瓶中。加入约 500 微升 100% 丙酮。打开玻璃小瓶，搅拌冷冻管，并迅速将冷冻置换介质放入玻璃小瓶中。用 100% 丙酮冲洗一个冷冻管。用100%丙酮冲洗三次，每次10分钟。将冻存管置于聚苯乙烯托盘中，以避免温度骤升，然后放入-30°C冰箱。在-30°C下静置2小时。将样品放入聚丙烯小瓶后，用新鲜的冷冻置换介质替换原有的冷冻置换介质，并在零下30摄氏度下放置两小时。用100%丙酮冲洗一小时，再用100%乙醇冲洗三次，每次一小时。浸入冷冻/冷冻置换法对悬浮细胞的细胞内结构实现了极好的保存。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，细胞结构未出现皱缩，细胞质呈现致密状态。此外，膜结构光滑，表明样品保存良好。所有细胞器，如细胞核、线粒体和液泡，均可被清晰识别。在利什曼原虫鞭毛、布氏锥虫和大肠杆菌中也观察到极好的保存状态。在细胞核中，构成核膜的双层膜、核孔、纺锤极体以及附着在核膜外层的核糖体均清晰可见。在线粒体中，内膜向内凹陷形成的嵴结构清晰可辨。关键的细胞器是液泡，因为容易形成大的冰晶。在图像中，液泡完好无损，没有冰晶损伤。浸入式冷冻/冷冻置换法也可用于蛋白质的免疫定位。该方法能完美保持蛋白质抗原性，且如前所述，细胞器可被清晰识别。已有多种抗体用于酵母中不同蛋白质的检测，例如抗ATP合成酶抗体和抗孔蛋白抗体。该实验方法也可应用于其他实验体系，如在利什曼原虫中对flabarin蛋白进行定位。观看本视频后，您应能充分掌握如何采用浸入式冷冻/冷冻置换法制备样品，以便在透射电子显微镜下进行观察。该技术操作快速、简便易行、成本低廉，且能极好地保存细胞超微结构。操作时需小心液氮，尤其要注意四氧化锇和醋酸铀酰的使用安全。应佩戴适当的个人防护装备（包括实验服和手套）在通风橱中操作。

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