使用化学发光法测定生物材料中一氧化氮通路代谢物亚硝酸盐和硝酸盐的含量

本实验方案的目的是利用化学发光法，通过检测亚硝酸盐和硝酸盐的含量，定量生物样品中的一氧化氮，所用还原溶液包括三碘化物和氯化钒。该方案为从多种生物样品中区域性及纵向追踪一氧化氮的代谢与信号传导提供了有力工具。该技术的主要优势在于其操作简便且灵敏度高。

本次实验操作将由我们的IRTA研究员Katelyn Cassel进行演示。她将向我们展示如何利用三碘化物溶液偶联化学发光法来测定亚硝酸盐。首先，配制一种可保存亚硝酸盐的溶液。

配制一种溶液，其中含 118 毫摩尔的 NEM 和 890 毫摩尔的亚铁氰化钾，溶剂为蒸馏水。将固体充分溶解，直至溶液呈澄清的黄色且无晶体残留。然后按 9:1 的体积比将该溶液加入 NP-40 中。

轻轻混匀溶液以避免起泡。切勿涡旋震荡此混合液。若在4摄氏度保存，亚硝酸盐保护液可使用约一周时间。

该方案可用于多种新获取的生物样本。在此案例中，采集的新鲜血液经离心处理以获得血浆样本用于检测。处理血液或任何含有大量血红素蛋白（如血红蛋白或肌红蛋白）的生物样本时，必须尽快操作，因为血红素蛋白会与亚硝酸盐发生反应，从而破坏亚硝酸盐。

现在，为了最大限度地保存内源性血浆亚硝酸盐，需立即将血浆与亚硝酸盐保护液按1:4的体积比混合。在制备过程的任何阶段，样品均可在干冰上冷冻。为去除蛋白质，将样品与等体积的冷甲醇混合。

接下来，在 4 摄氏度条件下以 13000 G 离心 15 分钟，使蛋白质沉淀。收集上清液用于亚硝酸盐测定。为实现对亚硝酸盐的高灵敏度检测，通常认为三碘化物还原溶液最为有效。

配制时，确保所有晶体完全溶解。将溶液保存在避光瓶中，并在配制后一周内使用。钒氯化物还原溶液在测定硝酸盐时可提供最高的精确度。

使用1微摩尔的亚硝酸盐溶液来测定亚硝酸盐以及硝酸盐的标准曲线。根据制造商的说明设置一氧化氮分析仪。首先，打开氧气罐，启动仪器，并将其连接到含有1摩尔氢氧化钠的酸阱上。

接下来，打开氦气罐，然后将玻璃反应室连接到氦气罐上。现在，向反应室中加入用于亚硝酸盐测定的三碘化物溶液。加入消泡剂。

调节气体流速以减缓气泡产生。然后将酸捕集装置连接至反应室。通过反复试验，调节氦气流速，使其与仪器的抽吸力相匹配。

现在，启动基于可视化编程的液体处理软件。首先，从“数据”菜单中启用仪器与采集软件之间的通信，然后从前面板的主菜单启动分析。等待光电倍增管冷却器将温度降至零下12摄氏度以下，并等待光电倍增管稳定。

大约30分钟后，基线将稳定在1至2毫伏范围内。关键在于数值的稳定性，而非数值本身。分析仪稳定后，使用一支清洗干净的Hamilton注射器注入溶液。

首先，注入至少三种不同体积的1微摩尔亚硝酸盐标准溶液。通过隔垫将溶液注入还原溶液中。每种标准品或样品均需重复注入两次。

若预期样品中亚硝酸盐含量较高，可考虑注入较大量的第四份亚硝酸盐标准溶液，以更准确地确定标准曲线的斜率。每次进样后均需观察输出结果，并等待分析仪重新稳定至基线水平后再注入下一个样品，此过程至少需要一分钟。

为获得准确结果，请使用样品体积使峰高低于700毫伏。每次运行之间，须用去离子水彻底清洗注射器。彻底清洗注射器至关重要。

完成所有测量后，按下软件中的停止选项。数据将自动保存。按下中止将终止测量且不保存数据。

关闭反应容器顶部的旋塞，并断开连接酸阱与反应容器的管路。实验结束后，将分析仪置于待机状态。在主面板上按下分析键，确认其进入待机模式。

接下来，关闭供氧。将管路从氧气罐上拆下，并与酸阱分离。然后用氦气冲洗三碘化物溶液。

接下来，关闭并断开氦气罐与玻璃反应容器的连接。最后根据需要使用乙醇和水清洗容器。测试标准以及血浆样品结果显示，在样品注入后立即出现光电倍增管电压升高，并在所有亚硝酸盐被还原后恢复至基线水平，此过程可能持续长达一分钟。

为了定量信号，使用电压跳变峰下的面积从标准品构建标准曲线。利用该标准曲线，样品在重复进样之间的定量结果具有很高的可重复性。化学发光法被认为是测定亚硝酸盐浓度的金标准。

一旦掌握，亚硝酸盐的检测灵敏度极限可低至二十毫摩尔。进行化学发光实验时最重要的是精确性。由于该方法具有高灵敏度，任何微小的失误都会影响最终结果。

因此，请耐心操作，不要急于求成。该技术在21世纪初研发成功后，为研究人员探索一氧化氮代谢通路铺平了道路，并使人们认识到一氧化氮缺乏会导致多种疾病，尤其是心血管疾病。