生物素填充并处理的脑组织切片中神经化学标记物的免疫染色

本实验方案的目的是介绍一种高效的方法，用于在电生理记录过程中通过生物胞素标记和免疫染色来识别已进行膜片钳记录的神经元，以在使用特异性抗体重新染色确定其神经化学特性之前，恢复其形态结构。因此，该方法描述了研究神经元结构与功能多样性的关键步骤，这对于理解神经元在脑网络中的作用至关重要。

使用顺序处理技术的主要优势在于，它能够避免因无法恢复形态而造成的数据丢失。因此，该技术还有助于指导对这些细胞中神经化学标志物的检测。尽管本方法是针对厚切片中细胞形态的恢复而描述的，但它同样可应用于薄切片以及先前已染色并封片的样本。

初学者在使用该方法时，通常在脱离细胞的同时重新封闭胞体方面存在困难，并且可能未能给予足够时间以实现充分的填充。由于需要特定技术才能有效进行细胞的生物胞素填充，从而完整回收细胞形态，因此该方法的可视化演示至关重要。开始此操作时，在电压钳配置下，于接近细胞时在浴液模式下使用膜测试功能施加短暂的小幅电压阶跃。

通过施加负压吸附到细胞上。然后，将细胞钳制在负70毫伏。注意观察吉欧姆封接的形成。

补偿容性瞬变，然后使用注射器或通过口腔施加受控吸力，以形成全细胞记录构型。估算全细胞电容和串联电阻，并停止膜测试脉冲。串联电阻小于10兆欧时为最佳。

这将确保建立全细胞记录条件，以实现生物胞素填充。生理记录完成后，在电压钳模式下，通过以小步长缓慢移动记录电极，交替向上和向外，重新建立膜片钳配置。实现细胞形态学回收最关键的步骤是在将记录电极从细胞脱离的同时，确保神经元胞体重新封闭。

使用膜测试功能，观察电容性瞬变电流的消失以及电流反应坍塌为一条直线，这表明细胞已重新封闭，并在移液管尖端形成了外向外膜片。同时，将细胞维持在去极化电位有助于促进重新封闭过程。在将移液管从细胞上脱离后，将脑片保留在记录室中 3 至 5 分钟，以确保染料运输至远端的树突和轴突过程。

然后，将切片转移至含有4%PFA的24孔板中进行固定。PFA固定后24至48小时，将所有固定好的切片转移至0.1 M PBS中保存，以备免疫染色使用。在此步骤中，用0.1 M PBS将组织清洗三次，每次10分钟。

接下来，在室温下用10%封闭血清封闭组织1小时。随后，在室温下将切片与CB1R一抗孵育过夜，以检测1型大麻素受体的表达。然后，用0.1 mol PBS将脑切片洗涤3次，每次10分钟。

将链霉亲和素和针对第一种一抗的二抗同时加入孔板中，在4摄氏度下孵育过夜。随后，将切片在4摄氏度避光条件下与链霉亲和素-红色染料偶联物共同孵育过夜，以显示生物胞素标记。之后，用0.1摩尔PBS缓冲液对脑切片进行洗涤，每次10分钟，共洗三次。

为了保护荧光信号并便于将来重新染色，将切片置于等间距的封片剂中进行封片。用透明指甲油密封盖玻片的边缘。在此步骤中，使用蘸有丙酮的棉签将玻璃载片上的指甲油彻底清除。

使用尖头镊子小心地取下盖玻片，并在切片上滴加数滴 0.1 摩尔 PBS。在将组织从水性封片剂中卸下时，关键是要避免损伤组织切片。用细毛刷小心地将切片从载玻片上取下，置于摇床上，用 0.1 摩尔 PBS 在 4°C 避光条件下清洗 24 至 48 小时。

为确保完全去除封片剂，于次日用 0.1 摩尔 PBS 洗涤切片一至两次，每次 10 分钟。然后将切片与第二种一抗胆囊收缩素在 4℃ 孵育一天。再用 0.1 摩尔 PBS 洗涤脑切片三次，每次 10 分钟。

随后，使用荧光染料标记的二抗——山羊抗小鼠抗体对切片进行染色，确保该二抗的激发和发射光谱不与链霉亲和素及先前的免疫荧光染料发生重叠。之后，将切片封片于水性封固介质中。

用透明指甲油封固盖玻片边缘。在成功完成生物胞素填充及首次免疫染色后，可对神经元结构进行可视化观察和成像，如60倍放大下获得的共聚焦图像所示。该切片同时进行了CB1R与生物胞素的免疫染色，箭头所示为表达生物胞素的神经元胞体中的CB1R免疫染色信号。

同一组织切片在一周后进行了CCK免疫反应性处理，图像显示由星号标示的多个神经元中CCK免疫标记成功恢复。请注意，箭头所示的生物胞素标记细胞不表达CCK。A、B和C三幅图的合并图像显示，三种标记均清晰可见，且生物胞素与CB1R之间的共定位明显。

该图像显示，第二次免疫染色过程并未影响先前染色的信号。生物胞素标记细胞的形态学特征来自此次CCK免疫染色之前的共聚焦图像。关键的是，除了胞体和树突外，轴突亦可被清晰观察到，并且可观察到CB1R与生物胞素标记的轴突结构存在共标记现象。

进行该操作时，应靶向切片表面下方的健康细胞，以避免触及轴突已切断的神经元，否则可能影响形态学的恢复。一旦掌握该技术，即可在膜片钳记录过程中可靠地获得生物胞素标记细胞的形态学重建。

成功实施连续免疫染色技术将提高数据回收的效率，并有助于在标准膜片钳记录过程中对神经元进行表征。观看本视频后，您应能够充分了解如何有效利用含生物胞素的细胞来回收神经元形态，并确定神经化学标记物。