通过肽-MHC-I 四聚体染色法分析恒河猴中猴免疫缺陷病毒特异性 CD8⁺ T 细胞

本实验的总体目标是计数并表征由疫苗接种或初次感染所诱导的猴免疫缺陷病毒特异性 CD8 阳性 T 细胞群体。该方法有助于解答 T 细胞免疫学领域的关键问题，例如疫苗接种或感染所诱导的抗原特异性 CD8 T 细胞的频率是多少。该技术的主要优势在于，可直接对从体内获取的生物样本进行检测，无需体外再刺激，即可定量其中的抗原特异性 CD8 T 细胞。

该技术的应用前景包括评估恒河猴中特定切口的 CD8 T 细胞，以及在多种疾病背景下研究 CDB T 细胞反应。通常，初学者由于对恒河猴 MHC 遗传学的知识尚不完善，以及流式细胞染色需要精确的抗体应用，因此在操作该方法时会遇到困难。首先，用 R10 培养基重悬恒河猴 PBMC。

加入浓度为每毫升1.6 × 10⁷个细胞。将50 µL细胞分装至相应数量的流式细胞术检测管中，每管加入50 µL蛋白激酶抑制剂。涡旋混匀各管，并将样品在37°C孵育30分钟。

必须将适量的滴定肽-MHC 四聚体稀释在足量的总混合液中，以确保所有实验管中的样品均能完成染色。因此，为避免移液误差，建议制备比实际需要量多 15% 的总混合液。在细胞孵育的同时，通过离心沉淀四聚体溶液中的蛋白质聚集体，以尽量减少背景染色。

接下来，用足够的染色缓冲液稀释四聚体，使每管流式细胞术样品管中可加入25微升四聚体混合液。然后涡旋混匀样品管，并将PBMC与四聚体的混合液在室温避光孵育45分钟。孵育结束后，向相应的样品管中加入50微升染色混合液。

将各管涡旋混匀。室温避光孵育25分钟后，用洗涤缓冲液洗涤细胞，离心收集细胞沉淀，并小心弃去上清液，避免扰动沉淀。用每管中残留的缓冲液重悬细胞，然后每管加入250 µL 2%多聚甲醛固定样本。

立即涡旋混匀，并在4摄氏度避光孵育试管。20分钟后，用新鲜洗涤缓冲液洗涤细胞。通过离心收集细胞沉淀，倾去上清液时勿扰动沉淀。

将细胞重悬于500微升破膜缓冲液中，涡旋混匀，在室温避光孵育10分钟。然后洗涤并离心收集细胞。随后如前所述弃去上清液。

向相应的试管中加入50微升胞内染色主混合液。涡旋混匀各样品，在室温避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，洗涤并离心收集细胞。

样本现已准备好用于流式细胞仪检测。Mamu-B017.01 四聚体通常产生较弱的染色信号，但通过蛋白激酶抑制剂对细胞进行预处理，可显著增强染色强度。为避免背景染色，应使用相应的四聚体试剂对MHC I类分子匹配的细胞进行标记，这些细胞可含有或不含有目标抗原特异性CD8阳性T细胞亚群，并需设置多个稀释梯度，以确定能够实现四聚体阳性与阴性CD8阳性T细胞之间最佳分离效果的最适试剂用量。

在这些图中，展示了用于分析 Mamu-A*01 阳性恒河猴中疫苗诱导的 Gag CM9 特异性 CD8 阳性 T 细胞反应强度及其记忆表型的设门策略。请注意，四聚体阳性 CD8 阳性 T 细胞群清晰分离，背景染色极低；在四聚体设门内，通过 CD28、CCR7 和颗粒酶 B 的表达可清楚区分各记忆细胞亚群。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在约三小时内完成。在进行该实验过程中，务必牢记将正确的试剂加入每种抗体或四聚体预混液中，并每次按照演示方式处理实验管。该技术问世后，为免疫学领域的研究人员探索抗原特异性CD8 T细胞的特异性和表型提供了重要途径。

观看本视频后，您应能够充分了解如何在恒河猴人 HIV-1 艾滋病研究模型的实验中建立 MHC I 类四聚体染色。请务必注意，处理来自恒河猴的生物样本时需要采取特殊预防措施，例如在样本处理过程中佩戴适当的一次性个人防护装备。