猴免疫缺陷病毒特异性CD8分析 + T细胞猕猴由肽MHC-I四聚体染色

该测定的总体目标是列举和表征由疫苗接种或原发感染产生的猿猴免疫缺陷病毒特异性 CD8 阳性 T 细胞群。这种方法可以帮助回答 T 细胞免疫学领域的关键问题，例如疫苗接种或感染诱导的抗原特异性 CD8 T 细胞的频率是多少。该技术的主要优点是它可以定量直接在离体获得的生物样品中的抗原特异性 CD8 T 细胞，而无需体外再刺激。

该技术的意义延伸到评估恒河猴中切口特异性 CD8 T 细胞，以及研究多种疾病环境中的 CDB T 细胞反应。一般来说，由于恒河猴 MHC 遗传学的可用知识不完整，并且流式细胞术染色需要精确的抗体应用，因此不熟悉这种方法的个体会遇到困难。首先将 R10 培养基中的 rh PBMC 重新悬浮。

每毫升浓度向第七个细胞中加入 1.6 乘以 10 倍的浓度。将 50 μL 细胞分装到适当数量的流式细胞仪管中，并向每个管中加入 50 μL 蛋白激酶抑制剂。涡旋每根试管，并将样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

必须在足够的预混液中稀释正确量的滴定肽 MHC 四聚体，以便对所有实验管进行染色。因此，制备 15% 过量的预混液非常重要，以解决移液错误。当细胞孵育时，通过离心将蛋白质聚集体沉淀在四聚体溶液中，以尽量减少背景染色。

接下来，在足够的染色缓冲液中稀释四聚体，以便向每个流式细胞术管中加入 25 μL 四聚体预混液。然后涡旋样品管，并在室温下避光孵育 PBMC 四聚体溶液 45 分钟。孵育结束时，将 50 μL 染色预混液添加到适当的样品管中。

并混合试管进行涡旋。在室温下避光 25 分钟后，用洗涤缓冲液洗涤细胞，通过离心沉淀细胞，并在不干扰沉淀的情况下小心倒出上清液。在每管中剩余的缓冲液中涡旋细胞，并用每管 250 微升 2% 多聚甲醛固定样品。

立即涡旋并在 4 摄氏度的黑暗中孵育试管。20 分钟后，在新鲜的洗涤缓冲液中洗涤细胞。通过离心沉淀细胞，并在不干扰沉淀的情况下倒出上清液。

细胞重悬于 500 μL 透化缓冲液中，涡旋，并在室温下避光孵育 10 分钟。然后洗涤并沉淀细胞。然后如前所述倒出上清液。

继续向适当的试管中加入 50 μL 细胞内染色预混液。涡旋每个样品，并在室温下避光孵育 30 分钟。孵育完成后，洗涤并沉淀细胞。

样品现在可以在流式细胞仪中采集。Mamu-B017.01 四聚体通常产生暗淡的染色，可以通过用蛋白激酶抑制剂对细胞进行预处理来显著改善。为避免背景染色，含有或不包含感兴趣的抗原特异性 CD8 阳性 T 细胞群的 MHC 1 类匹配细胞应使用相关的四聚体和多重稀释液进行标记，以确定在四聚体阳性和阴性 CD8 阳性 T 细胞之间实现最佳分离的最佳量。

在这些图表中，显示了用于分析 Mamu-A 01 阳性恒河猴中疫苗诱导的 Gag CM9 特异性 CD8 阳性 T 细胞反应的大小和记忆表型的门控策略。请注意，四聚体阳性 CD8 阳性 T 细胞群分离良好，背景染色最小。并且记忆亚群由它们在四聚体门内的 CD28、CCR7 和 Granzyme B 表达清楚地描绘出来。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约三个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住向每种抗体或四聚体预混液中添加正确的试剂，并每次都使用实验管，如图所示。该技术开发后，为免疫学领域的研究人员探索抗原特异性 CD8 T 细胞的特异性和表型铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何在人类 HIV-1 艾滋病研究的恒河猴模型测定中设置 MHC 1 类四聚体染色有很好的了解。不要忘记，处理恒河猴的生物标本需要采取特殊的预防措施，例如在样本处理过程中佩戴适当的个人防护设备。