Name: 猴免疫缺陷病毒特异性CD8分析 + T细胞猕猴由肽MHC-I四聚体染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学习使用肽MHC-I四聚体染色技术定量分析恒河猴外周血单核细胞中的猴免疫缺陷病毒特异性CD8阳性T细胞。该方法无需体外再刺激即可直接检测抗原特异性T细胞频率，为HIV免疫学研究和疫苗开发提供可靠工具。

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我们感谢David Watkins对实验工作的支持，这些实验促成了本方法的优化。本出版物报道的研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助号P30AI073961项下迈阿密艾滋病研究中心提供的试点资助支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

本研究中使用的外周血单个核细胞（PBMC）样本来源于饲养在威斯康星国家灵长类研究中心的印度恒河猴。这些动物的饲养和管理遵循威斯康星大学研究生院动物护理与使用委员会批准的方案，并符合Weatherall报告的要求33。所有动物实验均在麻醉状态下进行，并尽一切努力将潜在的痛苦降至最低。
1. PKI 处理
注意：此步骤对于Mamu-B*017:01四聚体是可选的，但建议执行。参见结果和讨论部分。
<ol>
	<li>将PBMC重悬于R10培养基中，细胞浓度为1.6 × 107 个细胞/ml。</li>
	<li>向相应的流式细胞术检测管中加入50 µl该细胞悬液。每管加入50 µl浓度为100 nM的PKI溶液。</li>
	<li>涡旋混匀各管，37 °C孵育30分钟。此步骤结束时，每管总体积应为100 µl，含有8.0 × 105 个PBMC和50 nM的PKI。</li>
	<li>进入pMHC-I四聚体染色步骤。</li>
</ol>
2. 使用荧光染料标记的pMHC-I四聚体进行染色
<ol>
	<li>在制备pMHC-I四聚体主混合液之前，将pMHC-I四聚体管在4 °C条件下以20,000 x g离心至少15分钟。此步骤的目的是沉淀pMHC-I四聚体溶液中的蛋白质聚集体，以减少可能增加背景染色的非特异性信号。离心完成后，应避免从管底吸取液体，以防吸入已沉淀的蛋白质聚集体。</li>
	<li>准备足够的pMHC-I四聚体混合液以用于所有实验管的染色。为弥补移液误差，该混合液的总体积需额外多准备15%。</li>
	<li>将pMHC-I四聚体用染色缓冲液稀释（例如， Brilliant染色缓冲液），使得每项检测中加入25 µl的pMHC-I四聚体主混合液。
	<ol>
		<li>用两种pMHC-I四聚体对标记PBMC，每项检测使用两种：一种偶联别藻蓝蛋白（APC），另一种偶联亮紫（Brilliant Violet，BV）421。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 8.0 × 105 将PBMC加入相应的流式细胞术检测管中，终体积为100 µl。如果细胞已接受上述PKI处理，则在此步骤中应已重悬于100 µl溶液中。</li>
	<li>向相应的流式细胞术管中加入25 µl pMHC-I四聚体主混合液。此步骤结束时，每管中的终体积应为125 µl。</li>
	<li>涡旋振荡各管，以混匀细胞悬液。</li>
	<li>室温避光孵育45分钟。在此45分钟孵育期间，配制表面染色单克隆抗体混合液。</li>
</ol>
3. 表面染色
<ol>
	<li>准备足够的单克隆抗体（mAb）混合液以染色所有实验管。为弥补移液误差，该混合液的总体积应额外多准备15%。</li>
	<li>用染色缓冲液调整混合液的体积，使每项检测加入50 µl。</li>
	<li>为有效排除非CD8+ T细胞并清晰界定记忆性T细胞亚群，在表面染色混合液中应使用经滴定优化量的针对以下分子的单克隆抗体。 
	注意：各单克隆抗体所偶联的荧光染料仅作参考：CD14 BV 510、CD16 BV 510、CD20 BV 510、CD8α BV 785、CD28 PE Cy7 和 CCR7 FITC。请注意，针对CD14、CD16和CD20的单克隆抗体均偶联相同的荧光染料（即 BV 510），因为它们将被纳入&#34;dump&#34;门控。</li>
	<li>在表面染色混合液中加入一种可固定的染料，用于区分死细胞 [即 胺反应性染料（ARD）]。确保ARD试剂所偶联的荧光染料的发射光谱与用于&#34;dump&#34;门控的荧光染料相似。本实验中使用ARD Aqua。</li>
	<li>向相应的流式细胞术检测管中各加入50 µl 步骤3.1–3.4所述的染色混合液。此步骤完成后，每管中的终体积应为175 µl。</li>
	<li>涡旋振荡各管，避光、室温孵育25分钟。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（含0.1%牛血清白蛋白和0.45 g/L NaN3的PBS溶液）洗涤细胞。 
	警告：叠氮化钠为有毒物质，即使微量接触也可能引起症状。操作时应遵循实验所在机构环境健康与安全部门（EHS）办公室规定的安全指南。</li>
	<li>以510 × g离心5分钟。小心将上清液倒入单独的废液容器中，注意不要扰动沉淀。 
	警告：切勿将含叠氮化钠的洗涤缓冲液上清液倒入含漂白剂的废液槽中，因其可能发生反应并产生有毒气体34。有关叠氮化钠的处理方法，请咨询实验所在机构的环境健康与安全部门（EHS）办公室。</li>
	<li>倾去上清液后，将各管中残留液体中的细胞进行涡旋振荡。</li>
</ol>
4. 细胞固定
<ol>
	<li>向所有试管中加入 250 µl 的 2% 多聚甲醛（PFA）溶液以固定细胞。 
	注意：PFA 为有毒物质，即使接触微量也可能引起症状。操作时必须遵循实验所在机构 EHS 办公室规定的安全指南。
	<ol>
		<li>由于 2% PFA 溶液必须与细胞等渗，应使用 PBS 配制该溶液。100 毫升的 2% PFA 溶液足以用于多次实验。加入 2% PFA 后应立即彻底涡旋振荡所有试管，以防止细胞聚集体的形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
	<li>通过重复步骤 3.7–3.9 洗涤细胞。完成此步骤后，细胞可在 4 °C 避光保存 24–48 小时。在进入透化阶段前，需彻底涡旋振荡各试管。</li>
</ol>
5. 细胞透化
<ol>
	<li>加入 500 µl 通透缓冲液。涡旋振荡所有管子。</li>
	<li>室温避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>重复步骤 3.7–3.9 洗涤细胞。</li>
</ol>
6. 胞内染色
<ol>
	<li>准备足够的单克隆抗体主混合液，以用于所有实验管的染色。</li>
	<li>用 PBS 或染色缓冲液调整体积，使每项检测加入 50 µl 胞内单克隆抗体主混合液。</li>
	<li>使用已滴定浓度的抗 CD3 和抗 Gzm B 单克隆抗体，按照步骤 6.1 和 6.2 中所述配制单克隆抗体主混合液。 
	注意：pMHC-I 四聚体对 TCR 的结合可导致 CD3 内化，若将抗 CD3 单克隆抗体加入表面染色主混合液中，可能干扰 tetramer+ CD3+ CD8+ T 细胞的检测。为避免此问题，应在细胞透化后的本步骤中加入抗 CD3 单克隆抗体。以下列出各单克隆抗体偶联的荧光染料作为参考：CD3 PerCP Cy5.5 和 Gzm B PE。</li>
	<li>向相应试管中加入 50 µl 单克隆抗体混合液。避光室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>重复步骤 3.7–3.9 进行细胞洗涤。试管即可用于流式细胞仪检测。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该流程中有几个步骤值得讨论，因其对获得最佳结果至关重要。首先，生物样本的质量是任何流式细胞术检测成功与否的重要预测因素38在整个染色过程中，必须格外注意确保细胞具有活性并保持单细胞悬液状态。这一点在处理冻存样本时尤为重要，因为此类样本更容易发生细胞聚集，并通常含有较高比例的死细胞。在此情况下，建议在进行pMHC-I四聚体标记前，先将细胞悬液通过70 µm细胞筛网过滤，这可能会显著改善实验结果。其次，对实验中所用荧光染料进行准确的补偿调节，对于获得可靠的数据分析至关重要，尤其是在同一实验中同时检测多个参数时。因此，建议每次进行pMHC-I四聚体染色实验时均制备新鲜的单色补偿对照。我们倾向于使用补偿微球，因其具有广泛的抗Ig反应性，且能够产生清晰的阳性与阴性群体双峰分布。由于这些微球不会与MHC-I分子结合，因此可使用与pMHC-I四聚体所标记的相同荧光染料偶联的抗体例如，APC 和 BV 421）应作为补偿对照使用。多种供应商提供此类补偿微球，应按照制造商说明书进行操作。第三，由于本文所述的表型分析策略需要明确区分 CD8+ 基于三种分子梯度表达的T细胞亚群（即，</e...

CD8+ T细胞是适应性免疫系统的关键组成部分，因其参与肿瘤免疫监视并有助于清除细胞内病原体1。简而言之，CD8+ T细胞表达T细胞受体（TCR），可特异性识别存在于宿主细胞质膜上的肽段-主要组织相容性复合体I类分子（pMHC-I）。由于这些肽段来源于细胞内合成蛋白的蛋白水解过程，细胞表面的pMHC-I复合物可反映细胞内环境的状态。例如，在病毒感染时，被感染的细胞会呈递含有病毒来源肽段的MHC-I分子，这些肽段可作为巡逻中的CD8+ T细胞所表达的TCR的配体。当特异性识别病毒的CD8+ T细胞遇到呈递其对应pMHC-I配体的感染细胞时，TCR的结合将导致CD8+ T细胞活化，最终引发靶细胞裂解。鉴于TCR/pMHC-I相互作用的关键性，确定应答性CD8+ T细胞的数量、特异性和表型，通常能够揭示人类疾病的的重要线索。
直到20世纪90年代初，针对抗原特异性CD8+ T细胞的定量仍依赖于技术上较为复杂的有限稀释分析法（LDA）2,3。LDA不仅需要数天时间才能完成，还无法检测缺乏增殖潜能的细胞。因此，LDA严重低估了参与免疫应答的实际抗原（Ag）特异性CD8+ T细胞频率。尽管ELISPOT和细胞内细胞因子染色技术的发展显著提升了细胞免疫的检测能力，但这些方法在定量抗原特异性T细胞时仍需进行体外刺激4。直到1996年，Altman、Davis及其同事发表了具有里程碑意义的文章，报道了pMHC-I四聚体技术的开发5。该技术成功的关键在于pMHC-I分子的多聚化，这延长了TCR/pMHC-I相互作用的半衰期，从而降低了在流式细胞术洗涤步骤中pMHC-I四聚体脱落的可能性。与前述方法相比，pMHC-I四聚体的主要优势在于能够直接在离体（ex vivo）条件下准确检测抗原特异性CD8+ T细胞，而无需进行体外再刺激。此外，将pMHC-I四聚体染色与多色流式细胞术相结合，可对抗原特异性CD8+ T细胞的分化阶段、记忆表型及活化状态进行深入分析2-4。鉴于近年来在利用pMHC-I多聚体染色技术表征CD8+ T细胞受体库方面取得的技术进展6，该方法的应用范围有望持续扩大。
在生物医学研究领域，几乎没有哪个领域比艾滋病病毒免疫学从pMHC-I四聚体染色技术中获益更多7。尽管在Altman、Davis及其同事发表相关论文时8,9，CD8+ T细胞已被发现与HIV病毒血症的初期控制存在时间上的关联，但在随后的几年中，pMHC-I四聚体的应用显著加深了我们对HIV特异性CD8+ T细胞应答的理解。例如，pMHC-I四聚体染色技术帮助证实了大多数HIV感染者体内病毒特异性CD8+ T细胞应答具有显著的规模10-12。该方法还促进了对HIV和SIV特异性CD8+ T细胞应答的表征，这些应答受到MHC-I分子的限制，而这些MHC-I分子与在未接受抗逆转录病毒治疗情况下自发控制病毒复制的现象相关——这一现象被称为&#34;精英控制&#34;13-15。此外，pMHC-I四聚体在确立程序性死亡受体1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）通路作为慢性感染未控制状态下HIV特异性CD8+ T细胞功能障碍表型的可逆机制方面发挥了关键作用16,17。总体而言，这些研究凸显了pMHC-I四聚体在监测针对艾滋病病毒的CD8+ T细胞应答中的重要价值。
实验性SIV感染恒河猴（Macaca mulatta仍然是评估针对艾滋病病毒/艾滋病免疫干预措施的最佳动物模型18,19在过去的25年中，针对SIV特异性CD8+ 该猴种中的T细胞，包括MHC-I等位基因的发现及肽结合基序的界定13,20-27因此，已开发出用于分析SIV特异性CD8的pMHC-I四聚体+ 该动物模型中的T细胞反应28这些试剂大多由四种恒河猴MHC-I等位基因的基因产物构成： Mamu-A1*001、Mamu-A1*002:01、Mamu-B*008:01，以及 Mamu-B*017:01值得注意的是，恒河猴不表达MHC-C基因座29绝大多数本实验中使用的pMHC-I四聚体由埃默里大学的美国国立卫生研究院四聚体核心实验室（NIH Tetramer Core Facility）制备。然而，由于许可协议限制，部分试剂（包括与免疫优势表位Gag CM9结合的Mamu-A1*001四聚体）只能通过商业途径获取。利用上述四种恒河猴等位基因的pMHC-I四聚体，我们已成功定量了CD8+ 针对总共21个SIV表位的T细胞（表1)，这些是由疫苗接种或初次SIV感染所诱导的30,31 （马蒂斯 等，未发表的观察结果）。
本论文提供了一种优化的pMHC-I四聚体染色方案，用于测定恒河猴中SIV特异性CD8+ T细胞的频率及其记忆表型。该检测首先可选择性地使用蛋白激酶抑制剂（PKI；此处使用达沙替尼）孵育30分钟，以减少TCR内化，从而增强pMHC-I四聚体染色效果32。如下所述，此处理在使用Mamu-B*017:01四聚体时尤为有效。本文还提供了使用荧光染料标记的pMHC-I四聚体和单克隆抗体（mAb）对细胞进行标记的操作说明。本方案包含细胞通透步骤，以实现对与细胞裂解相关的分子——颗粒酶B（Gzm B）的胞内检测。同时在此步骤中加入抗CD3单克隆抗体，以增强对该TCR信号分子的检测效果。作为参考，本染色方案中使用的所有荧光染料均已列出。

<table><tbody><tr><td>达沙替尼</td><td>Axon medchem</td><td>Axon&amp;nbsp;1392</td><td>必须用DMSO重悬，并立即在-20 &amp;deg;C下保存</td></tr><tr><td>含Glutamax的RPMI培养基</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>必须在4 &amp;deg;C&amp;nbsp;下保存</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>必须在4 &amp;deg;C&amp;nbsp;下保存</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-两性霉素B混合液</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>必须在4 &amp;deg;C&amp;nbsp;下保存</td></tr><tr><td>无水DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>5 ml 圆底聚丙烯管</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>荧光染料偶联的pMHC-I四聚体</td><td>NIH Tetramer Core 或 MBL, Inc.</td><td></td><td>必须在&amp;nbsp;4 &amp;deg;C下保存和维持。使用前以20,000 × g离心15分钟。切勿冷冻。</td></tr><tr><td>荧光染料偶联的单克隆抗体</td><td>多家公司</td><td></td><td>必须在&amp;nbsp;4 &amp;deg;C&amp;nbsp;下保存和维持。切勿冷冻。</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD&amp;nbsp;可固定Aqua&amp;nbsp;死细胞染色试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>l34957</td><td>必须在-20 &amp;deg;C下保存。使用前将每份样品用50 &amp;mu;l DMSO重悬。</td></tr><tr><td>Brilliant染色缓冲液</td><td>BD Biosciences</td><td>563794</td><td>必须在&amp;nbsp;4 &amp;deg;C&amp;nbsp;下保存</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水</td><td>VWR</td><td>97064-158</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>VWR</td><td>700011-230</td><td>必须在&amp;nbsp;4 &amp;deg;C&amp;nbsp;下保存</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>室温保存。有毒物质。切勿与漂白剂混合。</td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>腐蚀性化学品，不可与叠氮化钠混合。小心操作</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>易燃、腐蚀性且有毒的试剂。小心操作</td></tr><tr><td>聚山梨酯20（Tween-20）</td><td>Alfa Aesar</td><td>L15029</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>破膜液2&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>340973</td><td>有毒且具腐蚀性的试剂。小心操作</td></tr><tr><td>1.5 ml 螺口Sarsdet管</td><td>VWR</td><td>72.692.005</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml DNA/RNA低吸附管</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td>建议使用无菌微量管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>由科研人员自行决定</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜&amp;nbsp;</td><td>由科研人员自行决定</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli Q一体化水净化系统</td><td>EMD Millipore</td><td>ZRXQ010WW</td><td>可使用任何供应商提供的分子生物学级水</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>由科研人员自行决定</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>由科研人员自行决定</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C&amp;nbsp;冰箱</td><td>由科研人员自行决定</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞仪必须配备与所用染色面板兼容的激光器和滤光片。</td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>VWR SCIENTIFIC INC.</td><td>89068-738</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td>必须能够维持37 &amp;deg;C&amp;nbsp;的内部温度</td></tr><tr><td>FACS Diva软件</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo软件版本9.6</td><td>Flowjo</td><td></td><td>用于分析FACS Diva软件生成的FCS文件</td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过肽-mhc-i 四聚体染色法分析恒河猴中猴免疫缺陷病毒特异性 cd8+ t 细胞

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

肽段-主要组织相容性复合体I类（pMHC-I）四聚体已成为研究CD8+ T细胞反应。由于这些试剂直接结合到CD8细胞表面的T细胞受体上+ T淋巴细胞，荧光染料标记的pMHC-I四聚体可实现对抗原（Ag）特异性CD8的精确检测+ 无需的T细胞 体外 再刺激。此外，当与多色流式细胞术结合使用时，pMHC-I 四聚体染色可揭示抗原特异性 CD8+ T细胞，包括其分化阶段、记忆表型和活化状态。这类分析在HIV免疫学领域尤为有用，其中CD8+ T细胞可影响艾滋病的发展进程。通过实验性感染猕猴免疫缺陷病毒（SIV）建立的猕猴模型，为研究针对艾滋病病毒的细胞免疫提供了不可替代的工具。因此，研究人员已在该动物模型中对T细胞应答进行了深入的定义与特征分析。本文介绍了一种优化的实验方案，利用pMHC-I四聚体染色法对猕猴体内SIV特异性的CD8+ T细胞进行计数。本检测方法可同时实现对两种pMHC-I四聚体阳性CD8+ T细胞的定量分析及其记忆表型鉴定。+ 每次检测的T细胞群体数量，可能有助于追踪SIV特异性的CD8+ 由疫苗接种或SIV感染诱导的T细胞应答。鉴于非人灵长类动物在生物医学研究中的重要性，该方法适用于研究CD8+ 多种疾病环境中的T细胞反应

本方案已用于测定疫苗诱导的、针对Mamu-A1*001+恒河猴中Gag CM9特异性CD8+ T细胞应答的强度及其记忆表型。在该分析中，使用APC标记的Mamu-A1*001/Gag CM9四聚体，结合8色流式细胞术染色方案。图1A–F展示了数据分析所用的设门策略，该策略应适用于每次检测中的两个四聚体。请注意，pMHC-I四聚体阳性CD8+ T细胞群具有良好的分离度，背景信号极低（图1F和图1G）。恒河猴中的记忆性CD8+ T细胞可根据表面标志物CD28和CCR7的表达分为三个亚群：中央记忆性T细胞（TCM；CD28+CCR7+）、过渡记忆性T细胞（TEM1；CD28+CCR7−）和效应记忆性T细胞（TEM2；CD28−CCR7−）35。本方案还包括细胞通透步骤，用于检...

本文介绍了一种优化的实验方案，用于计数和表征恒河猴抗艾滋病病毒的CD8+ T细胞。该文章不仅对HIV免疫学领域具有重要价值，也适用于其他已知CD8+ T细胞反应影响疾病转归的生物医学研究领域。

通过肽-MHC-I 四聚体染色法分析恒河猴中猴免疫缺陷病毒特异性 CD8+ T 细胞

多肽-主要组织相容性复合物I类（pMHC-I）四聚体已成为研究CD8+ T细胞反应的宝贵工具。由于这些试剂……

本实验的总体目标是计数并表征由疫苗接种或初次感染所诱导的猴免疫缺陷病毒特异性 CD8 阳性 T 细胞群体。该方法有助于解答 T 细胞免疫学领域的关键问题，例如疫苗接种或感染所诱导的抗原特异性 CD8 T 细胞的频率是多少。该技术的主要优势在于，可直接对从体内获取的生物样本进行检测，无需体外再刺激，即可定量其中的抗原特异性 CD8 T 细胞。该技术的应用前景包括评估恒河猴中特定切口的 CD8 T 细胞，以及在多种疾病背景下研究 CDB T 细胞反应。通常，初学者由于对恒河猴 MHC 遗传学的知识尚不完善，以及流式细胞染色需要精确的抗体应用，因此在操作该方法时会遇到困难。首先，用 R10 培养基重悬恒河猴 PBMC。加入浓度为每毫升1.6 × 10⁷个细胞。将50 µL细胞分装至相应数量的流式细胞术检测管中，每管加入50 µL蛋白激酶抑制剂。涡旋混匀各管，并将样品在37°C孵育30分钟。必须将适量的滴定肽-MHC 四聚体稀释在足量的总混合液中，以确保所有实验管中的样品均能完成染色。因此，为避免移液误差，建议制备比实际需要量多 15% 的总混合液。在细胞孵育的同时，通过离心沉淀四聚体溶液中的蛋白质聚集体，以尽量减少背景染色。接下来，用足够的染色缓冲液稀释四聚体，使每管流式细胞术样品管中可加入25微升四聚体混合液。然后涡旋混匀样品管，并将PBMC与四聚体的混合液在室温避光孵育45分钟。孵育结束后，向相应的样品管中加入50微升染色混合液。将各管涡旋混匀。室温避光孵育25分钟后，用洗涤缓冲液洗涤细胞，离心收集细胞沉淀，并小心弃去上清液，避免扰动沉淀。用每管中残留的缓冲液重悬细胞，然后每管加入250 µL 2%多聚甲醛固定样本。立即涡旋混匀，并在4摄氏度避光孵育试管。20分钟后，用新鲜洗涤缓冲液洗涤细胞。通过离心收集细胞沉淀，倾去上清液时勿扰动沉淀。将细胞重悬于500微升破膜缓冲液中，涡旋混匀，在室温避光孵育10分钟。然后洗涤并离心收集细胞。随后如前所述弃去上清液。向相应的试管中加入50微升胞内染色主混合液。涡旋混匀各样品，在室温避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，洗涤并离心收集细胞。样本现已准备好用于流式细胞仪检测。Mamu-B017.01 四聚体通常产生较弱的染色信号，但通过蛋白激酶抑制剂对细胞进行预处理，可显著增强染色强度。为避免背景染色，应使用相应的四聚体试剂对MHC I类分子匹配的细胞进行标记，这些细胞可含有或不含有目标抗原特异性CD8阳性T细胞亚群，并需设置多个稀释梯度，以确定能够实现四聚体阳性与阴性CD8阳性T细胞之间最佳分离效果的最适试剂用量。在这些图中，展示了用于分析 Mamu-A*01 阳性恒河猴中疫苗诱导的 Gag CM9 特异性 CD8 阳性 T 细胞反应强度及其记忆表型的设门策略。请注意，四聚体阳性 CD8 阳性 T 细胞群清晰分离，背景染色极低；在四聚体设门内，通过 CD28、CCR7 和颗粒酶 B 的表达可清楚区分各记忆细胞亚群。一旦掌握，若操作得当，该技术可在约三小时内完成。在进行该实验过程中，务必牢记将正确的试剂加入每种抗体或四聚体预混液中，并每次按照演示方式处理实验管。该技术问世后，为免疫学领域的研究人员探索抗原特异性CD8 T细胞的特异性和表型提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分了解如何在恒河猴人 HIV-1 艾滋病研究模型的实验中建立 MHC I 类四聚体染色。请务必注意，处理来自恒河猴的生物样本时需要采取特殊预防措施，例如在样本处理过程中佩戴适当的一次性个人防护装备。

analysis-simian-immunodeficiency-virus-specific-cd8-t-cells-rhesus

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

猴免疫缺陷病毒特异性CD8分析 + T细胞猕猴由肽MHC-I四聚体染色

本实验展示了从全外周血中纯化并体外扩增抗原特异性CD4+ T细胞，以及利用MHC II类四聚体对其进行可视化检测的方法。四聚体技术能够直接可视化具有单一抗原特性和明确MHC...

使用MHC II类四聚体可视化抗原特异性CD4+ T细胞

一种结合原位四聚体染色与原位杂交（ISTH）的技术，能够实现病毒特异性CD8+...

一种可同时原位可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的技术 In situ

我们展示了多色流式细胞术在恒河猴中对CD4+和CD8+...

多色流式细胞术分析恒河猴的细胞免疫应答

本方案描述了使用多肽:MHC 四聚体和磁性微珠分离低频表位特异性T细胞群体，并通过流式细胞术对其进行分析的方法。该方法可实现对内源性特定T细胞群体的直接研究 在体...

基于肽段-MHC四聚体的表位特异性T细胞富集

本视频展示了一种利用肽-主要组织相容性复合物I类（pMHC-I）四聚体来表征特异性针对猴免疫缺陷病毒（SIV）的CD8+记忆T细胞的方法。pMHC-I四聚体是由四个MHC-I分子与SIV特异性肽段结合并偶联荧光染料所形成的复合物。这些四聚体可特异性地结合SIV特异性的CD8+...

一种用于分析SIV特异性CD8+记忆T细胞的肽-MHC-I四聚体染色技术

此处，我们介绍一种结合了 原位 使用MHC四聚体染色结合免疫组织化学技术确定组织中抗原特异性T细胞的定位、表型及数量。该方案用于分析抗原特异性CD8 T细胞在组织中相对于其他细胞类型和结构的空间分布及表型特征。...

原位 MHC-四聚体染色及定量分析以确定组织中抗原特异性CD8 T细胞的位置、丰度和表型

本文描述了一种在单细胞水平上对外周血单个细胞（ex vivo）同时定量96个基因和18种表面蛋白表达水平的方法，可用于鉴定病毒感染细胞与未感染细胞之间差异表达的基因和蛋白。我们应用该方法研究从中国台湾恒河猴中分离的SIV感染的CD4+...

从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4+ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

本文介绍了一种用于体外定性检测抗原特异性CD8+...

通过MHC I类四聚体染色法在病毒载体疫苗接种后同时定量抗载体和抗转基因特异性CD8+ T细胞

我们提供了一种详细的实验方案，通过磁珠法富集T细胞结合肽：主要组织相容性复合体（MHC）四聚体技术，从小鼠肺组织中分离并鉴定稀有的抗原特异性T细胞群体。...

利用肽：主要组织相容性复合体四聚体鉴定小鼠肺中稀有抗原特异性T细胞

铬释放试验是一种检测细胞毒性T细胞活性的常用方法，但存在若干局限性。本文利用抗原特异性的CD8...

通过比较Cr51释放实验与xCELLigence系统确定人HER2/neu特异性CD8 T细胞的最佳细胞毒活性

学习使用肽MHC-I四聚体染色技术定量分析恒河猴外周血单核细胞中的猴免疫缺陷病毒特异性CD8阳性T细胞。该方法无需体外再刺激即可直接检测抗原特异性T细胞频率，为HIV免疫学研究和疫苗开发提供可靠工具。

通过肽-MHC-I 四聚体染色法分析恒河猴中猴免疫缺陷病毒特异性 CD8⁺ T 细胞

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