Name: 结合干湿实验室技术指导大型卷曲螺旋含有蛋白质的结晶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 了解结合干湿实验室技术指导大型卷曲螺旋含有蛋白质结晶的计算与实验整合方法。该方法利用网络工具预测结构域边界，通过表达、纯化和晶体筛选快速识别适合结晶的候选蛋白，提高结构生物学研究效率。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01 GM097204（APV 和 JDH）支持。JHM 的经费由霍华德·休斯医学研究所（HHMI）本科生暑期科研奖学金提供。

注意：概念框架或工作流程的示意图见图1，供参考。该方案可分为四个阶段：基于计算或序列的预测、蛋白质表达与纯化、生化表征以及结晶。所示示例分析了Shroom SD2结构域和/或Shroom-Rock复合物，但该方案可适用于任何蛋白质。
1. 使用成熟的基于网络的工具生成卷曲螺旋结构域边界的计算预测
<ol>
	<li>收集一组具有进化多样性的序列同源物。
	<ol>
		<li>访问 www.uniprot.org，在顶部搜索栏中输入 Shroom。</li>
		<li>通过勾选序列编号旁的复选框来选择要下载的序列。带有星号的序列表示已由 Uniprot 审核，通常更为可靠。请确保所有选中的序列完整且准确。</li>
		<li>点击“下载”按钮保存所选序列。</li>
		<li>使用 Clustal-Omega21（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）对 Shroom 序列集合进行比对。点击“浏览”按钮选择包含 Shroom 序列的文件，然后点击提交。</li>
		<li>比对完成后，点击 &#34;下载比对文件&#34; 按钮。</li>
		<li>使用 Jalview 打开步骤 1.1.5 生成的多序列比对文件（文件 | 输入比对 | 从文件）。在新的比对窗口中，按一致性着色（颜色 | 一致性百分比）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算目标蛋白的二级结构预测、柔性或无序序列区域预测，以及卷曲螺旋区域的预测。
	<ol>
		<li>访问 http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi 以进行卷曲螺旋预测。将序列复制粘贴到序列输入框中，然后点击提交。 
		注意：该分析可能需要数小时才能完成。由于 Shroom 序列较大，可能需要将序列拆分为小于 1,000 个氨基酸的片段，以符合服务器的大小限制。在分析 Shrm2 时，建议使用其 C 末端的 1,000 个氨基酸，因为该区域包含已知含有卷曲螺旋结构的 Shrm SD2 结构域。在对其他蛋白重复此分析时，建议尽可能使用全长蛋白序列；若不可行，则应使用尽可能大的片段，或根据已知的生化或功能数据对序列进行划分。</li>
		<li>访问 http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi 以进行卷曲螺旋预测。将序列复制粘贴到序列输入框中，然后点击提交。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整合步骤 1.1 至 1.2.2 的结果，生成对 Shroom 序列的综合注释。 
	注意：强烈建议在此阶段同时纳入从文献或其他来源获得的有关蛋白功能或纯化的所有相关信息。</li>
	<li>基于该综合注释序列，预测蛋白的结构域边界（或一系列可能的边界），在尽量减少无序或柔性序列长度的同时，最大化序列保守性和预测的结构特征。若已知相关信息，所获得的蛋白应保留其感兴趣的生物学功能特性。</li>
</ol>
2. 表达并纯化第1节中确定的结构域边界蛋白
注意：本节的目的是利用一系列快速且易于量化的检测方法，对第1节中生成的假定结构域边界进行筛选。
<ol>
	<li>使用标准的分子生物学技术，构建一个表达质粒，将目标编码序列以正确的阅读框插入 His10-mRuby2-XH2 质粒中（载体图谱及更多细节见图3）。</li>
	<li>在自诱导培养基中，于室温下使用 BL21(DE3) E. coli 或其他合适的表达菌株培养 18–24 小时，检测各表达质粒的表达水平1。
	<ol>
		<li>按照细胞附带的说明或采用可靠的转化方案（例如此处提供的方案：https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial-transformation/），将表达质粒及空质粒对照分别转化至 BL21(DE3) 菌株中。</li>
		<li>从新鲜转化的平板上挑取单克隆，于含 34 µg/ml 卡那霉素的 LB 培养基中，37 °C 过夜培养 5 ml 起始培养物。</li>
		<li>次日，离心收集菌体，并用新鲜 LB 培养基洗涤沉淀。</li>
		<li>将起始培养物接种至 50 ml 含 34 µg/ml 卡那霉素的自诱导培养基中，在室温或 37 °C 下培养至饱和状态，通常培养约 18–24 小时。</li>
		<li>离心收集细胞，并将所得细胞沉淀长期保存于 -80 °C，以备后续纯化使用。</li>
		<li>通过 SDS-PAGE 比较各表达菌株与空载体对照的全细胞裂解液，确定最高效表达目标融合蛋白的菌株。对于 His10-mRuby2-Shroom SD2 融合蛋白，使用 10% SDS-PAGE 凝胶，在 180 V 条件下电泳约 50 分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部22。</li>
		<li>使用考马斯亮蓝染色凝胶，以观察各菌株中的总细胞蛋白23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对成功表达 mRuby2-融合蛋白的各菌株进行初步的亲和层析纯化。通常在室温下进行步骤 2.3.2–2.3.7 的纯化操作，除非目标蛋白在特定条件下（如 4 °C）纯化效果更佳。
	<ol>
		<li>解冻步骤 2.2.5 中获得的细胞沉淀。</li>
		<li>将每份细胞沉淀重悬于 1.5 ml 裂解缓冲液（10% 甘油、500 mM NaCl、40 mM 咪唑、20 mM Tris pH 8.0、1 mM β-巯基乙醇）中。根据需要在裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>加入 30 µl 浓度为 10 mg/ml 的溶菌酶，室温孵育 20 分钟。随后按照所用仪器的说明进行超声破碎。</li>
		<li>转移至 1.5 ml 离心管中，在台式离心机中以 14,000 × g 离心 30 分钟，以沉淀不溶性物质或未裂解的细胞。分别保留上清液和沉淀，用于后续 SDS-PAGE 分析。</li>
		<li>进行镍亲和层析纯化，将可溶性组分与 100 µl Ni-NTA 琼脂糖微珠孵育。将微珠与可溶性裂解液轻轻颠倒混匀 5–10 分钟，以充分结合。</li>
		<li>在台式离心机中以 800 × g 离心 30 秒，沉淀微珠。随后用裂解缓冲液洗涤沉淀 3–5 次，以去除非特异性杂质。</li>
		<li>使用添加了 1 M 咪唑的裂解缓冲液洗脱 Ruby 融合蛋白。</li>
		<li>通过 SDS-PAGE 比较 His-mRuby2-Shroom 蛋白在上述&#34;快速粗略&#34;纯化过程中的行为。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 表征蛋白质样品以鉴定具有有利特性的样品
<ol>
	<li>使用在 280 nm 处设定的分光光度计测量 Ruby 融合蛋白的浓度，然后将 1–5 µg 融合蛋白上样至非变性 PAGE 凝胶24，以评估样品的均一性。在 4 °C 条件下，以 175 V 电压运行 10% 非变性 PAGE 凝胶 140 分钟。
	<ol>
		<li>使用配备荧光成像功能的成像仪对非变性 PAGE 进行成像，观察 mRuby 标签融合蛋白在此检测中的迁移位置。 
		注意：需仔细观察是否有融合蛋白滞留在加样孔中，此类蛋白可能已发生聚集。若无荧光成像仪，通常可在紫外灯或 UV 成像仪下观察并成像高浓度的 Ruby 标签蛋白样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行有限蛋白酶解以鉴定稳定折叠的结构域。将 95 µl 浓度约为 1 mg/ml 的 Ruby-Shrm SD2 融合蛋白与 5 µl 0.025% 的枯草杆菌蛋白酶 A（Subtilisin A）共同孵育。
	<ol>
		<li>在 0、0.5、2、5、15、60 和 120 分钟的时间点取样，每次从反应体系中取出 10 µl，通过 15% 丙烯酰胺凝胶的 SDS-PAGE 分析反应进程。</li>
		<li>按照步骤 2.2.7 的方法用考马斯亮蓝染色，并判断是否可识别出抗蛋白酶降解的蛋白条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整合纯化效率、非变性 PAGE 中的行为以及部分纯化的 mRuby2-Shroom 融合蛋白的有限蛋白酶解实验数据，对这些蛋白在溶液中的整体行为进行综合评估。
	<ol>
		<li>（可选）若具备合适的功能检测方法，可在此阶段检测其活性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从Shroom蛋白中制备高质量的卷曲螺旋SD2结构域晶体
注意：除非蛋白质在不同温度下纯化效果更佳（通常为 4 °C），否则第 4.1 节中的所有步骤均在室温下进行。
<ol>
	<li>以50 ml小规模表达作为表达与纯化潜力的粗略估计，进行mRuby2-Shroom SD2的大规模表达，目标是获得5-20 mg完全纯化的样品。通常2 L培养物可提供足够的起始材料。通过在8,000 × g下离心10分钟收集细胞沉淀。
	<ol>
		<li>如前所述，用裂解缓冲液重悬2 L培养所得的细胞沉淀；若使用溶菌酶进行裂解，则每克冷冻细胞沉淀使用约2 ml裂解缓冲液。若使用匀浆器或法国压滤器，则每克沉淀重悬于约8 ml缓冲液中。通过在30,000 × g下离心30分钟去除细胞碎片。</li>
		<li>使用10 ml Ni-NTA树脂对4.1.1步骤所得可溶性组分进行批量结合。将混合物倒入合适的重力柱中，使未结合蛋白自然流穿。</li>
		<li>用40 ml裂解缓冲液洗涤树脂3-5次，随后用添加了1 M NaCl的裂解缓冲液洗涤一次。</li>
		<li>用添加了80 mM咪唑的40 ml裂解缓冲液洗涤树脂。</li>
		<li>用添加了1 M咪唑的40 ml裂解缓冲液洗脱Ruby-Shroom融合蛋白。手动将洗脱蛋白分部收集为4-10 ml的组分。</li>
		<li>通过10% SDS-PAGE确认含有Ruby-Shroom融合蛋白的组分。</li>
		<li>将合适组分（通常为第2-4组分）使用分子量截留值为6-8 kDa的透析袋透析至含8%甘油、250 mM NaCl、15 mM咪唑、20 mM Tris（pH 8.0）、1 mM β-巯基乙醇的缓冲液中。每25-50 mg融合蛋白加入1 mg TEV蛋白酶。室温下缓慢搅拌透析过夜。</li>
		<li>重复镍亲和纯化步骤4.1.2至4.1.6。此时Shroom SD2结构域应存在于未结合组分中，而His10-mRuby2则仍结合于树脂，并出现在洗脱组分中。使用考马斯亮蓝染色的12% SDS-PAGE验证该结果。</li>
		<li>将含有Shroom SD2结构域的组分透析至含8%甘油、100 mM NaCl、20 mM Tris（pH 8.0）、5 mM β-巯基乙醇的缓冲液中，透析过夜。</li>
		<li>使用FPLC进行阴离子交换层析25，并采用0.1-1.0 M NaCl的梯度进行洗脱。通过12% SDS-PAGE分析各组分。</li>
		<li>使用超滤离心浓缩管（根据目标蛋白选择10 kDa或更高分子量截留值），将主峰组分浓缩至约0 mg/ml，随后进行凝胶过滤层析26，并通过12% SDS-PAGE分析主峰组分。</li>
		<li>合并主峰组分，并透析至含20 mM Tris（pH 8.0）、50 mM NaCl、2%甘油、1 mM β-巯基乙醇的缓冲液中，在结晶前浓缩至10 mg/ml。 
		可选：在此浓缩过程中，分别在1、2、5和10 mg/ml浓度下各取5 µl样品。进行天然PAGE电泳，每样上样2-5 µl，以观察样品在此过程中的行为。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选一组包含12种条件的小型实验，以确定用于结晶试验的最佳蛋白浓度。这些条件的组成见图7。
	<ol>
		<li>使用24孔坐滴结晶板，采用气相扩散法进行结晶试验：将12种条件各自500 µl加入不同的孔中，然后在盖玻片上设置液滴，初始每滴含1 µl储液和1 µl蛋白样品。有关该技术的更多细节请参见27。</li>
		<li>迅速用透明胶带密封结晶板，并将其转移至无振动且温度可控的环境中。温度可变，但4 °C、16 °C和20 °C较为常用。</li>
		<li>在接下来的3天内，使用显微镜（最高100倍放大）观察各液滴。在3天结束时，对每个液滴评分：无沉淀（澄清）、轻度沉淀、重度沉淀（棕色）或晶体。合适的蛋白浓度下，重度沉淀的液滴不应超过6个。</li>
		<li>根据步骤4.2确定的蛋白浓度，广泛筛选市售的多种商业化结晶筛选试剂盒。使用液体处理仪或结晶机器人可显著加快该过程，同时减少液滴操作误差。该方法所需蛋白量更少，使用户可用单一样品测试更多条件。</li>
		<li>利用先前使用的24孔筛选板，通过系统性地调整结晶液滴中的各个变量，优化从广谱筛选中获得的初步条件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案旨在帮助用户确定大型卷曲螺旋蛋白中的结构域边界，以促进其结晶。该方案通过综合整合来自计算预测及其他来源的多种数据，提出一系列可能的结构域边界。随后进行一系列快速且低成本的生化实验，以进一步优化这些初步假设。采用此方法，用户可快速排除不理想的蛋白片段，集中精力研究更优候选对象，从而提高获得晶体的可能性。
该技术包含多个重要步骤，但对晶体生成最为关键的是初始假设性结构域边界的确定。此步骤结合了多种计算方法，以及可从文献或功能数据中获得的信息。应注意避免立即采用单一策略直接缩小到唯一方案 &#34;最佳&#34; 目前尚无方法为任何预测结果赋予可量化的置信度值，因此该方法不宜作为确定性解决方案。相反，它最适合用于快速识别出一组可能的结构域边界，这些边界需通过实验进一步验证。
利用本方案可分析的卷曲螺旋蛋白特性范围较广。从计算角度来看，卷曲螺旋预测在少于20个氨基酸的序列上准确性有限；如步骤1.2.1所述，超过1,000个氨基酸的卷曲螺旋区域需拆分为多个片段，方可由DISOPRED进行分析。我们认为后一限制是暂时性的，因其...

通过X射线晶体学进行结构测定对现代生物学的各个领域都做出了根本性贡献；它提供了生命所依赖的大分子及其在多种环境下的相互作用的原子级视图；使我们能够理解致病机制，并为合理设计治疗疾病的药物提供了可能。长期以来，晶体学一直是测定大分子结构的主要实验技术，目前占结构数据库的89.3%（www.rcsb.org）。该技术具有诸多优势，包括实现极高分辨率的潜力、能够可视化大小范围广泛的大分子、相对容易的数据收集过程，以及能够观察大分子与溶剂及配体相互作用的能力。
尽管重组蛋白表达技术已取得诸多进步1,2，纯化3以及用于构建这些系统的分子生物学技术4，晶体学过程中最大的障碍仍然是获得可用于衍射的高质量晶体. 对于含有大型卷曲螺旋结构域的蛋白质而言，这一点尤为明显。据估计，所有氨基酸中多达5%存在于卷曲螺旋结构中。5,6，这使其成为一种非常常见的结构特征7，然而这些蛋白质通常比球状蛋白质更难纯化和结晶8-10此外，由于卷曲螺旋结构域通常存在于较大蛋白质的序列背景中，因此准确预测这些结构域的边界至关重要，以避免引入无序或柔性序列，而这类序列通常不利于结晶。
本文提出一个概念性框架，将基于网络的计算分析与实验台获得的实验数据相结合，以帮助用户指导晶体学研究初始阶段的工作，包括：如何选择用于结构研究的蛋白质片段，以及在尝试结晶前如何制备和表征蛋白质样品。我们的分析聚焦于两种含有大型卷曲螺旋结构域的蛋白质——Shroom（Shrm）和 Rho- kinase（Rock）。选择这两种蛋白质是因为它们均含有卷曲螺旋结构域，并且已知能够形成具有生物学意义的复合物11-16。据预测，Shroom 和 Rho-kinase（Rock）分别含有约 200 和 680 个残基的卷曲螺旋区域，其中许多部分已有结构表征17-20。本文所述方法提供了一种简化的流程，可快速识别出适合结晶的含卷曲螺旋结构域的蛋白质片段；然而，所描述的技术也可轻松适用于大多数蛋白质或蛋白质复合物，或根据需要修改以整合高通量策略。最后，这些方法通常成本较低，且几乎所有经验水平的用户均可操作。

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) Rosetta</td><td>Emd Millipore</td><td>70954-3</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Codon Plus</td><td>Agilent Technologies</td><td>230245</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>L3008-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 树脂</td><td>Life Technologies</td><td>25216</td><td></td></tr><tr><td>枯草杆菌蛋白酶A</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td>24孔Cryschem板</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &amp;nbsp;96:</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>Overnight Express Autoinduction System 1</td><td>Emd Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基粉末</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12795027&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

结合湿实验与干实验技术指导含大型卷曲螺旋结构蛋白的结晶

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

对于任何蛋白质而言，获得用于结构测定的晶体都可能是一项困难且耗时的工作。卷曲螺旋蛋白及其结构域在自然界中广泛存在，但由于其物理特性及易于聚集的倾向，传统上被认为尤其难以结晶。在此，我们采用一系列快速而简便的技术，旨在确定给定卷曲螺旋蛋白的一系列可能的结构域边界，并迅速表征这些蛋白在溶液中的行为。通过添加强荧光标签（mRuby2），蛋白质的表征变得简单直接。目标蛋白在普通光照条件下即可清晰可见，并可利用适当的成像设备进行定量分析。该方法的目标是快速筛选出那些不太可能成功结晶的候选蛋白，从而将其从结晶流程中剔除，为最有希望的候选蛋白节省更多时间，并减少在无法形成晶体的蛋白上所耗费的资金。该流程可反复迭代，整合初始筛选过程中获得的信息，可适应高通量表达与纯化流程，并可通过机器人结晶筛选系统进一步增强效率。

该系统所采用的工作流程示意图如图1所示，包含三个主要阶段。首先通过序列的计算分析，对目标卷曲螺旋蛋白的结构域边界提出假设。例如，图2展示了对Shrm2 SD2结构域进行注释分析的一个实例。在该图中，目标是鉴定细胞骨架调控因子Shroom的C末端一个保守结构域（称为SD2）可能的结构域边界。通过此分析，生成了三组不同的假定边界，分别包含跨越整个保守SD2区域的卷曲螺旋片段，或靠近C末端的最小片段，其中后者最终成为最适合结晶的候选片段。由序列分析鉴定出的候选片段随后通过与mRuby2融合的蛋白进行小规模快速验证（图3），以实现高效分析。两个带有His10-mRuby2标签的蛋白在小规模（50 ml培养物）表达纯化中的代表性结果如图4所示。在该图中，不溶性蛋白的行为与其可溶性对应物相比显而易见。通过这种方法可快速、简便地识别表达量低或不溶性的蛋白融合体。使用上述Ruby系统或分离纯化的Shroom SD2结构域，对多种蛋白...

我们描述了一个结合了简单生化分析与计算分析的框架，用于指导大型卷曲螺旋结构域的表征与结晶。该框架可针对球状蛋白进行调整，或进一步拓展以整合多种高通量技术。

获得用于结构测定的晶体对于任何蛋白质而言都可能是一项困难且耗时的工作。卷曲螺旋蛋白及其结构域也是如此。

本实验的总体目标是快速鉴定并验证大分子卷曲螺旋蛋白中可能的结构域边界，以提高获得可结晶内在片段的可能性。该方法可帮助研究人员简化大分子卷曲螺旋蛋白的结晶过程，而这类蛋白通常极难结晶。该技术的优势在于结合了实验与计算方法，能够快速识别并筛选出适合结晶的候选片段，从而提高实验成功率。为演示该技术，将由我实验室的研究生 Jenna Zalewski 和本科研究员 Keith O'Conor 进行操作。首先，结合现有基于网络的工具的输出结果，按照文本方案中所述方法，预测可能的卷曲螺旋结构域边界。在构建表达质粒并按照文本详细步骤检测其表达水平后，开始对成功表达 Ruby 标签蛋白的每种菌株进行纯化。为了裂解细胞，首先将每个解冻的细胞沉淀重悬于1.5毫升含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。加入30微升浓度为10毫克/毫升的溶菌酶，在室温下孵育20分钟，然后按照所用仪器的说明进行超声处理。将样品在台式离心机中以14,000 × g离心30分钟，以沉淀不溶性物质或未裂解的细胞。将上清液和沉淀物均保存下来，用于后续的SDS-PAGE分析。进行镍亲和纯化时，首先将100 µL镍NTA凝胶珠（预先用裂解缓冲液洗涤过）与可溶性裂解液在5至10分钟内孵育。反复倒置悬浮液数次以混匀凝胶珠。在台式离心机中以800 × g离心样品30秒，使磁珠沉淀。随后用裂解缓冲液洗涤沉淀3至5次，以去除非特异性污染物。最后，使用含有1摩尔咪唑的裂解缓冲液从磁珠中洗脱Ruby融合蛋白。使用分光光度计在280纳米波长下测定Ruby融合蛋白的浓度，然后取1至5微克融合蛋白上样到非变性PAGE凝胶中，以评估样品的均一性。在4摄氏度条件下，以175伏电压运行10%非变性PAGE凝胶140分钟。使用配备荧光检测功能的成像仪对非变性PAGE凝胶进行成像，观察本实验中Ruby标记的融合蛋白的迁移位置。通过有限蛋白酶解鉴定稳定折叠的结构域：首先将95微升Ruby-Shroom SD2融合蛋白与5微升0.025的枯草杆菌蛋白酶A（Subtilisin A）混合孵育。在0、0.5、2、5、15、60和120分钟的时间点取样，每次从反应体系中取出10微升样品，使用15%丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE检测反应进程。用考马斯亮蓝染色凝胶，以判断是否存在抗蛋白酶降解的蛋白条带。综合纯化效率、天然PAGE中的迁移行为以及部分纯化的mRuby2-Shroom融合蛋白的有限蛋白酶解结果，对这些蛋白在溶液中的整体行为进行系统性评估。通过两升规模的mRuby2-Shroom SD2培养物进行大规模表达，目标是获得5至20毫克完全纯化的样品。细胞生长完成后，以8,000 × g离心10分钟收集细胞沉淀。所得细胞沉淀可在-80 °C下保存，直至后续使用。接下来，每克冷冻细胞沉淀物中加入约八毫升裂解缓冲液重悬沉淀。使用匀浆器裂解重悬的细胞。细胞裂解后，通过离心（30,000 ×g，30 分钟）沉淀细胞碎片。接下来，使用10毫升预先洗涤的镍-NTA树脂对可溶性组分进行批量结合。将珠子悬浮液倒入合适的重力柱中，让未结合的蛋白质流穿，然后用40毫升裂解缓冲液洗涤树脂3至5次，接着用添加了1摩尔氯化钠的裂解缓冲液进行洗涤。最后，用40毫升含有80毫摩尔咪唑的裂解缓冲液对树脂进行终末洗涤。用含有1摩尔咪唑的40毫升裂解缓冲液洗脱Ruby-Shroom融合蛋白。将洗脱的蛋白手动分馏为4至10个10毫升的组分。使用10% SDS-PAGE凝胶确认含有Ruby-Shroom融合蛋白的组分。每25至50毫克融合蛋白加入一毫克TEV蛋白酶，以去除Ruby标签。接下来，使用截留分子量为6至8千道尔顿的透析管，将相应组分透析至TEV切割缓冲液中。在室温下缓慢搅拌，透析过夜。透析后，重复镍亲和纯化步骤。Shroom-SD2 结构域应流穿进入未结合组分，而 Ruby 标签仍结合在树脂上。使用离心浓缩器将洗脱峰组分浓缩至约 10 毫克/毫升，随后进行凝胶过滤层析，并通过 12% SDS-PAGE 凝胶分析洗脱峰组分。合并洗脱峰组分后，将溶液透析至结晶缓冲液中，然后在结晶前将透析后的蛋白质浓缩至10毫克每毫升。使用24孔坐滴结晶板，通过筛选少量12种条件的组合，确定结晶实验的最佳蛋白质浓度。采用蒸汽扩散法进行结晶实验。首先，将12种条件下的每种溶液各500微升分别移液至不同的孔中。在每个基座上，制备包含一微升孔溶液和一微升蛋白质样品的液滴。迅速用透明胶带密封板，然后将板转移至无振动且温度可控的适宜环境中。在接下来的三天内，使用显微镜以最高100倍的放大倍数观察各孔板中的液滴。在三天期满后，对每个液滴进行评分，判断其是否无沉淀、轻度沉淀、重度沉淀或晶体形成。合适的蛋白质浓度条件下，重沉淀的数量不应超过六个。根据测定的蛋白浓度，筛选一系列市售的结晶筛选试剂盒。使用液体处理仪或结晶机器人可显著加快该过程，同时减少液滴操作中的误差。该方法所需蛋白量更少，使用户能够利用同一样品筛选更多条件。通过使用24孔筛板系统地改变结晶液滴中的每个变量，优化从广谱筛选中确定的初始条件，方法与之前相同。有限蛋白水解用于鉴定蛋白中可能具有柔性或更易被蛋白酶接近的区域。图中显示了一个对蛋白水解敏感的SD2结构域的降解模式，以及另一个非常稳定的结构域的降解模式。在Ruby融合蛋白的背景下进行了有限蛋白水解。在此情况下，正如预期，Ruby与SD2结构域之间的连接序列被迅速切割，但产生的Ruby和SD2片段仍保持高度稳定。通过非变性PAGE分析可快速鉴定出适合结晶的候选样品。在非变性PAGE凝胶上运行了四种含有不同蛋白片段的Shroom-Rock复合物。其中包含Rock 834至913的复合物表现最佳，易于结晶；而其他复合物仅在发生降解时才能结晶，或完全无法结晶。观看本视频后，您应能充分理解如何为您的大型卷曲螺旋蛋白设计一系列潜在的结构域边界，并如何利用Ruby系统快速高效地筛选出最适合结晶的候选蛋白。尽管晶体学仍然是一项耗时的工作，但使用该技术可以通过简单的检测方法筛选出适合结晶的蛋白质，排除表现不佳的候选蛋白，从而让您将更多时间集中在成功几率更高的候选蛋白上。在尝试该实验流程时，重要的是要记住，在选择可能的结构域边界时，应尽可能包含充分的信息。在应用此方法时，针对不同蛋白质所选择的信息可能会有所不同。如果可能，应进行其他方法检测，例如基于细胞的检测或生化分析，以确保所研究的蛋白质片段仍保留目标生物学功能。尽管本方法主要针对卷曲螺旋蛋白，但其整体框架可轻松适用于几乎任何蛋白质。请注意，使用某些仪器和生物试剂可能存在危险，在进行本实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套或使用护目镜。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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膜蛋白在脂质介相中的结晶

双亲分子小片（bicelles）是由脂质/两亲分子组成的混合物，可在脂质双层环境中维持膜蛋白（MPs）的稳定性，同时具有独特的相行为，便于通过结晶机器人进行高通量筛选。该技术已成功解析了多种原核和真核来源的高分辨率结构。本视频介绍了制备脂质双亲分子小片混合物、将膜蛋白嵌入该混合物、设置结晶实验（包括手动和机器人操作）以及从培养基中收获晶体的实验方案。...

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