结合干湿实验室技术指导大型卷曲螺旋含有蛋白质的结晶
2017年1月6日
我们描述了一个框架，该框架结合了简单的生化和计算分析，以指导大型卷曲螺旋结构域的表征和结晶。该框架可适用于球状蛋白质，也可扩展为包含各种高通量技术。
该程序的总体目标是快速识别和测试大卷曲螺旋蛋白中可能的结构域边界，以提高找到将结晶的内在片段的可能性。这种方法可以帮助研究人员简化大卷曲螺旋蛋白的结晶过程，众所周知，这种蛋白质很难结晶。这种技术的优势在于它集成了实验和计算方法，可以快速识别和筛选可能的结晶候选者，从而提高他们成功的机会。
演示这项技术的将是我实验室的研究生 Jenna Zalewski 和我实验室的本科生研究员 Keith O'Conor。首先，结合已建立的基于 Web 的工具的输出，以生成可能的卷曲线圈域边界的预测，如文本协议中所述。生成表达质粒并测试其表达水平（如文中所述）后，开始纯化成功表达 Ruby 标记蛋白的每个菌株。
要裂解细胞，首先将每个解冻的细胞沉淀重悬于 1.5 mL 补充有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。加入 30 μL 溶菌酶，浓度为 10 mg/mL，在室温下孵育 20 分钟，然后按照所用仪器的说明进行超声处理。在台式离心机中以 14， 000 倍 G 离心样品 30 分钟，以沉淀不溶性物质或未裂解的细胞。
保存上清液和沉淀，以便通过 SDS-PAGE 进行后续分析。要进行镍亲和纯化，首先孵育 100 μL 镍 NTA 珠子，在裂解缓冲液中与可溶性裂解物预洗 5 至 10 分钟。将悬浮液倒置数次以混合珠子。
在台式离心机中以 800 倍 G 离心样品 30 秒，以沉淀珠子。然后用裂解缓冲液洗涤沉淀 3 到 5 次，以清除非特异性污染物。最后，用裂解缓冲液从珠子中洗脱 Ruby 融合蛋白，并补充有 1 摩尔咪唑。
使用设置为 280 纳米的分光光度计测量 Ruby 融合蛋白的浓度，然后通过将 1 至 5 μg 融合蛋白上样到天然 PAGE 凝胶上来评估样品的均匀性。在 4 摄氏度下以 175 伏电压运行 10% 天然 PAGE 凝胶 140 分钟。使用配备有荧光可视化的成像仪对天然 PAGE 进行成像，观察 Ruby 标记的融合在该测定中的迁移位置。
首先将 95 微升 Ruby-Shroom SD2 融合液与 5 微升 0.025 枯草杆菌蛋白酶 A.在零、0.5、2、5、15、60 和 120 分钟的时间点对反应进行采样，每个时间点从反应中去除 10 微升，并使用 15% 丙烯酰胺凝胶通过 SDS-PAGE 可视化反应进程。用考马斯蓝对凝胶进行染色，以评估是否可以鉴定出蛋白酶抗性物种。将来自纯化效率、天然 PAGE 中的行为和部分纯化的 mRuby2-Shroom 融合蛋白的有限蛋白水解的数据整合到这些蛋白质在溶液中的整体行为的综合评估中。
使用 2 升 mRuby2-Shroom SD2 培养物进行大规模表达，目标是获得 5 至 20 毫克的完全纯化样品。细胞生长后，以 8， 000 x G 离心 10 分钟，使细胞沉淀。所得细胞沉淀可以储存在零下 80 摄氏度，直到需要。
接下来，将沉淀重悬于每克冷冻细胞沉淀中约 8 mL 的裂解缓冲液中。使用均质器裂解重悬细胞。细胞裂解后，通过 30， 000 倍 G 离心 30 分钟沉淀细胞碎片。
接下来，使用 10 毫升预洗镍 NTA 树脂批量结合可溶性组分。将微珠悬浮液倒入适当的重力柱中，让未结合的蛋白质流出，然后用 40 mL 裂解缓冲液洗涤树脂 3 到 5 次，然后用补充有 1 摩尔氯化钠的裂解缓冲液洗涤。用 40 mL 裂解缓冲液补充有 80 毫摩尔咪唑对树脂进行最终洗涤。
用 40 毫升含有 1 磨牙咪唑的裂解缓冲液洗脱 Ruby-Shroom 融合蛋白。手动将洗脱的蛋白质分成 4 至 10 mL 馏分。使用 10% SDS-PAGE 凝胶确认含有 Ruby-Shroom 融合蛋白的级分。
每 25 至 50 毫克融合蛋白添加 1 毫克 TEV 蛋白酶，以去除 Ruby 标签。接下来，使用 6 至 8 道尔顿截留分子量透析管将适当的馏分透析到 TEV 裂解缓冲液中。在室温下缓慢搅拌，将蛋白质透析过夜。
透析后，重复镍亲和纯化步骤。Shroom-SD2 结构域应流入未结合的部分，而 Ruby 标签仍与填料结合。使用离心浓缩器，将峰馏分浓缩至约 10 毫克/毫升，然后通过 12%SDS-PAGE 凝胶进行体积排阻色谱分析峰馏分。
合并峰馏分后，将溶液透析到结晶缓冲液中，然后在结晶前将透析的蛋白质浓缩至 10 毫克/毫升。使用 24 个孔坐式滴结晶盘筛选 12 种条件的小阵列，以确定结晶试验的最佳蛋白质浓度。使用蒸汽扩散法进行结晶试验。
首先，将 12 种条件中的每一种 500 微升移液到单独的孔中。在每个基座上，制备含有 1 微升孔溶液和 1 微升蛋白质样品的液滴。用透明胶带快速密封托盘，然后将托盘移动到合适的温度控制环境中，且无振动。
在接下来的三天内，使用放大倍率高达 100 倍的显微镜检查托盘中的液滴。在三天期限结束时，将每滴水评分为不含降水、轻度降水、重降水和晶体。合适的蛋白质浓度应包含不超过 6 次重沉淀。
使用测定的蛋白质浓度，筛选各种市售的结晶筛选。使用液体处理或结晶机器人大大加快了这一过程，同时也最大限度地减少了液滴中的误差。它需要的蛋白质要少得多，允许用户用单个样品筛选更多的病症。
像以前一样，使用 24 孔筛盘系统地改变结晶液滴中的每个变量，从而改善从宽筛网中识别出的初始条件。有限蛋白水解用于鉴定蛋白质中可能具有柔韧性或更容易被蛋白酶利用的区域。这里显示的是一个蛋白水解敏感的 SD2 结构域的降解模式，另一个是相当稳定的
。在 Ruby 融合蛋白的背景下进行有限的蛋白水解。在这种情况下，正如预期的那样，Ruby 和 SD2 结构域之间的接头序列被迅速切割，但得到的 Ruby 和 SD2 片段基本保持稳定。通过非变性 PAGE 进行分析可以快速揭示结晶的良好候选者。
在天然 PAGE 凝胶上运行具有不同蛋白质电池的四种 Shroom-Rock 复合物。含有 Rock 834 至 913 的复合物具有最佳行为且容易结晶，而其他复合物仅在降解时结晶或未能完全结晶。观看此视频后，您应该对如何为大卷曲螺旋蛋白开发一组潜在的结构域边界，以及如何使用 Ruby 系统快速识别最佳结晶候选物有很好的了解。
虽然晶体学仍然是一项耗时的工作，但使用这种技术将专注于寻找将使用直接分析结晶的蛋白质，以去除较差的候选物，从而让您将更多时间花在成功前景更好的候选物上。在尝试此过程时，请务必记住在选择可能的域边界时包含尽可能多的信息。您在使用该程序时选择的信息因每种蛋白质而异。
如果可能，应执行其他方法，如基于细胞的测定或生化测定，以确保所讨论的蛋白质片段仍然包含生物学意义的功能。虽然这种方法专注于卷曲螺旋蛋白，但整个框架可以很容易地适用于几乎任何蛋白质。不要忘记，使用某些仪器和生物试剂可能很危险，因此在执行此程序时应始终遵循预防措施，例如使用手套或佩戴防护眼镜。
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概述
本文介绍了一种结合生物化学和计算分析的框架，用于增强大型螺旋卷曲结构域的表征和结晶。该方法旨在简化这些具有挑战性的蛋白质的结晶过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 结构生物学
- 蛋白质结晶
背景
- 大型螺旋卷曲蛋白质难以结晶。
- 确定结构域边界对于成功结晶至关重要。
- 结合实验和计算方法可以提高成功率。
- 该框架可以适用于各种蛋白质类型。
研究目的
- 快速识别螺旋卷曲蛋白质中潜在的结构域边界。
- 提高内在蛋白质片段结晶的可能性。
- 整合实验和计算技术以获得更好的结果。
所用方法
- 利用基于网络的工具预测螺旋卷曲结构域边界。
- 生成表达质粒以测试蛋白质表达水平。
- 纯化成功表达的蛋白质用于结晶试验。
- 实验室研究人员展示该技术。
主要结果
- 该框架有效地识别出结晶的有前途的候选者。
- 方法的整合提高了结晶过程的效率。
- 研究生和本科生研究人员成功展示了该技术。
- 有可能适应螺旋卷曲之外的其他蛋白质类型。
结论
- 所提出的框架显著地帮助了大型螺旋卷曲蛋白质的结晶。
- 将计算预测与实验验证相结合可提高成功率。
- 这种方法可以成为结构生物学研究人员的有价值工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Crystallizing large coiled-coil proteins remains a significant bottleneck in structural biology and target validation, often consuming substantial resources with low success rates. This integrated wet and dry lab approach enables rapid identification of crystallizable protein fragments, reducing wasted effort on non-viable candidates. By improving hit rates in early-stage structural screening, the method supports more efficient lead identification and de-risks downstream structural and functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of domain boundaries to isolate stably folded fragments for structural characterization.
- Operational Value: Uses fluorescent tagging (mRuby2) for rapid visualization and quantification under standard imaging conditions.
- Strategic Value: Filters out aggregation-prone or unstable constructs early, focusing resources on high-potential targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Combines computational domain prediction with empirical validation via native PAGE and limited proteolysis.
- Operational Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts for protein concentration and homogeneity assessment.
- Strategic Value: Creates a reusable screening cascade adaptable to high-throughput expression and robotic crystallization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms structural integrity of purified domains through protease resistance and native gel mobility.
- Operational Value: Enables iterative refinement using data from initial screening to improve construct design.
- Strategic Value: Increases confidence in selecting fragments that retain functional relevance for downstream assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking computational target selection to empirical validation and structural screening, thereby informing go/no-go decisions before significant investment in crystallization campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of domain boundaries through combined bioinformatics and experimental validation.
- Screening: Delivers assay-ready, fluorescently tagged protein samples with quantified concentration and homogeneity metrics.
- Analytics: Provides native PAGE and proteolysis data to assess structural stability and domain integrity.
- Translational Research: Ensures selected fragments maintain structural fidelity, supporting continuity into functional and structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, adaptable framework applicable across diverse protein targets beyond coiled-coils.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target suitability by reducing mechanistic ambiguity in protein behavior.
- Operational Value: Increases reproducibility through standardized lysis, purification, and quantification steps.
- Strategic Value: Reduces time and reagent expenditure on low-probability constructs, improving capital efficiency in structural projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on empirical crystallizability metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein purification, and fluorescence-based detection.
- Dependent on access to spectrophotometry, native and SDS-PAGE systems, and fluorescence imaging equipment.
- Necessitates cross-team alignment on construct design, tagging strategies, and data interpretation between computational and experimental groups.
- Adaptation to non-fluorescent or non-tagged systems may require alternative detection methods.
- Success depends on accurate domain boundary prediction and careful interpretation of proteolysis and gel shift data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
Express and Purify Proteins with Identified Domain Boundaries
2:38
Characterize Protein Sample to Identify Those with Advantageous Properties
4:16
Producing High Quality Crystals of the Coiled-coil SD2 Domain from Shroom
8:43
Results: Evaluation of Expression, Purification, Characterization, and Crystallization of Candidate Coiled-coil Proteins
9:49
Conclusion
