结合湿实验与干实验技术指导含大型卷曲螺旋结构蛋白的结晶

本实验的总体目标是快速鉴定并验证大分子卷曲螺旋蛋白中可能的结构域边界，以提高获得可结晶内在片段的可能性。该方法可帮助研究人员简化大分子卷曲螺旋蛋白的结晶过程，而这类蛋白通常极难结晶。该技术的优势在于结合了实验与计算方法，能够快速识别并筛选出适合结晶的候选片段，从而提高实验成功率。

为演示该技术，将由我实验室的研究生 Jenna Zalewski 和本科研究员 Keith O'Conor 进行操作。首先，结合现有基于网络的工具的输出结果，按照文本方案中所述方法，预测可能的卷曲螺旋结构域边界。在构建表达质粒并按照文本详细步骤检测其表达水平后，开始对成功表达 Ruby 标签蛋白的每种菌株进行纯化。

为了裂解细胞，首先将每个解冻的细胞沉淀重悬于1.5毫升含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。加入30微升浓度为10毫克/毫升的溶菌酶，在室温下孵育20分钟，然后按照所用仪器的说明进行超声处理。将样品在台式离心机中以14,000 × g离心30分钟，以沉淀不溶性物质或未裂解的细胞。

将上清液和沉淀物均保存下来，用于后续的SDS-PAGE分析。进行镍亲和纯化时，首先将100 µL镍NTA凝胶珠（预先用裂解缓冲液洗涤过）与可溶性裂解液在5至10分钟内孵育。反复倒置悬浮液数次以混匀凝胶珠。

在台式离心机中以800 × g离心样品30秒，使磁珠沉淀。随后用裂解缓冲液洗涤沉淀3至5次，以去除非特异性污染物。最后，使用含有1摩尔咪唑的裂解缓冲液从磁珠中洗脱Ruby融合蛋白。

使用分光光度计在280纳米波长下测定Ruby融合蛋白的浓度，然后取1至5微克融合蛋白上样到非变性PAGE凝胶中，以评估样品的均一性。在4摄氏度条件下，以175伏电压运行10%非变性PAGE凝胶140分钟。使用配备荧光检测功能的成像仪对非变性PAGE凝胶进行成像，观察本实验中Ruby标记的融合蛋白的迁移位置。

通过有限蛋白酶解鉴定稳定折叠的结构域：首先将95微升Ruby-Shroom SD2融合蛋白与5微升0.025的枯草杆菌蛋白酶A（Subtilisin A）混合孵育。在0、0.5、2、5、15、60和120分钟的时间点取样，每次从反应体系中取出10微升样品，使用15%丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE检测反应进程。用考马斯亮蓝染色凝胶，以判断是否存在抗蛋白酶降解的蛋白条带。综合纯化效率、天然PAGE中的迁移行为以及部分纯化的mRuby2-Shroom融合蛋白的有限蛋白酶解结果，对这些蛋白在溶液中的整体行为进行系统性评估。

通过两升规模的mRuby2-Shroom SD2培养物进行大规模表达，目标是获得5至20毫克完全纯化的样品。细胞生长完成后，以8,000 × g离心10分钟收集细胞沉淀。所得细胞沉淀可在-80 °C下保存，直至后续使用。

接下来，每克冷冻细胞沉淀物中加入约八毫升裂解缓冲液重悬沉淀。使用匀浆器裂解重悬的细胞。细胞裂解后，通过离心（30,000 ×g，30 分钟）沉淀细胞碎片。

接下来，使用10毫升预先洗涤的镍-NTA树脂对可溶性组分进行批量结合。将珠子悬浮液倒入合适的重力柱中，让未结合的蛋白质流穿，然后用40毫升裂解缓冲液洗涤树脂3至5次，接着用添加了1摩尔氯化钠的裂解缓冲液进行洗涤。最后，用40毫升含有80毫摩尔咪唑的裂解缓冲液对树脂进行终末洗涤。

用含有1摩尔咪唑的40毫升裂解缓冲液洗脱Ruby-Shroom融合蛋白。将洗脱的蛋白手动分馏为4至10个10毫升的组分。使用10% SDS-PAGE凝胶确认含有Ruby-Shroom融合蛋白的组分。

每25至50毫克融合蛋白加入一毫克TEV蛋白酶，以去除Ruby标签。接下来，使用截留分子量为6至8千道尔顿的透析管，将相应组分透析至TEV切割缓冲液中。在室温下缓慢搅拌，透析过夜。

透析后，重复镍亲和纯化步骤。Shroom-SD2 结构域应流穿进入未结合组分，而 Ruby 标签仍结合在树脂上。使用离心浓缩器将洗脱峰组分浓缩至约 10 毫克/毫升，随后进行凝胶过滤层析，并通过 12% SDS-PAGE 凝胶分析洗脱峰组分。

合并洗脱峰组分后，将溶液透析至结晶缓冲液中，然后在结晶前将透析后的蛋白质浓缩至10毫克每毫升。使用24孔坐滴结晶板，通过筛选少量12种条件的组合，确定结晶实验的最佳蛋白质浓度。采用蒸汽扩散法进行结晶实验。

首先，将12种条件下的每种溶液各500微升分别移液至不同的孔中。在每个基座上，制备包含一微升孔溶液和一微升蛋白质样品的液滴。迅速用透明胶带密封板，然后将板转移至无振动且温度可控的适宜环境中。

在接下来的三天内，使用显微镜以最高100倍的放大倍数观察各孔板中的液滴。在三天期满后，对每个液滴进行评分，判断其是否无沉淀、轻度沉淀、重度沉淀或晶体形成。合适的蛋白质浓度条件下，重沉淀的数量不应超过六个。

根据测定的蛋白浓度，筛选一系列市售的结晶筛选试剂盒。使用液体处理仪或结晶机器人可显著加快该过程，同时减少液滴操作中的误差。该方法所需蛋白量更少，使用户能够利用同一样品筛选更多条件。

通过使用24孔筛板系统地改变结晶液滴中的每个变量，优化从广谱筛选中确定的初始条件，方法与之前相同。有限蛋白水解用于鉴定蛋白中可能具有柔性或更易被蛋白酶接近的区域。图中显示了一个对蛋白水解敏感的SD2结构域的降解模式，以及另一个非常稳定的结构域的降解模式。

在Ruby融合蛋白的背景下进行了有限蛋白水解。在此情况下，正如预期，Ruby与SD2结构域之间的连接序列被迅速切割，但产生的Ruby和SD2片段仍保持高度稳定。通过非变性PAGE分析可快速鉴定出适合结晶的候选样品。

在非变性PAGE凝胶上运行了四种含有不同蛋白片段的Shroom-Rock复合物。其中包含Rock 834至913的复合物表现最佳，易于结晶；而其他复合物仅在发生降解时才能结晶，或完全无法结晶。观看本视频后，您应能充分理解如何为您的大型卷曲螺旋蛋白设计一系列潜在的结构域边界，并如何利用Ruby系统快速高效地筛选出最适合结晶的候选蛋白。

尽管晶体学仍然是一项耗时的工作，但使用该技术可以通过简单的检测方法筛选出适合结晶的蛋白质，排除表现不佳的候选蛋白，从而让您将更多时间集中在成功几率更高的候选蛋白上。在尝试该实验流程时，重要的是要记住，在选择可能的结构域边界时，应尽可能包含充分的信息。在应用此方法时，针对不同蛋白质所选择的信息可能会有所不同。

如果可能，应进行其他方法检测，例如基于细胞的检测或生化分析，以确保所研究的蛋白质片段仍保留目标生物学功能。尽管本方法主要针对卷曲螺旋蛋白，但其整体框架可轻松适用于几乎任何蛋白质。请注意，使用某些仪器和生物试剂可能存在危险，在进行本实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套或使用护目镜。