细胞分裂与扩张的运动学分析：量化生长的细胞基础及发育区域取样 Zea mays 叶片

本分析的总体目标是确定玉米叶片生长的细胞学基础，并利用这些数据通过发育阶段特异性的取样策略来研究分子水平的生长调控机制。该方法有助于回答植物发育生物学中的一个关键问题：细胞分裂与细胞扩张如何共同作用，导致器官整体生长的差异？

该方法可用于研究和空间定位整个植物器官生长过程中涉及的生化分子与生理过程。尽管该系统可为玉米叶片生长提供深入见解，但该技术也可应用于其他系统，包括其他禾本科物种及器官。

这些方法的可视化演示至关重要。在收获、样品双消融和测量步骤中，若无演示则难以操作。演示该实验流程的人员为 Katrien Sprangers 和 Viktoriya Avramova。

我实验室的两名博士生。为了对单子叶植物叶片生长进行完整的居间伸长分析，在生长室的受控条件下，每种处理和基因型至少培养15株植物。当目标叶片出现时，每天使用直尺测量叶片长度，即从土壤到叶片顶端的长度，直至叶片完全展开为止。

在目标发育阶段，从至少五株有代表性的植株上尽可能靠近根部切下地上部分，以保持分生组织区域完整。然后，从最外层叶片开始，逐个轻轻展开所有叶片，直至目标叶片。根据需要，可从基部多切除几毫米以分离叶片。

接下来，去除叶尖以及目标叶片所包裹的小叶，并从叶片基部一侧的中脉开始，截取一段三厘米长的叶片片段。关键是要在叶片与茎连接处准确切割，若切割位置过高，会导致对分生组织大小的低估。

将该节段置于装有体积比为3:1的无水乙醇-冰醋酸溶液的1.5毫升离心管中，在4°C条件下保存24小时至数月。从静脉的另一端，自基部切取一段11厘米长的节段，将其放入装有无水乙醇的15毫升离心管中，在4°C条件下至少保存6小时以去除色素。在4°C下用无水乙醇再次处理24小时后，将乙醇替换为纯乳酸，并在4°C下继续保存24小时，或保存至进一步分析前。

为测量分生组织，首先将三厘米长的叶片片段转移至新配制的洗涤缓冲液中，孵育20分钟。孵育结束后，将片段转移至含有DAPI染色液的容器中，在冰上避光染色2至5分钟。随后，迅速将组织置于载玻片上，并用盖玻片覆盖该片段。

在显微镜下使用紫外荧光确认表皮细胞的荧光情况。然后，将样品置于新的载玻片上的一滴清洗缓冲液中，并加盖新的盖玻片。使用20倍放大倍数，将样本重新放回显微镜下，逐区扫描样品以寻找增殖性有丝分裂相。

避免发育中单眼发生任何形式的有丝分裂，然后确定最远端有丝分裂相的位置。使用图像分析软件程序，测量图像框架的全长。本示例中为 645 微米。

然后计数从最远端的有丝分裂相到叶基部覆盖整个分生组织长度所需的帧数，并将该数值乘以单帧的长度，以获得完整的分生组织长度。为了获得细胞长度分布图，将11厘米长的组织段从乳酸中取出，移至实验台，用解剖刀将组织切成10个1厘米长的片段。将得到的叶段依次置于同一载玻片上，并滴加少量乳酸。

将所有切片统一朝向放置，然后将载玻片转移至配备微分干涉差显微镜的显微镜下。从靠近叶片基部的区段开始，使用合适的图像分析软件，直接测量至少20个重复的表皮细胞及其紧邻气孔列的细胞列长度，以确保沿各区段等间距位置 consistently 选择相同类型的细胞。

在叶片上进行测量时，注意记录每个测量点的相应位置。然后使用 R 脚本中实现的局部多项式平滑方法（该脚本作为补充文件一提供）计算沿叶片轴每毫米的平均细胞长度。注意避免过度平滑。

平滑处理应去除细胞数据中的噪声，但不影响曲线的整体形状。此处展示了充分浇水植株与遭受干旱胁迫植株在叶片生长方面的比较。对照植株的最终叶片长度比干旱胁迫植株低40%，这是由于其叶片伸长速率较低所致。

由于细胞生成减少，干旱胁迫植株的叶片伸长速率比充分供水的对照植株低73%。而细胞生成减少主要归因于细胞分裂速率的降低。运动学分析可提供叶片生长区位置的图谱，从而能够以亚区域分辨率为分子和生物化学分析进行取样。

例如，在充分供水对照条件和干旱条件下，对玉米叶片生长区沿纵轴进行 MDA 定量分析，结果表明，在水分胁迫条件下，该脂质分解产物在整个生长区显著增加。由于干旱导致叶片缩短，在本实验中，对照组与胁迫组植株的发育区并不对应。然而，通过细胞长度分布曲线，可以确定各发育区的长度，从而实现对不同发育区内 MDA 水平的比较。

一旦掌握，若操作得当，单个样品可在四小时内完成处理。在进行此操作时，重要的是要注意在收获过程中保持分生组织的完整性。在此步骤完成后，可进一步应用其他技术，例如测定分子与生化参数，以研究其在生长调控中的作用。

观看本视频后，您应能够充分理解如何定量分析生长中玉米叶片的细胞分裂和细胞扩展，确定不同生长区域的大小，并相应地解读分子与生化数据。请注意，使用乳酸、乙酸和EDTA可能存在危险，因此在进行该实验操作时，必须采取预防措施，例如佩戴手套，并在每次使用后清洁显微镜的载物台。