细胞分裂和扩张的运动学分析:量化增长和采样产业开发区的细胞学基础玉米叶
December 2nd, 2016
量化细胞分裂和扩增对于理解全植物生长至关重要。在这里，我们提出了一种方案来计算决定玉米叶片生长速率的细胞参数，并强调了这些数据的使用，通过指导发育阶段特异性采样策略来研究分子生长调节机制。
该分析的总体目标是确定玉米叶片生长的细胞基础，并使用这些数据通过执行发育、阶段特异性采样策略来研究分子生长调节机制。这种方法可以帮助解决植物发育生物学中的一个关键问题。细胞分裂和细胞扩增如何导致整个器官生长的差异？
这种方法允许对生化分子和生理过程进行研究和空间映射，这些过程是整个植物器官生长的基础。虽然该系统可以提供对玉米叶片生长的见解，但该技术可用于其他系统。包括其他草种和器官。
这些方法的可视化演示至关重要。在收获时，如果没有这种演示，就很难进行样品分化和测量步骤。演示该程序的是 Katrien Sprangers 和 Viktoriya Avramova。
我实验室的两名博士生。为了对单子叶植物的叶子生长进行全面的化学分析，在生长室的受控条件下，每种处理和基因型至少种植 15 株植物。当出现感兴趣的叶子时，每天用尺子测量叶子的长度，即从土壤到叶尖的长度，直到叶子完全展开。
在感兴趣的发育阶段，从至少五种代表性植物上切下植物的地上部分，尽可能靠近根部，以保持分生组织区域完整。然后，从外层叶子开始，轻轻地将所有叶子一片一片地展开，直到感兴趣的叶子。根据需要从底座上去除几毫米以分离叶子。
接下来，去除顶端和被感兴趣的叶子包围的小叶子，并从叶子上切下三厘米的一段，从中脉一侧的基部开始。将叶子剪在与茎相连的地方至关重要。由于切割得太高，会导致对分生组织的大小低估。
将片段储存在 1.5 毫升试管中，其中装有三个二一体积的无水乙醇乙酸溶液，在 4 摄氏度下保存 24 小时至数月。从静脉的另一侧，从底部切下 11 厘米的段，并将该段储存在装满无水乙醇的 15 毫升管中，在 4 摄氏度下至少保存 6 小时以去除色素。在 4 摄氏度的无水乙醇中第二次 24 小时后，用纯乳酸代替乙醇，并将片段在 4 摄氏度下再储存 24 小时，或直到进一步分析。
要测量分生组织，首先将 3 厘米的叶段转移到新鲜制备的冲洗缓冲液中 20 分钟。孵育结束时，将片段转移到装有 Dapi 染色溶液的容器中，在黑暗中的冰上放置 2 至 5 分钟。然后，将组织快速安装到显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖该片段。
使用紫外线荧光在显微镜下确认表皮细胞的荧光。然后，将样品滴入一滴冲洗缓冲液中，放在带有新玻璃盖的新显微镜载玻片上。使用 20 倍放大倍率，将片段返回显微镜，并滚动样品以定位增殖性有丝分裂象。
避免发育中的茎干的任何形成性细胞分裂，然后确定最远端有丝分裂象的位置。使用和图像分析软件程序，测量图像帧的全长。在本例中为 645 微米。
然后计算从最远端有丝分裂象到叶基部覆盖整个分生组织长度的帧数，并将该数字乘以一帧的长度以获得完整的分生组织长度。为了获得细胞长度曲线，将 11 厘米的段从乳酸转移到工作台上，然后用手术刀将组织切成 10 个 1 厘米的段。将所得叶段安装在单个显微镜载玻片上，并滴一小滴乳酸。
将所有部件的同一面朝上放置。然后，将载玻片转移到配备有微分干涉对比光学元件的显微镜下。从最靠近叶基的片段开始，使用适当的图像分析软件程序测量至少 20 个复制表皮细胞的长度和直接与茎文件相邻的文件，以确保在沿每个片段的等距位置一致选择相同的细胞类型。
采取 are 为整个叶子的每个测量向下滚动相应的位置。然后使用在 R 脚本中实现的局部多项式平滑过程（可用作补充文件 1）确定沿叶轴每毫米的平均单元长度。小心不要过度平滑。
平滑应去除单元格数据中的噪声，但不会影响曲线的整体形状。在这里，显示了浇水良好的植物与遭受干旱胁迫条件下的植物在叶子生长方面的比较。由于叶片伸长率较低，对照植物的最终叶长比干旱胁迫植物的叶长低 40%。
由于细胞产量减少，受干旱胁迫的植物的叶片伸长率比浇水良好的对照低 73%。这主要是由于细胞分裂率降低引起的。运动学分析提供了叶片生长区定位图，允许以子分带分辨率进行采样，以进行分子和生化分析。
例如，在良好的浇水控制和干旱条件下，沿植物中玉米叶片生长区的 MDA 定量表明，由于蓄水条件，整个生长区脂质分解的产物显着增加。由于干旱导致叶片缩短，在本实验中，对照和胁迫植物的发育区并不对应。然而，使用细胞长度曲线，可以确定发育区的长度，从而可以比较各个区域中的 MDA 水平。
一旦掌握，如果技术执行得当，可以在 4 小时内处理单个样品。在尝试此过程时，重要的是要记住在收获过程中保持分生组织完好无损。在此程序之后，可以应用其他技术，例如分子和生化参数的测定，以研究它们参与生长调节。
观看此视频后，您应该对如何量化生长中的玉米叶片中的细胞分裂和细胞扩增、确定不同生长区的大小以及相应地解释分子和生化数据有很好的了解。不要忘记，使用乳酸和乙酸以及 EDTA 可能是危险的。因此，在执行此程序时，应始终采取预防措施，例如戴手套和使用后每个阶段清洁显微镜。
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概述
本研究提出了一种量化玉米叶片细胞分裂和扩展的协议，这对理解整株植物的生长至关重要。该方法允许通过特定发育阶段的采样策略来研究分子生长调节机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物发育生物学
- 细胞生长机制
- 玉米叶片生长
背景
- 理解细胞分裂和扩展对植物生长至关重要。
- 本研究以玉米为模型生物。
- 该方法可以应用于其他禾本科物种和植物器官。
- 获得的见解可以解决发育生物学中的关键问题。
研究目的
- 确定玉米叶片生长的细胞基础。
- 研究分子生长调节机制。
- 执行特定发育阶段的采样策略。
使用的方法
- 量化细胞分裂和扩展。
- 特定发育阶段的采样。
- 生化和生理过程的空间映射。
- 该方法的应用于各种植物系统。
主要结果
- 细胞分裂和扩展导致器官生长差异。
- 该方法提供了对生长机制的见解。
- 适用于其他禾本科物种和植物器官。
- 促进对整株植物生长动态的理解。
结论
- 该协议增强了对玉米叶片生长的理解。
- 它可以适应用于其他植物系统。
- 研究结果为植物发育生物学领域做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Kinematic analysis quantifies cell division and expansion to link molecular data with defined cellular developmental stages, enabling targeted sampling in plant systems. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying how cellular processes drive phenotypic variation. It provides a reproducible framework for aligning biochemical measurements with spatial growth zones, improving predictive confidence in target validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies cellular contributions to organ growth, enabling hypothesis testing of growth regulatory mechanisms.
- Operational Value: Defines meristem length and developmental zones using DAPI staining and DIC microscopy for precise staging.
- Predictive Value: Correlates molecular changes (e.g., MDA levels) to specific cellular developmental stages, reducing ambiguity in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative cell length profiles along the leaf axis using image analysis and local polynomial smoothing.
- Operational Value: Enables standardized sampling of epidermal cells at equally spaced positions for reproducible phenotypic screening.
- Scalability: Processes a single sample in four hours post-mastery, supporting medium-throughput applications in discovery biology.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maps developmental zones to allow zone-specific comparison of biochemical markers across conditions (e.g., well-watered vs. drought).
- Mechanistic De-risking: Isolates cellular drivers of growth differences (e.g., reduced cell division under drought) to inform target prioritization.
- Predictive Confidence: Supports data interpretation of high-spatial-resolution molecular assays by anchoring them to validated cellular stages.
Pipeline & Workflow Integration
Kinematic analysis fits within early discovery to inform lead identification by providing cellular resolution to growth phenotypes, particularly in grass species models.
- Discovery Biology: Tests hypotheses on how cell division and expansion contribute to whole-organ growth differences.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved cell length measurements to standardize compound or genotype evaluation.
- Analytics: Outputs meristem length and cell length profiles that enable statistical comparison of growth conditions.
- Translational Research: Connects molecular biomarkers (e.g., lipid peroxidation) to defined developmental zones for continuity across validation stages.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable method for growth zone mapping applicable across monocot systems and organs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by quantifying cellular basis of growth, increasing confidence in target hypotheses.
- Operational Value: Standardizes developmental staging via meristem length and cell length profiling, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Enables focused, stage-specific sampling to optimize resource use in molecular and biochemical studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by linking cellular phenotypes to molecular mechanisms, improving go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy (DIC, UV fluorescence) and image analysis for meristem and cell length measurement.
- Needs instrumentation for tissue sectioning, staining (DAPI, lactic acid), and controlled storage (ethanol-acetic acid, lactic acid solutions).
- Demands cross-team standardization of sampling protocols to ensure consistent developmental zone definition.
- Must account for tissue-specific adaptation when applying to non-monocot systems or organs with different growth zone sizes.
- Limited to emerged leaves with growth zones spanning several centimeters during steady-state growth, per protocol constraints.
