Name: 增加了恢复时间，并减少LPS管理研究迷走神经刺激机制的有限炎症反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 了解迷走神经刺激术在神经免疫学研究中的应用，通过手术干预观察其对炎症反应的调控作用，并分析胆碱能抗炎通路的细胞机制。该方法为探索神经系统与免疫系统之间的联系提供了实用技术。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由瑞典研究理事会、瑞典风湿病协会、卡罗林斯卡学院基金会、斯德哥尔摩县议会、瓦伦堡基金会以及GV 80周年研究基金会资助。作者还要感谢Hannah Aucott对稿件的校对。

所有动物实验均按照斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院当地伦理委员会批准的动物护理和使用指南进行。当地伦理委员会遵循欧盟关于动物护理的指令。
注意：与原始方案的主要区别在于术后恢复时间（6 小时） 与 1 小时）以及注射的 LPS 剂量（2 mg/kg） 与 15 mg/kg）。否则，与手术本身相关的不同设置均未改变。
1. 准备刺激用材料
<ol>
	<li>打开计算机以及连接至刺激电极的数据采集系统（图1A）。</li>
	<li>启动 Acknowledge 程序。</li>
	<li>用 1× PBS 配制浓度为 5 mg/ml 的 LPS 储存液，分装后于 -20 °C 保存。实验当天取出一份分装样品融化，并根据动物体重用 1× PBS 稀释至 0.5 mg/ml，准备约 100 µl 用于注射。</li>
</ol>
2. 麻醉动物的准备工作
<ol>
	<li>使用 C57Bl/6 小鼠。在可控气候条件下饲养，保持 12 小时光照/12 小时黑暗循环，提供标准啮齿类动物饲料，并给予饮水 随意摄取.</li>
	<li>对实验当天体重约为25 g的小鼠进行手术。 
	注意：当诱导炎症反应时，对动物的临床反应进行定期检查和观察尤为重要。通过二氧化碳实施安乐死时应避免过早进行2 如果动物状况不符合伦理标准，则需要进行吸入麻醉。</li>
	<li>设置麻醉机。
	<ol>
		<li>确保管道正确连接且无任何损坏。确保通风区域正常工作。将专用过滤器连接至异氟烷瓶，并向蒸发器中加入足量的异氟烷。</li>
		<li>打开气体供应（空气和氧气），确保气瓶内气体足以支持实验。随后可通过三通连接管将异氟烷气流导向诱导室或面罩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将三通接头转向诱导室。从饲养笼中取出一只小鼠，放入诱导室内。调节流量调节器，使氧气流速为1.0 L/min，空气流速为1.0 L/min。调节异氟烷浓度至4–5%。</li>
	<li>当达到所需的麻醉深度时，剃除手术区域的毛发，并将动物从麻醉舱转移至面罩。&#160;将三通接头转向面罩气流方向。调节流量调节器，使氧气流速为0.25 L/min，空气流速为0.25 L/min。
	<ol>
		<li>将异氟烷浓度调整至1.5 - 2.5%。在开始手术操作前，通过反射控制和呼吸频率检查麻醉深度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用胶带将小鼠的四肢固定在工作台上。确保动物的鼻部仍准确地置于面罩内。</li>
</ol>
3. 迷走神经手术与刺激
<ol>
	<li>用70%乙醇对手术区域进行消毒。</li>
	<li>使用手术刀，在颈部水平小心切开皮肤（切口长度约为1至1.5 cm）。 
	注意： 在本实验方案中，假手术动物的手术操作至此结束。事实上，已有研究表明，仅用金属器械接触神经即可在一定程度上刺激神经。因此，当使用少量LPS时，为了获得更准确的手术对照动物，应在本步骤停止手术操作。</li>
	<li>在显微镜（12.5倍物镜）辅助下，使用解剖镊子将左侧迷走神经从颈动脉中分离。首先通过去除皮肤和脂肪层定位胸锁乳突肌，然后将其牵开，以便将镊子置于神经和动脉后方。 
	注意： 下一步操作较为困难，因为神经与动脉紧密贴附。因此，很容易切断血管而导致动物死亡。然而，若能非常小心地将镊子插入神经与动脉之间，最终可实现两者的分离，从而成功分离出迷走神经。</li>
	<li>将电极（图1B）放置于迷走神经下方。针状电极较长，因此即使在刺激过程中神经发生轻微移动，仍能始终保持与电极的接触。</li>
	<li>借助注射器进行腹腔注射（i.p.）LPS（2 mg/kg）（用于细胞因子水平的检测；即，评估其下调作用）。</li>
	<li>在开始刺激前等待5分钟。</li>
	<li>在Acknowledge程序中按下启动按钮，以5 V、1 Hz的参数对迷走神经刺激5分钟。</li>
	<li>移除电极，并使用外科缝合线缝合动物伤口。</li>
	<li>在伤口处喷洒无痛屏障保护膜（NSBF），以促进愈合并预防感染。</li>
</ol>
4. 动物的恢复
<ol>
	<li>手术后，将动物移回其饲养笼中以苏醒和恢复。在红外光下保持体温，并确保持续监测动物，直至其完全恢复意识。</li>
	<li>在处死动物进行分析前，让其在笼中恢复 6 小时。 
	注意：迷走神经刺激的作用非常迅速，且已被证明具有持久效果（长达 48 小时），因此恢复时间可根据实验需求由研究者自行设定。</li>
</ol>
5. 为后续分析实施安乐死
<ol>
	<li>将动物放入与 CO 相连的笼子中2 给药装置</li>
	<li>将设备设置为5分钟的CO循环2 吸入</li>
	<li>安乐死后，立即采集目标器官，并直接置于干冰上冷冻，以备后续分析例如， 使用小鼠TH1/TH2 9-plex检测法测定脾脏提取物中的细胞因子水平3.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12490957">Points of control in inflammation.</a> Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).</li>
<li>Rosas Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine-synthesizing+T+cells+relay+neural+signals+in+a+vagus+nerve+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit.</a> Science. 334 (6052), 98-101 (2011).</li>
<li>Le Maître, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+vagus-mediated+immunosuppression+in+microsomal+prostaglandin+E+synthase-1+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).</li>
<li>Borovikova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagus+nerve+stimulation+attenuates+the+systemic+inflammatory+response+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin.</a> Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).</li>
<li>Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+inflammation%3A+neural+circuits+in+the+regulation+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity.</a> Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).</li>
<li>Pavlov, V. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry and immunity.</a> Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).</li>
<li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenectomy+inactivates+the+cholinergic+antiinflammatory+pathway+during+lethal+endotoxemia+and+polymicrobial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis.</a> J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).</li>
<li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2504833/">Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+alpha7+subunit+is+an+essential+regulator+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation.</a> Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).</li>
<li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+muscarinic+cholinergic+regulation+of+the+systemic+inflammatory+response+during+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).</li>
<li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+acetylcholinesterase+activity+controls+systemic+cytokine+levels+through+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway.</a> Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).</li>
<li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanomeline+suppresses+excessive+pro-inflammatory+cytokine+responses+through+neural+signal-mediated+pathways+and+improves+survival+in+lethal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation.</a> Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).</li>
<li>Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBellinger%2C+DL+%22Psychoneuroimmunology%22">Psychoneuroimmunology</a>. Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. 55, Academic. San Diego. 55-112 (2001).</li>
<li>Andersson, U., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+rheumatoid+arthritis%3A+treating+inflammation+with+computerized+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebrum%22%5BJournal%5D)">A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation.</a> Cerebrum. 2012, 3(2012).</li>
<li>Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12789214">Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).</li>
<li>Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+heterogeneity%3A+implications+for+homeostasis+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis.</a> Blood. , (2016).</li>
<li>Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vagal+innervation+of+the+gut+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The vagal innervation of the gut and immune homeostasis.</a> Gut. 62, 1214-1222 (2013).</li>
<li>Pereira, M. R., Leite, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+nerve+in+the+inflammatory+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex.</a> J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).</li>
<li>Levine, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurostimulation+of+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway+ameliorates+disease+in+rat+collagen-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis.</a> PLoS One. 9 (8), e104530(2014).</li>
<li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+vagus+nerve+stimulation+reduces+serum+high+mobility+group+box+1+levels+and+improves+survival+in+murine+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis.</a> Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).</li>
<li>Yuan, H., Silberstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagus+nerve+and+vagus+nerve+stimulation%2C+a+comprehensive+review%3A+Part+II%5BTitle%5D)+AND+%22Headache%22%5BJournal%5D)">Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II.</a> Headache. 56 (2), 259-266 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

自21世纪初被发现以来，胆碱能抗炎通路（CAP）的机制已得到深入研究。目前我们对该通路已有较为清晰的认识，特别是其靶器官——脾脏，在其中去甲肾上腺素（NE）、记忆性T细胞、乙酰胆碱（Ach）和巨噬细胞协同作用，高效地抑制炎症介质的释放2。我们最近还发表了关于小鼠功能性前列腺素系统重要性的研究数据，尤其是PGE2，它显然是CAP激活后脾脏中释放乙酰胆碱所必需的关键组分3。
这种实验技术称为迷走神经刺激，可在实验室中轻松实施，但必须遵守有关动物和手术操作的一些重要规程。我们采用正弦波刺激信号，这种信号应为&#34;电荷平衡&#34;刺激，以避免在神经中积聚可能造成神经损伤的电荷（与单相刺激相对）。在刺激神经时，无法将传入信号与传出信号区分开来，而这一点只能通过迷走神经切断实验在其他目的下实现。已知实验中使用的刺激持续时间和频率会影响炎症刺激后的细胞因子释放，但不会影响健康对照组的心率，也不会产生明显副作用。
首先，...

先天免疫为多种生物提供了抵御感染和疾病的即时第一道防线。它不仅启动初级免疫反应以清除威胁，还在激活和指导适应性免疫方面发挥关键作用，后者以病原体特异性的方式执行次级免疫反应。炎症由大量细胞因子和趋化因子协调调控，这些因子能够募集其他免疫细胞至感染部位，并引发炎症的典型体征，如红肿、肿胀、疼痛、功能丧失和发热。炎症的持续时间和强度取决于多种因素，而及时消退炎症并恢复稳态是避免慢性炎症性疾病发生的关键步骤。神经科学与免疫学领域的最新进展揭示了若干具有巨大治疗潜力的神经机制，可用于调控中枢神经系统及外周组织的炎症反应。其中一种机制是胆碱能抗炎通路（CAP），也称为炎症反射，该通路由自主神经系统驱动4,5。
目前认为，炎症介质可激活感觉神经，并将炎症状态信号传递至中枢神经系统。随后，通过传出迷走神经启动反射性反应。一项关于胆碱能抗炎通路（CAP）解剖学细节的深入研究揭示了一种由迷走神经和脾神经分别组成的副交感-交感神经模型6。在CAP中，被激活的胆碱能传出迷走神经终止于腹腔-肠系膜神经节，进而通过一种尚未明确的机制激活肾上腺素能脾神经。已知被激活的脾神经支配脾脏白髓、边缘区和红髓中靠近免疫细胞的区域，脾脏是CAP的主要且必需的器官7,8。脾神经末梢释放的去甲肾上腺素（NE）与脾T淋巴细胞表面表达的β2肾上腺素能受体结合，诱导胆碱乙酰转移酶（ChAT）介导的乙酰胆碱（ACh）释放；而乙酰胆碱继而激活巨噬细胞上的α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nACh），从而抑制细胞因子的产生和炎症反应2。因此，目前明确神经系统能够调控外周组织的炎症反应，并恢复局部免疫稳态。
顾名思义，乙酰胆碱（ACh）系统在这一神经-免疫调节通路的功能中具有核心重要性。有趣的是，迷走神经抗炎通路（CAP）的激活机制在外周和中枢神经系统中似乎有所不同。尽管脾脏中烟碱型受体（α7nAChR）的重要性早已被证实9，但毒蕈碱型受体（mAChR）则是该通路中枢激活所必需的10,11。最近的研究发现，外周给予一种具有中枢作用的M1型毒蕈碱受体激动剂，可在致死性小鼠内毒素血症期间显著抑制血清和脾脏中肿瘤坏死因子α（TNFα）的水平，而这一作用依赖于完整的迷走神经和脾神经信号传导12。我们近期还发现，缺乏前列腺素E2（PGE2）的小鼠无法对迷走神经刺激产生反应，也不能下调脂多糖（LPS）诱导的血清和脾脏细胞因子释放3。因此，CAP可能还受到除主要ACh通路以外的其他系统的调控。
迷走神经因其在体内走行蜿蜒而得名，支配包括肝脏、肺、脾脏、肾脏和肠道在内的主要器官13。鉴于其广泛的神经支配以及迷走神经强大的免疫抑制作用，胆碱能抗炎通路（CAP）的治疗潜力可能涵盖多种炎症性疾病。迷走神经可通过电刺激（或机械刺激）进行激活，并可精确调控电压和频率，与传统治疗方法不同，该方法无需向体内添加药物。目前已有针对风湿病患者的临床试验正在进行，以评估迷走神经刺激（VNS）在治疗慢性炎症中的临床意义14。总体而言，神经-免疫之间的相互作用及其对炎症的调控机制正在被深入研究，这将为传统疗法提供一种潜在的替代治疗策略。因此，分析迷走神经刺激对不同支配器官的影响，以及在慢性炎症动物模型中对其潜在治疗作用的表征，必将为发现新的潜在治疗靶点提供重要线索和希望。
Tracey 及其同事最初开发的方法4由于脂多糖（LPS）致死剂量引起的炎症反应过度激活，以及冷大气等离子体（CAP）激活与检测读数之间的时间间隔过短，无法直接应用于我们的研究领域。在本文中，我们将介绍对原始方案所做的修改，比较两种不同方法在细胞因子水平上的差异，并揭示在靶器官（脾脏）中出现的一种新的、相反的观察结果。

<table><tbody><tr><td>计算机</td><td>Toshiba</td><td>-</td><td>任何计算机实际上均可兼容</td></tr><tr><td>MP-150 数据采集系统</td><td>Biopac Systems</td><td>MP150WSW</td><td></td></tr><tr><td>Acknowledge 软件</td><td>Biopac Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 C57Bl/6</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Simtec Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>医用氧气瓶</td><td>AGA</td><td>107563</td><td></td></tr><tr><td>医用空气瓶&amp;nbsp;</td><td>AGA</td><td>108639</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 Vetflurane (1,000 mg/g)</td><td>Virbac</td><td>137317</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Merck Millipore</td><td>1024060080</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>使用时稀释10倍</td></tr><tr><td>注射器 (1 ml)</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>23 G 针头</td><td>KD-FINE</td><td>900284</td><td>0.6 x 30 mm (蓝色)</td></tr><tr><td>显微解剖镊（弯型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>4-0 外科缝合线</td><td>Ethicon</td><td>G667G</td><td></td></tr><tr><td>安乐死装置</td><td>Euthanex Smartbox</td><td>EA-32000</td><td></td></tr><tr><td>Cavilon 无刺激屏障膜</td><td>3M Health Care</td><td>3346N</td><td></td></tr><tr><td>TH1/TH2 9-重检测，超敏试剂盒</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15013C-1</td><td></td></tr><tr><td>刺激电极装置</td><td>Biopac Systems</td><td>STIMSOC</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Isis 剃毛器</td><td>Agnthos</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>R70</td><td></td><td></td><td>来自瑞典斯德哥尔摩 Lantmannen 的啮齿类动物饲料</td></tr></tbody></table>

延长恢复时间并减少脂多糖给药以研究迷走神经刺激在有限炎症反应中的作用机制

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

炎症是机体对感染和组织损伤的局部反应，由活化的巨噬细胞、单核细胞及其他免疫细胞介导，这些细胞会释放细胞因子和其他炎症介质。长期以来，体液和细胞机制在调节免疫反应中的作用已被广泛研究，但免疫学与神经科学领域的最新进展揭示了具有潜在治疗价值的特定神经机制。所谓胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP）已被证实能够强有力地调控先天免疫反应和炎症过程。20世纪初，Tracey 及其合作者开发了一种刺激迷走神经的技术，可模拟该通路的作用。该方法基于低电压、低频率的迷走神经电刺激，旨在避免过度刺激可能引起的副作用，例如心率变异性失调。目前已有商用的电刺激装置，使得在实验室中建立该方法变得简便可行。本研究旨在探讨前列腺素在 CAP 中可能发挥的作用。然而，基于前期尝试，我们未能成功应用原始方案，因为所诱导的炎症反应强度过高，或不符合酶代谢特性的要求。原始手术方案的各项参数基本保持不变，但针对炎症诱导条件以及处死前的时间点进行了优化，以更好地满足本研究的需求。即， 以研究CAP在更局限的炎症反应中的作用。 
本文所展示的原始方案改良版本，增加了迷走神经刺激与分析之间的时间间隔，从而降低了炎症反应的诱导水平。此外，在减少注射脂多糖（LPS）剂量的同时，我们还发现了关于脾脏机制特性的新现象。

手术后延长观察时间及降低LPS剂量对TNFα和白细胞介素-1β（IL-1β）水平的影响
如先前所示，采用原始方案，迷走神经刺激（VNS）降低了TNFα水平（假手术组为169.3 ± 24.9 pg/mg，VNS组为39.7 ± 10.8 pg/mg，p < 0.05）。然而，当使用改良方案时，VNS组与假手术组之间的TNFα水平差异无统计学意义（114.2 ± 17.2 pg/mg vs. 96.6 ± 15.4 pg/mg，p = 0.45）。 &lt; 0.001）以及 IL-1β（假手术组为 360.0 ± 40.21 pg/mg，迷走神经刺激组为 191.7 ± 27.2 pg/mg，p &lt; 0.01）在腹腔注射LPS（15 mg/kg）后脾脏中的变化（图 2A）。在将分析时间从1小时调整为6小时，并将LPS剂量从15 mg/kg降低至2 mg/kg后，我们仅观察到VNS对TNFα的影响（假手术组为13.67 ...

迷走神经刺激已被证实具有显著降低外周炎症的效果。本文介绍了一种改良的迷走神经刺激方案，可用于进一步研究胆碱能抗炎机制在局限性炎症反应中的作用。

炎症是机体对感染和组织损伤的局部反应，由活化的巨噬细胞、单核细胞及其他免疫细胞介导，这些细胞会释放……

该手术干预的总体目标是观察迷走神经刺激在炎症状态下的作用，以分析并理解所谓胆碱能抗炎通路中涉及的不同机制和细胞。该方法由费因斯坦研究所的凯文·特雷西（Kevin Tracey）实验室开发。该方法有助于回答神经免疫学领域的关键问题。随着近期研究进展确立了神经系统与免疫系统之间的密切联系，该技术的主要优势在于其可在实验室中轻松建立。但在动物护理和手术方案方面必须遵循重要的规则。迷走神经在全身的走行路径以及其在多种动物模型中下调信息的能力，表明刺激迷走神经可能对治疗多种炎症性疾病具有应用价值。通常，初次接触该技术的研究人员在显微镜下观察时，难以识别并分离迷走神经与颈动脉。然而，尽管在初期操作较为困难，但随着时间推移和不断练习，操作会变得越来越容易。首先打开计算机以及连接刺激电极的数据采集系统，然后启动数据采集与分析软件。随后取5毫克/毫升的脂多糖（LPS）溶液一份，用生理盐水稀释至0.5毫克/毫升。将一只25克重的小鼠置于麻醉诱导舱内进行麻醉。当达到所需麻醉深度后，将动物从诱导舱转移至麻醉面罩下。转动三通连接管以向面罩供气，并调节流量调节器。在开始手术操作前，通过观察翻正反射消失以及呼吸频率稳定在每分钟约100次来确认小鼠已达到外科麻醉深度。一旦小鼠被充分麻醉，使用胶带将小鼠的四肢固定在工作台上。确保动物的鼻部仍准确地位于面罩内。根据批准的操作规程对术区进行适当消毒。随后，在颈部水平的皮肤上做一个1至1.5厘米的切口，将体视显微镜调节至12.5×物镜以观察手术区域。使用镊子去除皮肤和脂肪层，以定位胸锁乳突肌。牵开胸锁乳突肌，并将镊子置于左侧迷走神经和颈动脉后方。小心地将镊子插入神经与动脉之间，以分离迷走神经与颈动脉。这是该操作中的关键步骤，因为神经与动脉彼此靠近，很容易切断血管而导致动物死亡。然而，通过非常小心地将镊子置于神经与动脉之间，可使二者逐渐分离，从而能够分离出迷走神经。现在，将电极放置在迷走神经下方。由于针电极较长，即使神经发生轻微移动，也始终会与电极保持接触。接下来，进行腹腔注射LPS，等待五分钟后再开始刺激。五分钟后，在采集软件中按下启动按钮，以5伏特和1赫兹的参数刺激迷走神经，持续五分钟。刺激期结束后，移除电极，然后使用外科缝合线缝合动物的伤口。在伤口处喷洒无刺激性屏障膜，以促进愈合并防止感染。最后，将动物转移至清洁的笼子中，并在其恢复完全意识的过程中进行监测。以下图像展示了在迷走神经刺激后，降低LPS浓度并延长处死前潜伏期对TNF alpha和IL-1 beta水平的影响。可以看出，与假手术对照组相比，原始实验方案显著降低了TNF alpha和IL-1 beta的水平。本视频中展示的方案可显著降低TNF alpha水平，但对IL-1 beta水平无显著影响。如图所示，不注射LPS的情况下，六小时的恢复期不会影响TNF alpha或IL-1 bet

increased-recovery-time-decreased-lps-administration-to-study-vagus

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

增加了恢复时间，并减少LPS管理研究迷走神经刺激机制的有限炎症反应

迷走神经刺激（VNS）已成为一种诱导前脑靶向突触可塑性以调节多种行为的工具。本方案描述了如何实施迷走神经刺激以促进恐惧消退记忆的巩固。...

迷走神经刺激作为诱导与消退学习相关通路可塑性的工具

本文介绍了一种采用多列电极进行脊髓刺激的方法，用于治疗腰椎手术失败综合征患者的神经病理性下背痛。...

使用多列电极脊髓刺激治疗腰椎手术失败综合征患者的腰痛

迷走神经刺激（VNS）已被证明可作为难治性抑郁症（TRD）的辅助治疗手段，具有抗抑郁和抗自杀效应，并能改善生活质量。本方案提供了管理与调节迷走神经刺激器的逐步操作指南，以实现对难治性抑郁症的高效治疗。...

迷走神经刺激作为难治性抑郁症治疗中的辅助性神经刺激工具

本文描述了经皮耳迷走神经刺激（taVNS）技术的方法学概述、潜在作用靶点以及在人耳上的正确实施方法。...

经皮耳迷走神经刺激（taVNS）的实验室操作：技术、靶向定位与注意事项

本文介绍了一种用于体内连续记录诱发性和自发性肌电位的可植入系统的制造方案。该系统应用于喉部肌肉在神经损伤后重新神经支配过程的研究。...

一种用于慢性活体肌电图记录的可植入系统

目前用于构建可长期植入小型啮齿类动物的外周神经袖状电极的方法通常需要专用设备和/或经过高度培训的专业人员。在本方案中，我们展示了一种简单且低成本的可长期植入袖状电极的制备方法，并验证了其在大鼠迷走神经刺激（VNS）中的有效性。...

大鼠慢性植入外周神经刺激电极的制备

这种改良手术是一种简化的用于小鼠或大鼠的保留神经损伤模型的方法，仅需一次结扎和一次切割即可同时损伤腓总神经和腓肠神经。...

小鼠神经病理性疼痛的改良部分神经结扎手术模型

本方案描述了在大鼠腹部迷走神经上植入电极阵列的外科手术技术，以及利用植入装置进行长期电生理记录和刺激的方法。...

清醒大鼠腹部迷走神经刺激与记录研究的植入手术

在本研究中，采用一种非侵入性气管内滴注技术，通过基本的喉镜确保将脂多糖（LPS）精确递送至肺部，从而在大鼠中建立急性肺损伤（ALI）模型。LPS被滴注入气管 通过 使用喉镜插入气管插管。在多个时间点评估肺损伤程度。...

非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

小鼠鼻咽部的定植 肺炎链球菌 并描述了随后对黏附或募集细胞的提取方法。该技术包括冲洗鼻咽部并通过鼻孔收集冲洗液，适用于多种检测指标，包括差异细胞计数和mRNA表达分析。 原位.

鼻腔定植Streptococcus pneumoniae期间炎症反应的表征

了解迷走神经刺激术在神经免疫学研究中的应用，通过手术干预观察其对炎症反应的调控作用，并分析胆碱能抗炎通路的细胞机制。该方法为探索神经系统与免疫系统之间的联系提供了实用技术。

延长恢复时间并减少脂多糖给药以研究迷走神经刺激在有限炎症反应中的作用机制

探索更多视频